Summary
Este protocolo descreve um sistema flexível e de baixo custo para medir a deambulação do mouse em um ensaio de atividade de campo aberto. Mostramos que um ensaio de 6 minutos de deambulação com base neste sistema detecta uma diminuição no movimento voluntário em camundongos mdx e distingue com precisão a melhoria em um músculo específico resgate destes animais.
Abstract
Medir resultados funcionais no tratamento da distrofia muscular é um aspecto essencial dos testes pré-clínicos. A avaliação de deambulação voluntária em modelos do rato é um ensaio de atividade não-invasiva e reprodutíveis que é diretamente análogo para medidas de deambulação paciente, tais como o teste de caminhada de 6 minutos e relacionados com golo de mobilidade. Muitos métodos comuns para testar o rato deambulação de velocidade e distância baseiam-se no teste de campo aberto, onde a liberdade de circulação dos animais dentro de uma arena é medido ao longo do tempo. Uma grande desvantagem dessa abordagem é que o software comercial e equipamento para rastreamento de movimento de alta resolução é caro e pode exigir a transferência de ratos para instalações especializadas para testes. Aqui, descrevemos um sistema de baixo custo, baseado em vídeo para medir a deambulação do mouse que utiliza software livre e de código aberto. Usando este protocolo, demonstramos a deambulação voluntária no modelo do rato de distrofina-nulo mdx para distrofia muscular de Duchenne (DMD) é diminuída em relação à atividade do mouse do tipo selvagem. Em mdx camundongos expressando o transgene de Utrofina, estes défices de atividade não são observados e a distância total percorrida é indistinguível do selvagem-tipo ratos. Esse método é eficaz para medir alterações na deambulação voluntária associado com patologia distrófica e fornece uma plataforma versátil que pode ser facilmente adaptada para pesquisa de diversas configurações.
Introduction
Medições confiáveis e reprodutíveis de função muscular são fundamentais para avaliar a eficácia das terapias potenciais para DMD. DMD é uma doença genética causada por mutações no gene da distrofina, levando à fraqueza muscular progressiva, perda da deambulação e eventual insuficiência cardiorrespiratória. O modelo animal mais amplamente utilizado de DMD é o mouse distrofina-nulo mdx . Uma bateria de testes funcionais têm emergido como ensaios de rotina para avaliar a progressão da doença no mdx mouse, bem como em modelos animais similares de outras distrofias e miopatias. Ensaios comumente usados na vivo incluem medições de força de preensão do membro anterior, fio pendurado, máximo rotarod, tempo até a exaustão durante a atividade de execução e motor de esteira de rastreamento. Tem havido um esforço considerável no campo para padronizar esses testes, com o objetivo de reduzir a variabilidade entre os estudos pré-clínicos e aumentar o potencial de translação da terapêutica testada em ratos1,2.
Uma importante categoria de testes pré-clínicos é a medição do movimento voluntário, um parâmetro que é alterado com frequência em modelos murino de distrofia muscular. Isto é geralmente testado pelos ensaios com base no monitoramento da atividade de campo aberto e pode avaliar horizontal (curta) ou movimentos verticais (criação), um longo de minutos ou horas,2,3,4. Vários estudos têm demonstrado o movimento voluntário para ser alterada em camundongos mdx , particularmente após o exercício, e estas medições foram mostradas para ser sensível à progressão de doença e tratamento de drogas. Uma limitação importante na realização destes ensaios é a necessidade de equipamento especializado, de alto custo. Aqui, apresenta-se um método de baixo custo que rastreia a deambulação de rato usando recursos prontamente disponíveis.
A distância de caminhada de 6 minutos é uma métrica comumente usada como uma ferramenta de avaliação clínica em indivíduos com distrofia muscular de Duchenne5,6. Modificações desta medida têm sido utilizadas para avaliar os resultados em modelos animais de Duchenne, incluindo de camundongos mdx 7 e retriever dourado de cães de distrofia muscular (GRMD)8. Neste estudo, nós gravamos o movimento voluntário de campo aberto em 6 minutos imediatamente após um exercício suave desafio. Distância de deambulação foi então calculada usando o software livre de código aberto para medir o movimento horizontal ao longo do tempo.
