Summary
Dit artikel demonstreert hoe de muis embryonale hindbrain kan worden gebruikt als een model voor het bestuderen van ontwikkelingsstoornissen neurogenese in zowel hele organen en weefsel sectie preparaten.
Abstract
De muis embryo reukkolf is het meest werkzame systeem voor het bestuderen van zoogdieren neurogenese tijdens de ontwikkeling. Echter, de zeer gevouwen reukkolf neuroepithelium is niet vatbaar voor wholemount analyse te onderzoeken orgel bestrijkende neurogenese patronen. Bovendien, het definiëren van de mechanismen van reukkolf neurogenese is niet noodzakelijkerwijs voorspellende van neurogenese in andere delen van de hersenen; bijvoorbeeld, als gevolg van de aanwezigheid van reukkolf-specifieke voorlopercellen subtypen. De muis-hindbrain biedt een alternatief model voor het bestuderen van embryonale neurogenese dat is vatbaar voor wholemount analyse, evenals weefselsecties te observeren de spatio distributie en het gedrag van neurale voorlopercellen. Bovendien is het gemakkelijk voor andere downstream-toepassingen, zoals cel isolatie of moleculaire biologie analyse ontleed. Zoals de muis hindbrain kan gemakkelijk worden geanalyseerd in het grote aantal cel lineage verslaggever en mutant muis stammen die beschikbaar zijn gekomen, biedt het een krachtig model voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van ontwikkelingsstoornissen neurogenese in een zoogdier organisme. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode om met behulp van de muis embryo hindbrain voor het analyseren van zoogdieren neurale progenitor cel (NPC) gedrag in wholemount preparaten en weefselsecties.
Introduction
Tijdens de embryonale ontwikkeling van de zoogdieren verdelen NPC's in de ventriculaire (VZ) en de subventriculaire (SVZ) zones van de groeiende neuroepithelium voor het genereren van nieuwe neuronen in een proces 'neurogenese' genoemd. De generatie van nieuwe neuronen en hun NPC precursoren heeft uitvoerig zijn onderzocht in de reukkolf1, terwijl minder is gekend over dit proces in andere regio's.
De reukkolf is een complex en ingewikkeld gevouwen structuur momenteel grotendeels met histologische methoden onderzocht na weefsel afdelen, waardoor begrip neurogenese patronen over de hele orgel uitdagend. Bovendien, zijn studies van reukkolf neurogenese niet noodzakelijkerwijs voorspellende van neurogene gedrag in andere hersengebieden of het ruggenmerg. Bijvoorbeeld, signalering signalen kunnen uiteenlopende reacties uitlokken tussen verschillende CNS-regio's, zoals opgemerkt in het geval van Ciliaire neurotrophic factor en leukemie remmende factor, die zelf-vernieuwing van NPC's te bevorderen in de laterale ganglionaire eminentie, maar rijden differentiatie van ruggenmerg progenitoren2. Bovendien, een subklasse van NPC's die bevolken de ontwikkelende reukkolf en aanzienlijk bijdragen aan de uitbreiding van de hersenschors1 afwezig zijn uit de hindbrain en het ruggenmerg3. Omgekeerd, is het denkbaar dat het ruggenmerg en hindbrain alternatieve NPC subtypen niet aanwezig in de cortex bevatten.
De muis embryo hindbrain is de evolutionaire oudste regio van de hersenen van zoogdieren en genereert de kleine hersenen en hersenstam. Ondanks haar instandhouding over soorten, is relatief weinig bekend over hindbrain neurogenese, met inbegrip van NPC subtypen of hun verordening. De meerderheid van hindbrain onderzoek in de muis is gericht op het proces van weefsel segmentatie, gedreven door Hox-genen4, en de patronen van post mitotische neuronen5. Bovendien, is de hindbrain gebruikt als een model voor het bestuderen van de mechanismen van ontwikkelingsstoornissen angiogenese6.
In tegenstelling tot de hindbrain van de muis, is de zebravis hindbrain gebruikt uitgebreid NPC differentiatie en bloedlijn progressie in een gewervelde model-organisme (bijvoorbeeld,7,8) te volgen. De hindbrain chick heeft ook tewerkgesteld te bestuderen neurogenese tijdens gewervelde ontwikkeling (b.v.,9,10). Gelijkaardig aan de zebravis hindbrain11, de chick hindbrain kunnen levende beeld om te bestuderen van NPC gedrag en verordening over tijd12. Analoog longitudinale observatie door levende imaging is niet momenteel mogelijk in zoogdieren organismen, omdat ze de ontwikkeling van in utero. Bovendien gericht manipulatie door middel van technieken zoals electroporation gemakkelijk kan worden toegepast op free-living zebrafish embryo's of kuiken embryo's in ovo (b.v.,13), maar dergelijke technieken zijn ook meer uitdagende in utero.
