Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक लचीला, कम एक खुले क्षेत्र गतिविधि परख में माउस ambulation को मापने के लिए लागत प्रणाली । हम बताते है कि इस प्रणाली के आधार पर एक 6 मिनट ambulation परख mdx चूहों में स्वैच्छिक आंदोलन में कमी का पता लगाता है, और सही ढंग से इन जानवरों के एक मांसपेशी विशेष बचाव में सुधार भेद ।
Abstract
मांसपेशी dystrophy के उपचार में कार्यात्मक परिणामों को मापने के लिए एक नैदानिक परीक्षण का एक आवश्यक पहलू है । माउस मॉडल में स्वैच्छिक ambulation का आकलन एक गैर इनवेसिव और प्रतिलिपि गतिविधि परख है कि सीधे रोगी ambulation के उपायों के अनुरूप है ऐसे 6 मिनट की सैर की परीक्षा और संबंधित गतिशीलता स्कोर के रूप में है । माउस ambulation गति और दूरी के परीक्षण के लिए कई आम तरीके खुले मैदान परीक्षण, जहां एक क्षेत्र के भीतर एक जानवर मुक्त आंदोलन समय के साथ मापा जाता है पर आधारित हैं । इस दृष्टिकोण के लिए एक प्रमुख पहलू यह है कि वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर और उच्च संकल्प गति ट्रैकिंग के लिए उपकरण महंगा है और परीक्षण के लिए विशेष सुविधाओं के लिए चूहों के हस्तांतरण की आवश्यकता हो सकती है । यहां, हम एक कम लागत, वीडियो-माउस ambulation है कि स्वतंत्र और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल मापने के लिए आधारित प्रणाली का वर्णन । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम यह प्रदर्शित करते है कि Duchenne पेशी dystrophy (DMD) के लिए dystrophin-null mdx माउस मॉडल में स्वैच्छिक ambulation को वाइल्ड-टाइप माउस गतिविधि के सापेक्ष कम किया गया है । mdx चूहों में utrophin transgene व्यक्त, इन गतिविधि घाटे नहीं मनाया जाता है और कुल दूरी कूच जंगली प्रकार चूहों से अलग है । इस विधि अपक्षयी विकृति के साथ जुड़े स्वैच्छिक ambulation में परिवर्तन को मापने के लिए प्रभावी है, और एक बहुमुखी मंच है कि आसानी से विविध अनुसंधान सेटिंग्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता प्रदान करता है ।
Introduction
मांसपेशी समारोह के विश्वसनीय और प्रतिलिपि माप DMD के लिए संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । DMD एक आनुवंशिक dystrophin जीन में उत्परिवर्तनों के कारण विकार, प्रगतिशील मांसपेशियों की कमजोरी, ambulation के नुकसान, और अंततः cardiorespiratory विफलता के लिए अग्रणी है । DMD का सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जानवर मॉडल dystrophin-null mdx माउस है । कार्यात्मक परीक्षणों की एक बैटरी के रूप में अच्छी तरह से अन्य dystrophies और myopathies के समान पशु मॉडल में mdx माउस में रोग प्रगति के मूल्यांकन के लिए नियमित परख के रूप में उभरा है । आमतौर पर वीवो में इस्तेमाल किया forelimb पकड़ शक्ति, तार हैंगिंग समय, rotarod अधिकतम, समय चल ट्रेडमिल के दौरान थकान, और मोटर गतिविधि ट्रैकिंग की माप शामिल हैं । इन परीक्षणों को मानकीकृत करने के लिए क्षेत्र में पर्याप्त प्रयास किए गए हैं, जो कि नैदानिक अध्ययनों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लक्ष्य के साथ और चूहों१,२में परीक्षित चिकित्सीय चिकित्सा की शोधों क्षमता को बढ़ाते हैं.