A principal vantagem deste método é que os animais podem ser testados em uma variedade de configurações sem a necessidade de equipamento especializado ou alto custo software comercial para análise. Um aspecto importante desta análise é que pode ser realizada em uma configuração de laboratório básico sem a necessidade de mover ou transferir os ratos fora do viveiro para uma instalação de núcleo especializado. O protocolo de controle de vídeo descrito aqui é bem adequado para a avaliação da deambulação por períodos relativamente curtos e pode detectar diferenças de atividade entre ratos do selvagem-tipo e mdx , bem como revelar melhora funcional em um resgate modelo de DMD.
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Protocol
Os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso, a Universidade da Califórnia, Los Angeles e institucional Cuidado Animal. Selvagem-tipo (C57BL/6J) e camundongos mdx (fundo C57Bl/10ScSn) foram adquiridos a partir de uma fonte comercial. MDX: Utrofina-Tg ratos foram um presente de James Ervasti, com permissão de Kay Davies e foram mantidos no fundo de mdx . Deambulação ensaios foram realizados em camundongos machos com 6 meses de idade. Os ratos foram mantidos em viveiro de Ciências da vida a Terasaki seguindo diretrizes estabelecidas pelo cuidado Animal institucional e Comitê de uso para a Universidade da Califórnia, Los Angeles (aprovação #2000-029-43) e aprovação para estes estudos foi concedida pelo Garantia de bem-estar Animal UCLA (aprovação #A3196-01).
1. preparação da câmara
- Execute coleta de dados em uma sala de temperatura controlada a silenciosa, um momento consistente do dia9. Realize os testes cegados para o genótipo e o tratamento do mouse sendo testado.
- Se adapte a qualquer sistema de câmara de campo aberto para esta análise.
Nota: Neste estudo, utilizamos uma câmara de gravação barato e facilmente transportável, construída a partir de uma grande lixeira. A arena de campo aberto é uma bandeja conjunto em uma gaiola ou plataforma elevada similar. - Coloque a câmera em uma malha de arame acima da câmara para gravar em plena arena.
- Limpe a câmara de gravação com desinfetante antes de cada ensaio.
2. pré-exercício protocolo e coleta de dados
- Opcionalmente, imediatamente antes da gravação da atividade, desafie cada rato com um protocolo de ativação muscular.
Nota: Isto é opcional, mas recomendado em experimentos envolvendo ratos do mdx .- Permitir que o mouse agarrar a barra de tração de um medidor digital de força e puxe delicadamente até que a barra de tração é liberada. Repita este procedimento cinco vezes por julgamento.
- Registro de pico de tensão (N) para cada julgamento.
Nota: Além de servir como um desafio de exercício para o ensaio de deambulação, a força exercida pelo animal durante este ensaio de resistência de aderência pode ser usada como uma medida de resultado funcional adicional2,10. - Realize cinco ensaios totais para cada mouse com 1 minuto de descanso entre cada tentativa.
- Imediatamente após o ensaio de resistência de aderência ou outro protocolo de exercício, posicione o mouse na câmara de atividade.
- Inicie a gravação de vídeo do movimento do mouse na arena de câmara. Permitir que o mouse para explorar livremente por 6 min.
- Parar a gravação em 6 min e retornar o mouse para sua gaiola em casa.
3. a análise
- Opcionalmente, prepare o vídeo para análise, reduzindo a taxa de quadros. A fim de reduzir a taxa de quadros para análise de controle, use o seguinte protocolo em um vídeo que edita o software (por exemplo, o iMovie ou programa similar) para dizimar a taxa de frame de vídeo por um fator de 2.
Nota: Dependendo do comprimento e taxa de quadros do vídeo, pode ser útil reduzir a taxa de frame de vídeo antes da análise. Neste estudo, o vídeo foi gravado a 30 quadros/s (6 min de gravação, aproximadamente 10.800 frames totais).- Carrega o vídeo para o software.
- Sob o menu 'Velocidade', selecione ' velocidade: rápido ' e definir a velocidade de 2x.
- Exporte o vídeo dizimado no formato de arquivo. MP4 para análise de controle.
- Abra o vídeo para análise no programa de software. Defina a calibragem para a gravação usando a ferramenta de linha de vídeo. Desenhe uma linha ao longo de um dos lados da câmara. Clique com o botão direito na linha e selecione "Calibrar medida..." Digite o tamanho real do lado de câmara em centímetros.
- Para começar a controlar semi-automático da posição do mouse, clique sobre o cursor 'mover'.