Toch is de muis embryo hindbrain prachtig geschikt voor het definiëren van de moleculaire en cellulaire mechanismen die neurogenese regeren. Ten eerste, analyse van de muis hindbrain zal, in veel gevallen, informatie verstrekken die meer relevant is voor mensen ontwikkelingen dan dat verkregen door het bestuderen van lagere gewervelde dieren. Bovendien vindt u een groot aantal genetisch gemodificeerde muis stammen dat kan ofwel worden gebruikt voor lot lymfkliertest NPC's in kaart te brengen of te veranderen van regulerende mechanismen met constitutieve of voorwaardelijke mutant allelen van relevante genen. Tot slot, het heeft onlangs aangetoond dat microinjection van ventriculaire hindbrain progenitoren ex vivo maakt ten minste een kort onderzoek van hindbrain NPC kinetiek14. Nog, op dit moment is zeer weinig bekend over de spatio organisatie en het gedrag van hindbrain NPC's in het kader van een hele orgel.
We laten hier zien een eenvoudige en snelle methode om met behulp van de hindbrain als een krachtig model voor het analyseren van zoogdieren NPC gedrag in wholemount preparaten en weefselsecties. Wij bieden verder protocollen voor het gebruik van immunolabeling voor het bestuderen van verschillende neurogenese parameters en proces hindbrain monsters verder voor downstream moleculaire toepassingen zoals kwantitatieve reverse-transcriptase (qRT)-PCR.
Protocol
Alle dierlijke werk werd uitgevoerd overeenkomstig UK Home Office en lokale ethische richtsnoeren.
1. Samenvatting van de stappen en Timing
- Getimede verparingen van volwassen muizen uitvoeren vanaf een stam geschikt de biologische vraag onderzochte verkrijgen van embryonale dag (e) 9.5-e13.5 zwangerschappen; vereist 12-15 dagen.
- Optioneel, bereiden 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) oplossing en het uitvoeren van injectie (Protocol sectie 2); vereist ~ 1 uur op de dag vóór of op de dag van embryo isolatie, afhankelijk van de gewenste lengte van EdU/BrdU labeling.
- Uitvoeren van embryo isolatie en hindbrain dissectie (punt 3 van het Protocol); vereist ~ 10 min/embryo.
- Uitvoeren van wholemount immunofluorescentie labeling (Protocol sectie 4); vereist 3 dagen.
- Sectie met behulp van een vibratome en het uitvoeren van zwevende sectie immunofluorescentie labeling (Protocol sectie 4): 2 dagen vereist.
- Sectie met behulp van een cryostaat en het uitvoeren van immunofluorescentie labeling van cryosecties (Protocol sectie 5); vereist 2 dagen.
2. Injecteer zwangere vrouwelijke muis met BrdU of EdU (optioneel)
- Ontbinden BrdU of EdU in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan concentraties van 10 mg/mL en 1 mg/mL, respectievelijk.
Let op: BrdU en EdU zijn giftig; Draag passende bescherming. - Weeg de zwangere muis en berekenen van het volume van BrdU of EdU oplossing die moet worden beheerd om te bereiken van 100 mg/kg BrdU of 5 mg/kg EdU.
- Injecteren BrdU of EdU oplossing via het intraperitoneaal route beide 1 h of 1 dag vóór het verzamelen van de embryo's, afhankelijk van de gewenste lengte van labeling.
Opmerking: Labeling voor 1 h visualiseert hindbrain cellen in de S-fase. Labeling voor 1 dag visualiseert het nakroost van hindbrain NPC's.
3. dissectie van Hindbrains van e9.5 - e13.5 muis embryo 's
- Euthanaseren een getimede-zwangere vrouwelijke muis met behulp van een ethisch goedgekeurde procedure stadium de vereiste zwangerschapsduur (b.v., cervicale dislocatie). Met behulp van scherpe schaar, de peritoneale holte opengesneden en zorgvuldig accijnzen van de baarmoeder. Plaats van de verwijderde baarmoeder met embryo's in een 60 mm kunststof schotel met 20 mL ijskoud PBS.