नैदानिक परीक्षण की एक महत्वपूर्ण श्रेणी स्वैच्छिक आंदोलन, एक पैरामीटर है कि अक्सर पेशी dystrophy के murine मॉडल में बदल जाता है की माप है । यह आमतौर पर खुला क्षेत्र गतिविधि की निगरानी के आधार पर परख द्वारा परीक्षण किया है, और या तो क्षैतिज का मूल्यांकन कर सकते है (घूमना) या ऊर्ध्वाधर (पीछे) आंदोलनों मिनट या घंटे के एक कोर्स पर2,3,4। कई अध्ययनों से पता चला है कि स्वैच्छिक आंदोलन को mdx चूहों में बदल दिया है, विशेष रूप से व्यायाम के बाद, और इन माप के लिए दवा उपचार और रोग प्रगति के प्रति संवेदनशील होना दिखाया गया है । इन परख प्रदर्शन में एक प्रमुख सीमा विशेष, उच्च लागत वाले उपकरणों के लिए की जरूरत है । यहाँ, आसानी से उपलब्ध संसाधनों का उपयोग माउस ambulation पटरियों कि एक कम लागत विधि प्रस्तुत किया है.
6 मिनट की दूरी पर चलने के एक मीट्रिक सामांयतः Duchenne पेशी dystrophy5,6के साथ व्यक्तियों में एक नैदानिक मूल्यांकन उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया है । इस उपाय के संशोधन Duchenne के पशु मॉडलों में परिणामों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, mdx चूहों7 और गोल्डन कुत्ता पेशी dystrophy (GRMD) कुत्तों8सहित. इस अध्ययन में, हम तुरंत एक हल्के व्यायाम चुनौती के बाद 6 मिनट में स्वैच्छिक खुला क्षेत्र आंदोलन रिकॉर्ड. Ambulation दूरी तो समय के साथ क्षैतिज आंदोलन को मापने के लिए मुक्त खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना की गई थी ।
इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि जानवरों के विश्लेषण के लिए विशेष उपकरण या उच्च लागत वाले वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर की जरूरत के बिना सेटिंग्स की एक किस्म में परीक्षण किया जा सकता है । इस विश्लेषण का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि यह एक बुनियादी प्रयोगशाला की स्थापना में ले जाने या चूहों vivarium से बाहर एक विशेष कोर सुविधा के हस्तांतरण की जरूरत के बिना किया जा सकता है । वीडियो ट्रैकिंग प्रोटोकॉल यहां वर्णित अच्छी तरह से अपेक्षाकृत कम समय पर ambulation के आकलन के लिए अनुकूल है-अवधि और जंगली प्रकार और mdx चूहों के बीच गतिविधि मतभेदों का पता लगाने, के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक बचाव में कार्यात्मक सुधार प्रकट कर सकते है DMD का मॉडल ।
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Protocol
यहां वर्णित तरीकों संस्थागत पशु देखभाल और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । वाइल्ड-टाइप (C57BL/6J) और mdx चूहों (C57BL/10ScSn बैकग्राउंड) को एक कमर्शियल सोर्स से खरीदा गया था । mdx: utrophin-टीजी चूहों जेंस Ervasti से एक उपहार थे, Kay Davies से अनुमति के साथ, और mdx पृष्ठभूमि पर बनाए रखा गया. 6 महीने की उम्र में पुरुष चूहों पर Ambulation की परख की गई । चूहों Terasaki जीवन विज्ञान में बनाए रखा गया था Vivarium के बाद संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में स्थापित दिशा निर्देशों, लॉस एंजिल्स (अनुमोदन #2000-029-43) और इन अध्ययनों के लिए अनुमोदन द्वारा प्रदान किया गया था UCLA पशु कल्याण आश्वासन (अनुमोदन #A3196-01) ।