Começando com o frame inicial no vídeo, botão direito do mouse sobre o ponto a ser rastreado; o ponto de controle é marcado com um círculo azul.
Nota: No presente estudo, a posição de cada animal foi rastreada ao traçar a base da cauda. - Avançar o quadro clicando na seta direita do teclado; o ponto de rastreamento deve mover automaticamente com base na posição da base da cauda.
- Se o rastreamento de posição não está alinhado com o ponto de interesse em um determinado quadro, alinhe manualmente o círculo azul na base da cauda.
Nota: Dependendo da qualidade do vídeo e a velocidade do mouse, o rastreamento pode exigir níveis variáveis de entrada do usuário para manter o alinhamento com o ponto de interesse. O caminho do mouse deve avançar através do curso do vídeo.
- Se o rastreamento de posição não está alinhado com o ponto de interesse em um determinado quadro, alinhe manualmente o círculo azul na base da cauda.
- Quando a localização do vídeo completo está completa, salve o overlay de vídeo e rastreamento. Exporte os dados posicionais do que o rastreamento, selecionando "Exportar para planilha".
4. análise de dados
- Abra os dados posicionais em um programa de software de planilha eletrônica. O software de análise de movimento relata que o X, Y coordenar a posição do mouse em cada quadro.
- Para calcular a distância percorrida pelo quadro, use a seguinte equação (onde é a posição no quadro de uma x1, y1 e quadro 2 é x2, y2):
Nota: A distância acumulada ao longo do tempo pode ser calculada adicionando a distância percorrida entre cada quadro.
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Representative Results
Variações de ensaio de campo aberto tem demonstradas ser um método eficaz para testar a progressão da doença em modelos de distrofia muscular. Aqui, demonstramos um versátil vídeo monitoramento método para a análise do movimento do mouse bidimensional usando equipamento de gravação prontamente disponíveis e software de fonte aberta (figura 1A–B). Consistente com os resultados relatados de ensaios semelhantes, mostramos que camundongos mdx desafiaram com um protocolo de exercício imediatamente antes de o teste mostrar significativamente menos movimento voluntário em uma tarefa de campo aberto de 6 minutos do que ratos do selvagem-tipo (Figura 1 , Figura 2). Após o esforço suave de um desafio de resistência de aderência, camundongos mdx normalmente permanecem ainda para os primeiros minutos do protocolo de deambulação, com um aumento modesto em movimento por minuto 4 a 5 (Figura 3A). Quando testes animais selvagem-tipo e mdx sem um desafio de exercício, não detectamos nenhuma diferença na distância total percorrida (Figura 2).
Isto é consistente com os relatórios dos outros grupos olhando para ensaios de movimento semelhante, com unexercised mdx não mostrando nenhuma diferença ou diminuições pequenas em relação ao tipo selvagem ratos. Além disso avaliamos ratos transgênicos expressando altos níveis de Utrofina para testar a sensibilidade do nosso ensaio (mdx: utr-tg, linha Fiona)11,12. O mdx: utr-tg é um modelo robusto de resgate do fenótipo com alguns recursos distróficos mdx . Após o exercício, camundongos mdx expressando Utrofina eram indistinguíveis do selvagem-tipo, com nenhuma diferença significativa entre a distância total percorrida (Figura 3B) ou em qualquer parte do tempo cumulativo pontos medidos (Figura 3A).
Monitoramento baseado em vídeo baseia-se na variabilidade de quadro a quadro, medida por qualquer observador manual de pontuação ou por detecção de software automatizado. Software de análise de movimento livre e de código aberto permite detecção semi-automática de circulação de animais, em que os movimentos não detectados ou superestimados podem ser manualmente corrigidos como o rastreamento de atividade é gerado. Para minimizar o processamento de dados, neste ensaio, nós downsampled os vídeos originais da 30fps gravado a 15 fps. Para determinar o efeito de diminuir a taxa de amostragem, medimos o total distância viajou de 1 min do vídeo de taxa de quadro completo e comparado as medições de distância derivadas downsampled versões do conjunto de dados (Figura 4A). Nós achamos que a redução da taxa de quadros pela metade (dizimação por 2) diminuiu a distância medida em 5,0%, e reduzindo a taxa de quadros tão baixa como 7,5 fps mantida quase 90% da distância original calculado (89,2% da distância de vídeo 30 fps). A precisão da distância medida deixou acentuadamente após este ponto, embora ainda altamente dizimada datasets ainda se aproximava o caminho do animal (Figura 4B). Estas observações destacam a importância de considerar a taxa do frame e processamento de sinal em avaliar a atividade animal e demonstram que a alta resolução espacial pode ser mantida no downsampled dados de vídeo.