Opmerking: Aseptische techniek is niet vereist. - Het uitvoeren van alle verdere dissectie met behulp van een Microscoop ontleden. Met behulp van horlogemaker pincet nummer 5, scheurt de wand van de baarmoeder spier gebruikt om te bloot van de embryo's, elk embryo door doorsnijden omvat de navelstreng en het verwijderen van de dooierzak.
- Met behulp van een steriele Pipet van Pasteur met een wide-boring openen, breng elk embryo in een schone kunststof schotel met ijskoude PBS.
- Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, verbreken het hoofd (figuur 1E).
- U kunt desgewenst behouden een klein stukje weefsel (bijvoorbeeld¼ van een dooierzak of ongeveer 2 mm staart tip) voor genomic DNA isolatie en latere genotypering.
- Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, accijnzen het weefsel met de hindbrain parallel aan en onmiddellijk onder de neuroepithelium van de hindbrain te scheiden van gezichts- en reukkolf weefsel (figuur 1F).
- Positie van de hindbrain en caudal hoofd weefsel dorsale zijde omhoog en de 4th ventrikel, die is bedekt met een laag van dunne weefsel (plaat dak) te identificeren. Zorgvuldig doorboren de dak plaat met behulp van horlogemaker pincet nummer 55 (figuur 1G) en schil weg overtollige weefsel met een tang, verhuizen rostrally langs de middellijn over het veroorzaakt, en dan caudally over de achterste hindbrain en ruggenmerg (figuur 1G ); de hindbrain moet nu worden blootgesteld in een open boek voorbereiding (Figuur 1 H).
- Hindbrains voorbereiden door wholemount immunolabeling (optie 1).
- Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, zorgvuldig tease weg resterende hoofd mesenchym en eventuele hersenvliezen gekoppeld aan de pial kant van de hindbrain met behulp van Tang (figuur 1I). Verwijder de veroorzaakt en ruggenmerg weefsel (figuur 1J) te laten alleen het hindbrain weefsel (Figuur 1 K).
Opmerking: Deze stap van de procedure dient niet te worden gevolgd op e9.5 of e10.5, omdat het probeert om dit te doen zou waarschijnlijk beschadigen de hindbrain neuroepithelium; Bovendien, verwijderen de hersenvliezen is niet essentieel omdat de hindbrain neuroepithelium voldoende dun in dit stadium is dat efficiënte penetratie van antilichamen voor immunolabeling. Deze stap moet, echter, worden gevolgd van e11.5, wanneer het meningeal weefsel consolideert, ter verbetering van antilichaam penetratie in de hindbrain neuroepithelium. Dissectie is het makkelijkst wanneer uitgevoerd in ijskoude PBS (gebruik schone PBS voor elke hindbrain).
- Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, zorgvuldig tease weg resterende hoofd mesenchym en eventuele hersenvliezen gekoppeld aan de pial kant van de hindbrain met behulp van Tang (figuur 1I). Verwijder de veroorzaakt en ruggenmerg weefsel (figuur 1J) te laten alleen het hindbrain weefsel (Figuur 1 K).
- Hindbrains voorbereiden op vibratome en cryosectioning (optie 2)
- Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, verwijder de veroorzaakt en ruggenmerg weefsel (figuur 1J).
Opmerking: Het is niet nodig om mesenchym en hersenvliezen van hindbrains die bestemd zijn voor het segmenteren (zoals weergegeven in figuur 1I) te verwijderen.
- Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, verwijder de veroorzaakt en ruggenmerg weefsel (figuur 1J).
- Hindbrains van de kunststof schotel overbrengen met ronde bodem van 2 mL tubes met behulp van een pipet van Pasteur, gecombineerd alle PBS en positiebepaling voor 2 uur bij 4° C met zacht-agitatie in vers ontdooid 4% w/v formaldehyde opgelost in PBS.
Let op: Formaldehyde is giftig; Draag passende bescherming. - Spoel hindbrains 3 x keer met PBS. Bewaren bij 4 ° C in PBS als immunolabeling zal binnen 2-3 dagen beginnen of vervang PBS met 50% methanol/50% PBS voor 5 min voordat de overdracht naar 100% methanol voor langere opslag bij-20° C.
4. Wholemount immunofluorescentie
- Indien nodig, hindbrains in aflopende serieel verdunningen van methanol in PBS (b.v.75% methanol, 50% methanol, 25% methanol) bij kamertemperatuur (RT) voor elke 5 minuten hydrateren en vervolgens overbrengen naar PBS.