1. चैंबर की तैयारी
- दिन के एक सुसंगत समय में एक शांत, तापमान नियंत्रित कमरे में डेटा संग्रह प्रदर्शन9। परीक्षण किया जा रहा माउस के जीनोटाइप और उपचार के लिए अंधा परीक्षण करते हैं ।
- इस विश्लेषण के लिए किसी भी खुले मैदान चैंबर प्रणाली अनुकूलन ।
नोट: इस अध्ययन में, हम एक सस्ती और आसानी से परिवहनीय रिकॉर्डिंग एक बड़े कचरा बिन से निर्माण चैंबर का उपयोग करें । खुला मैदान अखाड़ा एक पिंजरे या इसी तरह ऊंचा मंच पर सेट ट्रे है । - पूरे क्षेत्र भर में रिकॉर्ड करने के लिए चैंबर के ऊपर एक तार मेष पर कैमरा रखें ।
- प्रत्येक परीक्षण से पहले संक्रमित के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर साफ ।
2. पूर्व व्यायाम प्रोटोकॉल और डेटा संग्रह
- वैकल्पिक रूप से, तुरंत गतिविधि रिकॉर्डिंग से पहले, एक मांसपेशी सक्रियण प्रोटोकॉल के साथ प्रत्येक माउस को चुनौती ।
नोट: यह वैकल्पिक है लेकिन mdx चूहों को शामिल करने वाले प्रयोगों में अनुशंसित है ।- एक डिजिटल बल गेज की पुल बार पकड़ करने के लिए माउस की अनुमति दें और धीरे पुल बार जारी किया जाता है जब तक वापस खींच. इस कार्यविधि को पांच बार प्रति परीक्षण दोहराएं ।
- रिकॉर्ड पीक तनाव (N) प्रत्येक परीक्षण के लिए ।
नोट: ambulation परख के लिए एक व्यायाम चुनौती के रूप में सेवारत के अलावा, इस पकड़ शक्ति परख के दौरान जानवर द्वारा लागू बल एक अतिरिक्त कार्यात्मक परिणाम उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है2,10। - प्रत्येक परीक्षण के बीच आराम के 1 मिनट के साथ प्रत्येक माउस के लिए पांच कुल परीक्षणों प्रदर्शन करते हैं ।
- तुरंत पकड़ ताकत परख या अंय व्यायाम प्रोटोकॉल के बाद, गतिविधि चैंबर में माउस जगह है ।
- चैंबर के क्षेत्र में माउस के आंदोलन की वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करो । माउस को स्वतंत्र रूप से 6 मिनट के लिए तलाशने की अनुमति दें ।
- 6 मिनट में रिकॉर्डिंग बंद करो और अपने घर पिंजरे में माउस वापस ।
3. वीडियो विश्लेषण
- वैकल्पिक रूप से, फ़्रेम दर को कम करके विश्लेषण के लिए वीडियो तैयार करें. आदेश में ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए फ्रेम दर को कम करने के लिए, एक वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर में निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करें (उदा, iMovie या इसी तरह के कार्यक्रम) 2 के एक कारक द्वारा वीडियो फ्रेम दर को तबाह करने के लिए ।
नोट: लंबाई और फ्रेम दर वीडियो के आधार पर, यह विश्लेषण करने से पहले वीडियो फ्रेम दर को कम करने के लिए उपयोगी हो सकता है. इस अध्ययन में, वीडियो 30 फ्रेम/एस (6 मिनट रिकॉर्डिंग, लगभग १०,८०० फ्रेम कुल) में दर्ज किया गया था ।- सॉफ्टवेयर में वीडियो लोड ।
- ' स्पीड ' मेनू के तहत, ' गति: फास्ट ' का चयन करें और 2x करने के लिए गति निर्धारित किया है ।
- विश्लेषण ट्रैकिंग के लिए decimated वीडियो. mp4 फ़ाइल स्वरूप में निर्यात करें ।
- सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में विश्लेषण के लिए वीडियो खोलें । लाइन उपकरण का उपयोग करके वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए अंशांकन सेट करें । चैंबर के एक पक्ष के साथ एक लाइन ड्रा । लाइन पर दायां क्लिक करें और चुनें "उपाय जांचना..." सेंटीमीटर में चैंबर की ओर वास्तविक आकार दर्ज करें ।
- माउस की स्थिति के अर्द्ध स्वचालित ट्रैकिंग शुरू करने के लिए, ' हटो ' कर्सर पर क्लिक करें ।
वीडियो में प्रारंभिक फ्रेम में शुरू, ट्रैक किया जा करने के लिए बिंदु पर ठीक क्लिक करें; ट्रैकिंग बिंदु एक नीले वृत्त के साथ चिह्नित किया गया है ।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, प्रत्येक जानवर की स्थिति पूंछ के आधार अनुरेखण द्वारा ट्रैक किया गया था । - कुंजीपटल पर दायां तीर क्लिक करके फ़्रेम को उंनत करें; ट्रैकिंग बिंदु पूंछ आधार की स्थिति के आधार पर स्वचालित रूप से चलना चाहिए ।
- यदि ट्रैकिंग स्थिति किसी दिए गए फ़्रेम में रुचि के बिंदु के साथ संरेखित नहीं है, तो मैंयुअल रूप से नीले वृत्त को पूंछ के आधार पर संरेखित करें ।
नोट: वीडियो की गुणवत्ता और माउस की गति के आधार पर, ट्रैकिंग ब्याज के बिंदु के साथ संरेखण बनाए रखने के लिए उपयोगकर्ता इनपुट के चर स्तर की आवश्यकता हो सकती है । माउस के मार्ग वीडियो के पाठ्यक्रम के माध्यम से अग्रिम चाहिए ।
- यदि ट्रैकिंग स्थिति किसी दिए गए फ़्रेम में रुचि के बिंदु के साथ संरेखित नहीं है, तो मैंयुअल रूप से नीले वृत्त को पूंछ के आधार पर संरेखित करें ।
- जब पूरा वीडियो की ट्रैकिंग पूरा हो गया है, वीडियो को बचाने और ओवरले अनुरेखण । "स्प्रेडशीट में निर्यात करें" का चयन करके पता लगाएँ की स्थिति डेटा निर्यात.
4. डेटा विश्लेषण
- किसी स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में स्थिति डेटा खोलें । आंदोलन विश्लेषण सॉफ्टवेयर रिपोर्ट एक्स, वाई प्रत्येक फ्रेम में माउस के समंवय की स्थिति ।
- दूरी की गणना करने के लिए फ्रेम से कूच, निंनलिखित समीकरण का उपयोग करें (जहां एक फ्रेम में स्थिति x1, y1 और फ़्रेम दो x है2, y2):
नोट: समय के साथ संचई दूरी प्रत्येक फ्रेम के बीच कूच दूरी जोड़ने के द्वारा गणना की जा सकती है ।
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Representative Results
खुला क्षेत्र परख के रूपांतरों के लिए एक प्रभावी विधि को पेशी dystrophy के मॉडलों में रोग प्रगति परीक्षण दिखाया गया है । यहां, हम आसानी से उपलब्ध रिकॉर्डिंग उपकरण और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर (चित्र 1a-B) का उपयोग कर दो आयामी माउस आंदोलन के विश्लेषण के लिए एक बहुमुखी वीडियो ट्रैकिंग विधि का प्रदर्शन । परिणाम इसी तरह की परख से सूचना के साथ संगत, हम बताते है कि mdx चूहों एक व्यायाम प्रोटोकॉल के साथ चुनौती दी तुरंत परीक्षण से पहले एक 6 में काफी कम स्वैच्छिक आंदोलन शो मिनट खुले फील्ड टास्क से जंगली प्रकार चूहों (चित्रा 1C , चित्रा 2). एक पकड़ शक्ति चुनौती के हल्के परिश्रम के बाद, mdx चूहों आमतौर पर अभी भी ambulation प्रोटोकॉल के पहले कुछ मिनट के लिए रहते हैं, आंदोलन में एक मामूली वृद्धि के साथ मिनट 4 से 5 (चित्रा 3) । जब एक व्यायाम चुनौती के बिना जंगली प्रकार और mdx जानवरों का परीक्षण, हम कुल दूरी (चित्रा 2) कूच में कोई अंतर नहीं पता चला ।