Figura 1: representante abrir vestígios de campo de distância 6 minutos deambulação. (A) configuração da câmara de gravação de atividade usado neste estudo. Medidor de aderência foi usado para exercício prévio de desafio a ensaiar, então livre deambulação foi gravada na plataforma de campo aberto. (B) imagem composta de 6 min com análise de rastreamento em software de rastreamento de movimento de gravação de vídeo. (C) sobreposição de dois traços representativos (WT, cinza, n = 1; mdx, vermelho, n = 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito do exercício sobre mdx deambulação. distâncias deambulação 6 minutos foram registradas em 6 meses de idade, com ou sem exercício anterior (não-exercido mdx n = 5, WT n = 4; exercido mdx n = 5, WT n = 5). Nenhuma diferença significativa foi observada entre WT e mdx quando unexercised, mas uma diferença significativa foi vista em camundongos exercidos antes do ensaio (nenhum exercício: WT 1077.0± 106,4 cm, mdx 971.0 ± 36,16 cm; pós-exercício: WT 770.2 ± 30,75 cm, mdx 127,8 ± 36,16 cm). Representam dados significa ± SEM. estatísticas calculadas utilizar ANOVA de duas vias seguida de Tukey o teste de comparação múltipla (*p < 0.05, * *p < 0,01, * * * p < 0,001 e * * *p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Transgénico expressão da Utrofina melhora a deambulação em camundongos mdx . distâncias de deambulação 6 minutos foram registradas em 6 meses de idade, utilizando uma câmara de atividade de campo aberto (WT n = 5, mdx n = 5, mdx: utr-Tg n = 4). (A) cumulativa distância percorrida por minuto. Nenhuma diferença significativa foi detectada entre WT e mdx: utr-tg em qualquer ponto. Estatísticas calculadas usando ANOVA de duas vias seguida de Tukey do teste de comparação múltipla (*p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001 e * * *p < 0,0001). (B) Total aberto campo distância percorrida mais 6 min (± WT 770.2 30,75 cm, mdx 127,8 ± 36,16 cm, mdx: utr-Tg 701.3 ± 33,54 cm). Representam dados significa ± SEM. estatísticas calculadas utilizar o One-Way ANOVA seguida de Tukey o teste de comparação múltipla (*p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001 e * * *p < 0,0001).Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: efeito da taxa de amostragem na deambulação rastreamento. Em um rato selvagem-tipo, 1 min de distância de deambulação foi gravado e controlada usando o movimento que segue o software, a taxa de quadro completo (30,0 fps, 1.819 frames totais). Determinou-se a posição bidimensional do mouse em cada quadro, e esses dados foram dizimados em seguida para simular rastreamento no vídeo de taxa de quadro inferior (30, 22.5, 20, 15, 10, 7.5, 6, 3, 1,5 e 0,75 fps). (A) distância Total calculada a partir de coordenadas em cada conjunto de dados diminuída. Linhas pontilhadas mostram valores dentro de 5% da distância calculada a partir do quadro completo taxa de vídeo. Dados neste estudo foram obtidos de vídeo dizimado a 15 fps (seta vermelha). (B) as sobreposições de traços comparando a taxa de quadro completo rastreamento com 1,5 fps (acima) e 15 fps (abaixo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O ensaio de campo aberto fornece uma maneira eficaz e não-invasiva para testar a função motora em modelos do rato da doença muscular, e variações deste teste podem servir como uma medida de ponto de extremidade valiosa para estudos pré-clínicos. Uma limitação importante com este tipo de ensaio é a acessibilidade limitada e de alto custo dos sistemas de monitoramento de atividade. Neste estudo, vamos demonstrar um sistema de baixo custo para análise de atividade de campo aberto que pode gerar resultados semelhantes aos equipamentos e software comercial existente. Este sistema pode ser usado dentro vivaria onde os ratos estão alojados, eliminando a necessidade de transferir os animais para instalações do núcleo. A versatilidade deste teste também permite o uso de vídeo monitoramento em uma ampla variedade de investigação e de contextos educativos, incluindo cursos de graduação laboratório focados em comportamento e fisiologia animal.