Opmerking: Een gesorteerde reeks van methanol is vereist voor zachtjes hindbrains hydrateren en conservering van het juiste weefsel. - Permeabilize van hindbrains gedurende 30 minuten bij 4 ° C in PBS met 0,1% Triton X-100 (PBT) met zachte agitatie.
- Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C in PBT met 10% serum van de warmte-geïnactiveerd geit met zachte agitatie hindbrains.
Opmerking: Gebruik een serum van de host-soorten die de secundaire antilichamen zijn gerezen in. Voor primaire antilichamen opgegroeid in geit, incubeer in serumvrij eiwit blokkeren, bijvoorbeeld 5% bovien serumalbumine in PBS of een geschikt alternatief voor commerciële (Zie Tabel van materialen). Dit zal niet-specifieke kleuring vaak waargenomen bij het gebruik van primaire antilichamen opgegroeid in geit. - Incubeer hindbrains's nachts bij 4 ° C in PBT met 1% warmte-geïnactiveerd serum en primaire antilichamen met zachte agitatie (bijv., konijn anti-phospho Histon H3 [pHH3] verdund 1:400).
Opmerking: Gebruik voor primaire antilichamen opgegroeid in geit, PBT zonder serum. - Wassen van de hindbrains bij 4 ° C 5 x met PBT voor elk 1U.
- Incubeer hindbrains's nachts bij 4 ° C in PBT met passende fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen (bv, geit anti-konijn Alexa Fluor 488) op 1:200 in PBT gericht tegen de primaire antilichamen gebruikt. Houd hindbrains in het donker hiervandaan op fluorophores beschermen photobleaching.
Opmerking: Gebruik voor primaire antilichamen opgegroeid in geit, anti-geit Fab fragmenten van secundaire antilichamen om niet-specifieke kleuring. - Wassen van de hindbrains bij 4 ° C 5 x met PBT voor elk 1U.
- De hindbrains in 4% formaldehyde in PBS voor 15 min. op RT voor de langetermijnbewaring van antilichaam-bindende postfix. Kort spoelen tweemaal in PBS.
- Dekking van een glasplaatje Microscoop met twee lagen van zwarte isolatietape en accijnzen van een vierkantje van de gelaagde tape naar het maken van een zak groot genoeg is om te houden van één hindbrain.
- Pipetteer van elke hindbrain in een zakje met een pipet van Pasteur, verwijderen van de overtollige vloeistof en voeg een geschikt antifade reagens aan de zak voordat het langzaam bedekken met een dekglaasje glas aan om te voorkomen dat overlapping luchtbellen onder het dekglaasje aan. Zegel van het dekglaasje aan en brengt deze naar de dia met een dun laagje nagellak. Bewaren dia bij 4 ° C in het donker tot Beeldacquisitie (Protocol sectie 7).
5. de Vibratome segmenteren en drijvende sectie immunofluorescentie
- Indien nodig, hydrateren hindbrains van methanol, zoals beschreven in stap 4.1.
- Hindbrains insluiten in gesmolten 3% w/v agar bereid in gedestilleerd water.
Nota: Toestaan gesmolten agarose afkoelen tot ongeveer 55° C kort voordat het insluiten warmte om schade te voorkomen aan hindbrain. - Dwarse hindbrain secties gesneden met een dikte van 70 µm met behulp van een vibratome. Breng elke vers gesneden sectie met een penseel in een putje van de plaat van een 24-well met ijskoude PBS.
- Label van de zwevende secties, zoals beschreven in stappen 4.2-4.7, maar de stappen als volgt wijzigen: wassen het drijvende afdelingen bij 4 ° C 3 x met PBT voor 15 minuten elk, verlaagt de incubatietijd voor secundaire antilichamen tot en met 2 h en incubeer in secundair antilichaam op RT.
- Eventueel na het labelen met antilichamen voor andere epitopes zoals beschreven in stap 5.4, detecteren EdU+ kernen met behulp van een EdU labeling kit volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de zwevende secties in de reactie cocktail gedurende 30 minuten bij 37 ° C in het donker. Wassen hindbrain afdelingen bij 4 ° C 3 x met PBT voor elke 15 min.
- Eventueel na labeling voor andere epitopes zoals beschreven in stap 5.4, detecteren BrdU+ kernen als volgt.