इस तरह के आंदोलन की परख पर देख अंय समूहों से रिपोर्ट के अनुरूप है, बिना किसी फर्क या छोटे कम हो जाती है जंगली प्रकार चूहों के सापेक्ष mdx दिखा । हम इसके अतिरिक्त utrophin के उच्च स्तर पर व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का मूल्यांकन करने के लिए हमारे परख (mdx: utr-टीजी, Fiona लाइन)11,12की संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए । mdx: utr-टीजी कुछ अपक्षयी सुविधाओं के साथ mdx phenotype का एक मजबूत बचाव मॉडल है । व्यायाम के बाद, mdx चूहों utrophin व्यक्त कर रहे थे जंगली प्रकार से विरूपण, कुल दूरी की यात्रा में कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ (चित्र3) या में किसी भी संचई समय मापा अंक (चित्राएक) ।
वीडियो ट्रैकिंग आधारित फ्रेम करने के लिए फ्रेम परिवर्तनशीलता पर निर्भर करता है, या तो मैनुअल पर्यवेक्षक स्कोरिंग द्वारा मापा या स्वचालित सॉफ्टवेयर का पता लगाने के द्वारा । नि: शुल्क और खुला स्रोत आंदोलन विश्लेषण सॉफ्टवेयर पशु आंदोलन के अर्द्ध स्वचालित पता लगाने के लिए अनुमति देता है, जिसमें पाया या अनुमानित आंदोलनों मैन्युअल रूप से गतिविधि ट्रेस उत्पन्न होता है के रूप में सही किया जा सकता है. इस परख में डाटा प्रोसेसिंग को कम करने के लिए, हम दर्ज 30 एफपीएस से 15 एफपीएस के लिए मूल वीडियो downsampled । नमूना दर घटाने के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, हम कुल दूरी मापा पूर्ण फ्रेम दर वीडियो के 1 मिनट से कूच और फिर डेटा सेट (चित्र 4a) के downsampled संस्करण से व्युत्पंन दूरी माप की तुलना में. हमने पाया है कि आधे से फ्रेम दर को कम करने (2 द्वारा नाश) ५.०% से मापा दूरी में कमी आई है, और कम के रूप में फ्रेम दर को कम करने के रूप में ७.५ एफपीएस मूल दूरी की गणना की लगभग ९०% बनाए रखा (30 एफपीएस वीडियो से दूरी के ८९.२%) । मापा दूरी की सटीकता से इस बिंदु के बाद तेजी से गिरा दिया, हालांकि यहां तक कि उच्च-decimated डेटासेट अभी भी बारीकी से जानवर का रास्ता अनुमानित (चित्रा 4B) । इन टिप्पणियों फ्रेम दर और पशु गतिविधि का आकलन करने में संकेत प्रसंस्करण पर विचार के महत्व पर प्रकाश डाला, और यह है कि उच्च स्थानिक संकल्प downsampled वीडियो डेटा में रखा जा सकता है प्रदर्शित करते हैं ।
चित्रा 1: प्रतिनिधि खुला 6 के फील्ड निशान मिनट ambulation दूरी । (A) इस अध्ययन में प्रयुक्त गतिविधि रिकॉर्डिंग चैंबर के सेट अप । पकड़ मीटर व्यायाम चैलेंज के लिए इस्तेमाल किया गया था परख से पहले, तो मुक्त ambulation खुले मैदान मंच पर दर्ज किया गया था । (ख) आंदोलन ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में पता लगाने के विश्लेषण के साथ 6 मिनट वीडियो रिकॉर्डिंग की समग्र छवि । (C) दो प्रतिनिधि ट्रैस के ओवरले (WT, धूसर, n = 1; mdx, लाल, n = 1). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: mdx ambulation पर व् यायाम का प्रभाव । 6-मिनट ambulation दूरी के साथ या बिना पूर्व व्यायाम के 6 महीने में दर्ज किए गए थे (गैर-व्यायाम mdx n = 5, WT n = 4; व् यायाम mdx n = 5, WT n = 5). कोई महत्वपूर्ण अंतर WT और mdx के बीच जब unयायाम किया गया था, लेकिन एक महत्वपूर्ण अंतर चूहों में देखा गया था पहले परख करने के लिए व्यायाम (कोई व्यायाम: WT १०७७.० ± १०६.४ cm, mdx ९७१.० ± ३६.१६ cm; पोस्ट-व्यायाम: WT ७७०.२ ± ३०.७५ सेमी, mdx १२७.८ ± ३६.१६ cm). आंकड़ों का अर्थ है ± SEM. सांख्यिकी का उपयोग कर दो तरह ANOVA Tukey की एकाधिक तुलना की परीक्षा के बाद की गणना (*p & #60; ०.०५, * *प & #60; ०.०१, * * * प & #60; ०.००१ व * * * *प & #60; ०.०००१). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3: utrophin की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति mdx चूहों में ambulation को सुधारती है । 6-मिनट ambulation दूरियों को 6 महीने की आयु में एक खुला क्षेत्र गतिविधि चैंबर (WT n = 5, mdx n = 5, mdx: utr-टीजी एन = 4) का उपयोग कर दर्ज किया गया । (A) संचई दूरी मिनट से कूच । WT और mdxके बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया: utr-टीजी किसी भी बिंदु पर । Tukey की एकाधिक तुलना के परीक्षण के बाद दो-तरफा ANOVA का उपयोग करके परिकलित किए गए आँकड़े (*p & #60; ०.०५, * *p & #60; ०.०१, * * *p & #60; ०.००१ और * * * *p & #60; ०.०००१). (B) कुल खुले मैदान की दूरी 6 मिनट (WT ७७०.२ ± ३०.७५ cm, mdx १२७.८ ± ३६.१६ cm, mdx: utr-टीजी ७०१.३ ± ३३.५४ सेमी) पर कूच । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM. सांख्यिकी एक तरह से ANOVA का उपयोग कर की गणना की है Tukey एकाधिक तुलना परीक्षण द्वारा पीछा किया (*पी & #60; ०.०५, * *प & #60; ०.०१, * * *प & #60; ०.००१ व * * * *प & #60; ०.०००१).कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: ambulation ट्रैकिंग पर नमूना दर का प्रभाव. एक जंगली प्रकार के माउस, ambulation दूरी के 1 मिनट में दर्ज किया गया था और पूर्ण फ्रेम दर (३०.० एफपीएस, १,८१९ कुल फ्रेम) में आंदोलन ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ट्रैक । प्रत्येक फ्रेम में माउस के दो आयामी स्थिति निर्धारित किया गया था, और इन आंकड़ों तो कम फ्रेम दर वीडियो में ट्रैकिंग अनुकरण decimated थे (30, २२.५, 20, 15, 10, ७.५, 6, 3, १.५, और ०.७५ एफपीएस) । (A) प्रत्येक downsampled डेटा सेट में निर्देशांकों की गणना की गई कुल दूरी । डॉटेड रेखाएं पूर्ण फ़्रेम दर वीडियो से परिकलित दूरी के 5% के भीतर मानों को दिखाती हैं । इस अध्ययन में डेटा वीडियो decimated से 15 एफपीएस (लाल तीर) से प्राप्त किया गया । (B) १.५ fps (ऊपर) और 15 fps (नीचे) के साथ पूर्ण फ़्रेम दर ट्रेसिंग की तुलना करने वाले अंश के ओवरले । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