Neste estudo, encontramos que diferenças no movimento voluntário entre ratos do selvagem-tipo e mdx podem ser prontamente detectada exacerbação seguir pelo exercício. Esta diferença robusta foi relatada por outros grupos, olhando para os resultados de atividade semelhante, incluindo ensaios de campo aberto uma hora de duração e ensaios de criação durante a noite. Enquanto não observamos nenhuma diferença na deambulação voluntária entre unexercised selvagem-tipo e camundongos mdx , isto é consistente com resultados de outros grupos de13. Alguns pesquisadores têm relatado uma modesta diferença na distância de deambulação voluntária entre unexercised selvagem-tipo e de camundongos mdx 7, enquanto outros relatam que não há diferença de13. Nossos resultados suportam o uso de ativação muscular antes do teste para detectar confiavelmente uma diferença estatisticamente significativa na atividade de mdx .
Neste estudo, apresentamos os ratos com um ambiente de romance campo aberto. Usando este protocolo de ambiente de romance, observamos a pouca variabilidade dentro dos grupos. No entanto, quando os ratos são colocados em um ambiente desconhecido, eles tendem a ter uma elevada atividade14. Se os mesmos animais devem ser testados em várias sessões, os animais devem estar habituados à câmara de gravação e submeter-se o protocolo de teste completo várias vezes antes de gravar dados.
Uma consideração importante na avaliação dos dados de ensaios de campo aberto é que é altamente sensível ao comportamento animal e condições emocionais, especialmente ansiedade-como comportamentos. É possível que o mdx pode ter uma resposta comportamental diferente para o ambiente de romance do que os animais selvagem-tipo de controle. No entanto, além disso testamos um resgate de músculos específicos, o mdx: rato utr-Tg, que expressa a Utrofina sob um promotor de músculo específico. Estes ratos realizados, bem como animais selvagem-tipo, sugerindo que quaisquer diferenças comportamentais em camundongos mdx não estão a conduzir as alterações na deambulação voluntária.
Ensaios de campo aberto são amplamente utilizados em paradigmas comportamentais, bem como em estudos de função motora, e há uma variedade de parâmetros que pode ser gravado a partir de sistemas de monitoramento de atividade. Algumas dessas medições comumente usado em software de análise de actividade comercial incluem a detecção automatizada de comportamentos específicos, vire as frequências, movimento vertical e preferências para regiões específicas de interesse. Para o ensaio de distância 6 minutos deambulação utilizado neste estudo, a saída é em grande parte limitada a distância e velocidade de deambulação horizontal.
Além disso, devido ao nível de entrada do usuário necessário para controle semi-automático no presente protocolo, este ensaio provavelmente não seria apropriado para a atividade de monitoramento por longos períodos de tempo ou medir vários animais em paralelo. Neste estudo, encontramos que um usuário experiente poderia processar e extrair dados de vídeos em aproximadamente 15-30 min por gravação. Enquanto isso representa apenas um fardo de tempo moderado por experiências em pequena escala, este nível de análise rapidamente tornaria proibitivo para estudos procurando amostra em grandes conjuntos por um longo período de tempo. Enquanto mais totalmente automatizado sistemas comerciais normalmente custam mais de 20.000 USD, estas soluções podem ser mais custo - e tempo-eficaz para os laboratórios onde a deambulação é frequentemente testada. No entanto, para o laboratório e ambientes educativos que testar somente um número pequeno de animais, o set-up simples e reprodutibilidade deste ensaio fornece uma ferramenta valiosa para avaliar o comportamento motor.
Os tipos de análises de dados disponíveis são uma consideração importante na determinação de ensaios de ponto de extremidade apropriado para um estudo pré-clínico. Enquanto fomos capazes de consistentemente detectar diferenças entre três genótipos usando 6 minutos distância a deambulação (tipo selvagem, mdxe mdx: utr-tg), uma análise mais complexa da atividade de longo prazo pode ser desejável quando olhar sutil alterações no movimento voluntário. No entanto, a acessibilidade e simplicidade desta montagem de baixo custo fazem um teste funcional útil e altamente relevante para estudos pré-clínicos no modelo do rato de mdx .
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por concessões do National Institutes of Health [R01 AR048179 e R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 e F32 AR069469to E.M.G] e a associação de Distrofia Muscular EUA [274143 e 416364 de R.C.W.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
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