- Incubeer zwevende secties in zoutzuur 2 N bij 37 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
- Incubeer zwevende secties in 0,1 M natriumboraat buffer pH 8,5 tweemaal voor 5 minuten elk op RT in het donker te neutraliseren het zoutzuur.
- Wassen van zwevende secties 3 x kort in PBS bij 4 ° C.
- Immunofluorescentie labeling voor BrdU zoals beschreven in stap 5.4 uitvoeren
- Incubeer de zwevende secties voor 2 min op RT 10 µg/ml 4', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI) in PBS te counterstain celkernen.
- Postfix de zwevende secties in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten op RT.
- Wassen zwevende secties kort in PBS. Zorgvuldig overbrengen in zwevende secties een glasplaatje Microscoop met behulp van een penseel. MOP van overtollige PBS rond de sectie met vloeipapier of weefsel.
- Mount secties met 80% glycerol in PBS en dek langzaam met een dekglaasje glas aan het vermijden van overlapping luchtbellen. Winkel dia bij 4 ° C in het donker tot Beeldacquisitie (stap 7).
6. de cryostaat segmenteren en Cryosection immunofluorescentie Labeling
- Indien nodig, hydrateren hindbrains van methanol, zoals beschreven in stap 4.1.
- Incubeer hindbrains in sacharose van de 30% w/v in PBS naar cryoprotect hindbrains voor bevriezing.
Opmerking: Hindbrains zijn klaar voor het bevriezen wanneer ze gezonken aan de onderkant van de buis, waarin meestal ≤ 2 h voor e9.5-10.5 hindbrains en 3-6 h voor e11.5-13,5 hindbrains. - Hindbrains in optische snijden temperatuur samengestelde (OCT) dompelen en snel bevriezen door de overdracht van mallen met hindbrains in LGO tolueen afgekoeld tot-40 ° C à-50 ° C op droog ijs.
Opmerking: Bevroren, ingesloten hindbrains kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C korte en de lange termijn-80 ° C tot segmenteren. - Dwarse hindbrain secties op een dikte van 10 µm met behulp van een cryostaat en overdracht aan via een elektrostatisch proces zelfklevende Microscoop dia's gesneden.
Opmerking: Hindbrain cryosecties kan worden achtergelaten bij-20 ° C korte en de lange termijn-80 ° C tot etikettering. - Incubeer dia's op RT voor 15 min te drogen van de secties op de dia's. Wassen met PBS cryosecties los OCT en mark een hydrofobe barrière rond cryosecties met een PAP-pen. Herhaal stap 5,4-5,8.
- Herhaal stap 5.10 met behulp van een medium polyvinyl alcohol gebaseerde montage in plaats van glycerol.
7. de Beeldacquisitie
- Foto's met behulp van een epifluorescerende of confocale laser scanning microscoop uitgerust met lenzen geschikt voor waterige media gemonteerde dia's en optische filters geschikt voor de fluorophores gebruikt voor immunolabeling.
- Naar het image van de hele hindbrain of een hindbrain-sectie, gebruik maken van een lens voor 10 x vergroting (bijvoorbeeld figuur 2B); gebruiken om te visualiseren hindbrains gebieden voor kwantificering, een 40 X vergroting (bijvoorbeeld figuur 2D) en te visualiseren van afzonderlijke cellen, gebruikt u een lens met een 63 x vergroting (bijvoorbeeld figuur 2C).
8. alternatieve methoden
- Meng na stap 3.8, losse hindbrains voor de productie van een eencellige schorsing voor stroom cytometry toepassingen15.
- Na stap 3.8, meng nietgefixeerde hindbrains om RNA extract van eencellige schorsingen voor RT-qPCR (b.v., 16).
Opmerking: Zorg ervoor alle reagentia en apparatuur worden RNase-gratis in het hele ter voorkoming van achteruitgang van RNA en steriele gehouden. - Na stap 3.8, meng nietgefixeerde hindbrains om te isoleren van NPC's en deze kan doorgeven in vitro als neurospheres voor de analyse van hindbrain NPC gedrag17.
Opmerking: Zorg ervoor alle reagentia en apparatuur worden gehouden steriele Bacteriële/schimmelinfecties verontreiniging van neurosphere culturen te voorkomen.
Representative Results
Deze sectie ziet u voorbeelden van de resultaten die kunnen worden verkregen bij de studie van de neurogenese in de muis embryonale hindbrain door middel van wholemount en weefsel sectie analyse.