खुला क्षेत्र परख एक प्रभावी और गैर इनवेसिव तरीका मांसपेशियों की बीमारी के माउस मॉडल में मोटर समारोह परीक्षण प्रदान करता है, और इस परख के रूपांतरों पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए एक मूल्यवान समापन बिंदु उपाय के रूप में सेवा कर सकते हैं । परख के इस प्रकार के साथ एक प्रमुख सीमा उच्च लागत और गतिविधि की निगरानी प्रणालियों के सीमित पहुंच है । इस अध्ययन में, हम खुले क्षेत्र गतिविधि विश्लेषण के लिए एक कम लागत प्रणाली है कि मौजूदा वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर और उपकरणों के समान परिणाम उत्पंन कर सकते है प्रदर्शित करता है । इस प्रणाली का उपयोग vivaria के भीतर किया जा सकता है जहां चूहों का घर है, पशुओं को मुख्य सुविधाओं में स्थानांतरित करने की आवश्यकता को दूर करना । इस परख की बहुमुखी प्रतिभा भी अनुसंधान और शिक्षा की एक विस्तृत विविधता में ट्रैकिंग वीडियो के उपयोग में सक्षम बनाता है, स्नातक प्रयोगशाला पशु शरीर क्रिया विज्ञान और व्यवहार पर ध्यान केंद्रित पाठ्यक्रम सहित ।
इस अध्ययन में, हमने पाया है कि वंय-प्रकार और mdx चूहों के बीच स्वैच्छिक आंदोलन में अंतर आसानी से व्यायाम द्वारा गहरा निंनलिखित पाया जा सकता है । इस मजबूत अंतर अंय समान गतिविधि परिणामों पर देख समूहों द्वारा सूचित किया गया है, घंटे के लंबे समय खुला क्षेत्र परख और रात के पालन परख सहित । जब तक हम unambulationed वंय प्रकार और mdx चूहों के बीच स्वैच्छिक में कोई अंतर नहीं देखा, यह अंय समूहों13से परिणामों के अनुरूप है । कुछ शोधकर्ताओं ने गैर-ambulation वंय-प्रकार और mdx चूहों7के बीच स्वैच्छिक रूप से दूरी में मामूली अंतर की सूचना दी है, जबकि अन्य लोगों को कोई अंतर नहीं13रिपोर्ट । हमारे निष्कर्षों में आदेश मज़बूती से mdx गतिविधि में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए परीक्षण करने से पहले मांसपेशी सक्रियण के उपयोग का समर्थन.
इस अध्ययन में, हम एक उपंयास खुला क्षेत्र पर्यावरण के साथ चूहों प्रस्तुत किया । इस उपंयास पर्यावरण प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम समूहों के भीतर बहुत कम परिवर्तनशीलता मनाया । हालांकि, जब चूहों एक अपरिचित वातावरण में रखा जाता है, वे बढ़ गतिविधि है14करते हैं । एक ही जानवरों को कई सत्रों में परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, जानवरों रिकॉर्डिंग चैंबर के लिए आदत किया जाना चाहिए और डेटा रिकॉर्डिंग से पहले पूर्ण परीक्षण प्रोटोकॉल कई बार गुजरना ।
खुले मैदान परख से डेटा के मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि यह अत्यधिक पशु व्यवहार और भावनात्मक परिस्थितियों, विशेष रूप से चिंता-व्यवहार की तरह संवेदनशील है । यह संभव है कि mdx जंगली प्रकार के नियंत्रण जानवरों की तुलना में उपंयास वातावरण के लिए एक अलग व्यवहार प्रतिक्रिया हो सकती है । हालांकि, हम इसके अतिरिक्त एक मांसपेशी विशेष बचाव का परीक्षण किया, mdx: utr-टीजी माउस, जो एक मांसपेशी विशेष प्रमोटर के तहत utrophin व्यक्त करता है । इन चूहों के साथ ही जंगली प्रकार के जानवरों के प्रदर्शन, सुझाव है कि mdx चूहों में कोई व्यवहार मतभेद स्वैच्छिक ambulation में परिवर्तन नहीं चला रहे हैं ।