We laten zien dat immunolabeling van de wholemount van de microdissected hindbrain met een antilichaam voor de mitotische marker pHH3 visualiseert verdelen van NPC's in de VZ (figuur 2B - D). Laten we pHH3+ NPC's bij een hoge vergroting wil de verschillende fases van de mitose (figuur 2C). We hebben laten zien dat deze labeling methode geschikt om te worden uitgevoerd in verschillende opeenvolgende stadia van ontwikkeling van de hindbrain is te observeren het tijdsverloop van NPC mitose in dit orgel (figuur 2D).
We laten zien dat imaging dwarse immunolabeled vibratome secties van de hindbrain 1 h na EdU injectie, visualiseert de splitsing richting van mitotische NPC (figuur 3B), het patroon van de pseudostratified, interkinetic nucleaire migratie van fietsen progenitoren18 (figuur 3B, D), en de algehele VZ structuur (figuur 3B - D). Merk op dat mitotische pHH3+ NPC's zijn alleen bij de ventriculaire oppervlak aanwezig en niet meer basally (Figuur 3 c), die contrasteert de basale divisie patroon van het geëngageerder NPC's in de reukkolf19.
We illustreren ook hoe fietsen NPC's en hun gedifferentieerde nageslacht kan gelabeld zijn met BrdU of EdU om te beoordelen van NPC lineage progressie (Figuur 4). De immunolabeling van transversale cryosecties van de muis hindbrain 1 dag na BrdU injectie voor BrdU en Ki67toont het aantal en de positionering van de fietsen van NPC's in de neuroepithelium (figuur 4A, B), waarbij het aantal zelf vernieuwen NPC's kan worden gedefinieerd door berekening van het percentage van de Ki67+ BrdU+ cellen onder alle BrdU+ cellen (figuur 4A, C).
Ten slotte, laten we een voorbeeld van immunolabeling van hindbrain vibratome secties voor RC2, een antigeen in de tussenliggende gloeidraad van neurale-specifieke nestin, om te visualiseren NPC endfeet (figuur 5B) en processen (figuur 5C). Vibratome secties, in plaats van dunne cryosecties, toestaan verbeterde observatie van de zeer vertakte NPC's en ook met de algemene structuur van de neuroepithelial.
Figuur 1 : Sleutel stappen in de dissectie van een hindbrain van een e11.5 muis embryo. (A - D) Schematische voorstelling van hindbrain microdissection. (A) het caudal hoofd weefsel wordt verwijderd door doorsnijden omvat langs de rode gestippelde lijnen. (B) de dak plaat is doorboord en vervolgens weg gescheurd in zowel rostraal en caudal richtingen langs de middellijn (verticale rode lijnen) en dan lateraal te onthullen van de hindbrain neuroepithelium. (C) de neuroepithelium is uit de buurt van de hersenvliezen keek na het plaatsen van de verlostang tussen beide structuren, en het veroorzaakt en ruggenmerg weefsels worden verwijderd door doorsnijden omvat het weefsel met de verlostang langs de rode gestippelde lijnen. (D) deze procedure levert een afgevlakte hindbrain. (E--K) Fotolader van belangrijke fasen van de procedure van de microdissection hindbrain. (E) het embryo is onthoofd door doorsnijden omvat langs de stippellijn. (F) de hindbrain en de 4th ventrikel, omsloten door de dak-plaat, zijn weggesneden en gescheiden van het hoofd door doorsnijden omvat langs de dotted strafregels. (G) de 4th ventrikel is gericht naar boven voordat een klein gat in het dak plaat (sterretje) wordt doorboord. Het gat is verruimd door het weefsel peeling zorgvuldig zowel rostrally als caudally langs de middellijn (pijlen) om de hindbrain bloot te stellen. De hindbrain is gepositioneerd pial zijde naar beneden en van links naar uitklapbare in een open boek voorbereiding (H; zwart pijlpunt geeft hindbrain zenuwweefsel). Als de hindbrain vereist voor wholemount immunolabeling is, wordt het pial membraan verwijderd door nieuwsgierige zachtjes de neuroepithelium van de hindbrain van de omliggende meningeal membranen met pincet (ik). Veroorzaakt (mb) en het ruggenmerg (sc) overtollige weefsel is verwijderd (stippellijnen in J) te isoleren van de hindbrain (K). Schaal bar: 500 µm voor (E), 300 µm voor (F - - K). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Wholemount immunolabeling kan worden gebruikt voor het kwantificeren van NPC mitoses over de hindbrain. (A) schema nl gezicht beeldvorming van mitotische NPC's in de hindbrain ventriculaire laag te illustreren. V, ventriculaire hindbrain kant; P, pial hindbrain kant. (B) Confocal tegel scan z stapel e10.5 hindbrain na wholemount immunolabeling voor de mitotische marker pHH3 (rood). Het witte vak geeft aan de ruimte die zijn genoemd bij hogere vergroting in het tweede deelvenster in (D). (C) pre anafase (witte pijlpunt) en anafase (zwarte pijlpunt) mitotische cijfers zijn te onderscheiden binnen de totale cohort van mitotische NPCs. (D) tijdsverloop van wholemount pHH3 labeling van e9.5-13,5. Schaal bars: 500 µm in (B); 20 µm in (C); 100 µm in (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Fietsen NPC's binnen hun germinal zone in de rostraal hindbrain. (A) Schematische voorstelling afgebeeld van de positie van de mitotische (groen) en de S-fase (rood)-NPC's op de ventriculaire oppervlak van hindbrain en op het gebied van periventricular, respectievelijk. Een virtuele doorsnede door de hindbrain wordt weergegeven bij hogere vergroting aan de rechterkant. De zwarte pijl geeft de richting van migratie van NPC nakomelingen die hebben verlaten de celcyclus naar de differentiatie-zone. (B) Confocal z stapel van een drijvende e11.0 hindbrain sectie van een embryo die een 1U EdU pols ontvangen; immunolabeling voor pHH3 en EdU werd gebruikt om te visualiseren mitotische (groen) en de S-fase (rood) NPC's, respectievelijk. Hindbrain oppervlakken worden aangeduid met stippellijnen; V, ventriculaire hindbrain kant; P, pial hindbrain kant. Het gebied aangegeven met een wit vakje wordt weergegeven bij hogere vergroting in de inzet; pijlen geven aan dat het vliegtuig van de splijting van een NPC in anafase, ten opzichte van de ventriculaire oppervlak. (C) Eén kanaal pHH3 immunolabeling alleen weer te geven. Mitotische NPC's worden aangeduid met cyaan pijlpunten; het gebrek aan basale divisies wordt aangegeven door Δ. (D) enkel kanaal weergeven EdU labeling alleen. EdU+ NPC's nemen een pseudostratified verdeling als gevolg van hun interkinetic nucleaire migratie. De afstand die NPC's uit de buurt van de ventriculaire oppervlak migreren kan worden gemeten, zoals een vertegenwoordiger oranje lijn. Schaal bars: 100 µm in (B -D); 10 µm in verzonken vlak in (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Combineren BrdU met het labelen van de Ki67 om te bepalen hindbrain NPC zelf-vernieuwing capaciteit. (A) Confocal z stack van een e10.5 hindbrain cryosection na labeling voor Ki67 (groen) en BrdU (rood) na een 1 dag BrdU pulse. Dubbel-positieve cellen in de ventriculaire zone zijn NPC's die BrdU hebben opgenomen en worden nog steeds door middel van de celcyclus, zoals aangegeven door het labelen van de Ki67. Het aandeel van de double-gelabeld cellen onder de totale bevolking van de BrdU+ geeft het percentage van zichzelf vernieuwende NPC's (B, C) enkele kanalen weergeven van Ki67 (B) en (C) BrdU immunolabeling alleen. Een BrdU+ -cel die mist Ki67 en daarom heeft waarschijnlijk verlaten de celcyclus wordt aangegeven door een cyaan pijlpunt in (A,C). Hindbrain oppervlakken worden aangeduid met stippellijnen; V, ventriculaire hindbrain kant; P, pial hindbrain kant. Schaal bar: 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Nestin immunolabeling visualiseert NPC processen en endfeet. (A - C) Immunofluorescentietest voor RC2, die een epitoop herkend op de neurale tussenliggende gloeidraad nestin, illustreert NPC morfologie over de hindbrain neuroepithelium. (A) Confocal z stack van een zwevende sectie uit een hindbrain van de e11.5 na RC2 immunolabeling; vakken staan bij hogere vergroting in (B, B'; apicale/ventriculaire regio) en (C, C', basale regio). Hindbrain oppervlakken worden aangeduid met stippellijnen; V, ventriculaire hindbrain kant; P, pial hindbrain kant. (B, C) Confocale z stapels boxed gebieden in (A); interne optische secties worden weergegeven in (B', C'), respectievelijk. Een NPC apicale endfoot verankerd aan de ventriculaire oppervlakte is aangegeven met een pijl in (B'). Enkele en fasciculated NPC processen worden aangeduid met witte en zwarte pijlpunten in (C'), respectievelijk. Schaal bars: 100 µm, (A); 25 µm voor (B, C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol wordt beschreven hoe u de muis embryonale hindbrain als een model om te bestuderen van de mechanismen van ontwikkelingsstoornissen neurogenese. Met behulp van een verscheidenheid van verschillende immunolabeling methoden, hindbrain NPCs kan worden gevisualiseerd en hun aantal gekwantificeerd in weefselsecties of over orgel wholemounts. Het gemak van de dissectie en platte anatomie zorgt ervoor dat de hindbrain in de voorbereiding van een 'open boek' informatie te verzamelen over orgel-wide neurogenese patronen image kan worden gemaakt.