खुला क्षेत्र परख व्यापक रूप से व्यवहार मानदंड में इस्तेमाल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मोटर समारोह के अध्ययन में हैं, और वहां मानकों कि गतिविधि की निगरानी प्रणालियों से दर्ज किया जा सकता है की एक किस्म है । इन सामांयतः वाणिज्यिक गतिविधि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में इस्तेमाल किया माप के कुछ विशिष्ट व्यवहार, बारी आवृत्तियों, ऊर्ध्वाधर आंदोलन, और ब्याज की विशिष्ट क्षेत्रों के लिए वरीयताओं का पता लगाने के स्वचालित शामिल हैं । 6 मिनट ambulation दूरी इस अध्ययन में इस्तेमाल किया परख के लिए, उत्पादन काफी हद तक दूरी और क्षैतिज ambulation की गति तक ही सीमित है ।
इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में अर्द्ध स्वचालित ट्रैकिंग के लिए आवश्यक उपयोगकर्ता इनपुट के स्तर के कारण, इस परख की संभावना अच्छी तरह से समय की लंबी अवधि के लिए गतिविधि की निगरानी के लिए अनुकूल नहीं होगा या समानांतर में कई जानवरों को मापने । इस अध्ययन में, हमने पाया है कि एक प्रशिक्षित उपयोगकर्ता प्रक्रिया और रिकॉर्डिंग प्रति लगभग 15-30 मिनट में वीडियो से डेटा निकालने सकता है । हालांकि यह केवल छोटे पैमाने पर प्रयोगों के लिए एक उदारवादी समय बोझ का प्रतिनिधित्व करता है, विश्लेषण के इस स्तर पर तेजी से एक लंबे समय अवधि में बड़े नमूना सेट देख अध्ययन के लिए निषेध हो जाएगा । जबकि अधिक पूरी तरह से स्वचालित वाणिज्यिक ट्रैकिंग प्रणालियों आमतौर पर लागत से अधिक २०,००० USD, इन समाधानों और अधिक लागत और समय प्रभावी प्रयोगशालाओं जहां ambulation अक्सर परीक्षण किया जाता है के लिए हो सकता है । हालांकि, प्रयोगशाला और शैक्षिक सेटिंग्स के लिए है कि केवल जानवरों की छोटी संख्या का परीक्षण, सरल सेट अप और इस परख के reproducibility मोटर व्यवहार का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है ।
डेटा उपलब्ध विश्लेषण के प्रकार एक पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए उपयुक्त समापन बिंदु परख निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । जबकि हम लगातार तीन पादी के बीच मतभेदों का पता लगाने में सक्षम थे 6 मिनट ambulation दूरी (वंय-प्रकार, mdx, और mdx: utr-टीजी), अब अवधि गतिविधि का एक अधिक जटिल विश्लेषण वांछनीय हो सकता है जब सूक्ष्म देख स्वैच्छिक आंदोलन में परिवर्तन । हालांकि, इस कम लागत वाले सेट-अप की पहुंच और सादगी इसे mdx माउस मॉडल में पूर्व-नैदानिक अध्ययनों के लिए एक उपयोगी और अत्यधिक प्रासंगिक कार्यात्मक परीक्षण बनाती है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह कार्य स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [R01 AR048179 और R01 HL126204 को आर. सी. डब्ल्यू, T32 AR059033 और F32 AR069469to ई. एम. जी.] और दमदार Dystrophy एसोसिएशन यूएसए [२७४१४३ और ४१६३६४ से R.C.W.] के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
References
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- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
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