Verder laten we zien dat NPC morfologie en celcyclus-gerelateerde NPC positionering kunnen worden gemakkelijk gevisualiseerd in drijvende- of cryosecties van de hindbrain. Beide gedragingen kunnen worden benut om het definiëren van nieuwe voorlopercellen populaties, zoals eerder is uitgevoerd in de zoogdieren telencephalon20. Bijvoorbeeld, vroege gevormde Sox2+ neuroepithelia en Pax6+ apicale radiale glia zijn aanwezig in de hindbrain21,22, maar de hindbrain mist Tbr2+ basale progenitoren3 .
Het protocol hier beschreven kan ook worden aangepast aan het observeren van het gedrag van specifieke NPC subpopulaties door fluorescerende labeling voor levende imaging en/of lineage tracering in vaste weefsels. Dit kan worden bereikt, bijvoorbeeld door het bestuderen van de hindbrains uit muizen dragen de tamoxifen-afleidbare transgenic Sox1-iCreERT2 en de Rosa26tdTomato verslaggever23.
Behalve voor een betere kennis van lymfkliertest neurogenese, kan bestuderen van de hindbrain toelichten in grote lijnen relevante neurogene mechanismen die worden gedeeld door de soorten, omdat het hindbrain een zeer geconserveerde hersenen regio die verwachting is lijkt meer tussen gewervelde dieren dan de reukkolf.
Zoals hindbrain neurogenese over een relatief korte tijd venster dan reukkolf neurogenese23 plaatsvindt, is het belangrijk om te overwegen de noodzaak voor het vergelijken van voldoende geënsceneerd embryo's. Dienovereenkomstig, experimentele bias wordt vermeden door tellen en het opnemen van het aantal Somiet paren in een embryo voorafgaand aan zijn hindbrain te isoleren. Het hindbrain weefsel zelf is broos en pincet moet daarom voorzichtig worden omgegaan wanneer het scheiden van het hindbrain weefsel van het hoofd mesenchym en hersenvliezen; een paar van 'praktijk runs' zou daarom aan te raden voordat dissectie van waardevolle embryo's tot stand is gebracht. Bovendien moet de hindbrains uit een buis worden overgedragen naar de andere met behulp van een precisiepipet wide-boring Pasteur in plaats van met een tang om schade (van de pipet openen kan worden uitgebreid door het kappen van het uiteinde met een schone schaar) te voorkomen. Ten slotte, hoewel ongebruikelijk, de omvang van de EdU/BrdU opneming in de S-fase NPC's mogelijk variabele, met name tijdens de korte (dat wil zeggen, 1 h) peulvruchten. Ter verbetering van labeling, zorgen dat EdU/BrdU goed is ontbonden vóór het laden van de oplossing in de spuit en zorgvuldig te injecteren in de peritoneale holte. Arme injecties, zoals die subcutaan per ongeluk, zal resulteren in het verliezen of het overvullen van de EdU/BrdU-oplossing en voorkomen dat het invoeren van het verkeer.
Disclosures
De auteurs geen strijdige belangen of belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Vasiliki Chantzara voor de uitvoering van getimede verparingen en het personeel van de biologische Resource-eenheid op de UCL Institute van oftalmologie voor muis veehouderij. Deze studie werd ondersteund door een Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z CR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
| Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
| Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
| 29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
| Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
| Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
| Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
| Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
| 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
| Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
| Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
| Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
| Mowiol | Millipore | 475904 | |
| OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
| Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
| Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Thermometer | VWR | 620-0858 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |
References
- Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
- Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
- Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
- Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
- Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
- Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
- Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
- Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).
- Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
- Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
- Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
- Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).
