Summary
이 문서 양측 검정 전체 기관에 조직 섹션 준비 발달 신생 공부 모델 마우스 배아 hindbrain를 사용 하는 방법을 보여 줍니다.
Abstract
마우스 배아 개 개발 중 포유류 성체를 공부 하는 가장 일반적으로 고용된 시스템입니다. 그러나, 높게 접힌된 개 neuroepithelium wholemount 분석 검사 기관 전체 성체 패턴을 의무가 아니다. 또한, 개 신생의 메커니즘을 정의 하지 않습니다 반드시 신생; 뇌의 다른 부분에서의 예측 등으로 인해 개 특정 조상 하위의 존재. 마우스 hindbrain 배아 신생 의무가 wholemount 분석, 뿐만 아니라 조직 단면도 spatiotemporal 유통 및 신경 창시자의 동작을 관찰 하는 공부에 대 한 대체 모델을 제공 합니다. 또한, 그것은 쉽게 세포 격리 또는 분자 생물학 분석 같은 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 해 부. 마우스 hindbrain 세포 계보 기자 및 제공 되는 돌연변이 마우스 긴장의 광대 한 수에 쉽게 분석할 수 있습니다, 그것은 공부는 포유류 발달 성체의 세포 및 분자 메커니즘에 대 한 강력한 모델을 제공 합니다. 유기 체입니다. 여기, 우리가 마우스 배아 hindbrain wholemount 준비와 조직 섹션에서 포유류 신경 조상 세포 (NPC) 동작을 분석 하는 데 사용 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.
Introduction
포유류 배아 개발 하는 동안 Npc '성체'를 불리는 과정에서 새로운 신경 세포를 생성 하는 심 실 (VZ)와 확장 neuroepithelium의 subventricular (SVZ) 지역에 분할. 새로운 신경 세포와 그들의 NPC 선구자의 세대는 조사 광범위 하 게1개 더 적은 다른 지역에서이 프로세스에 대 한 알려져 있다 하는 동안.
개는 복잡 하 고 복잡 하 게 접힌 구조는 크게 조직 단면, 후 조직학 방법으로 공부를 시키는 이해 성체 패턴 전체 기관에 걸쳐 도전 이다. 또한, 개 신생의 연구는 반드시 다른 뇌 영역 또는 척수 neurogenic 행동의 예측. 예를 들어 측면 절 예 하, 하지만 드라이브에 자체-갱신 NPCs의 홍보는 속눈썹 neurotrophic 요인 및 백혈병 금지 요인 관찰 단서 별개의 CNS 영역에 걸쳐 서로 다른 응답을 이끌어내는 수 신호, 척수 창시자2분화 NPCs는 대뇌 피 질의1 의 확장에 크게 기여 하 고 개발 개 채울의 하위 클래스는 또한, hindbrain 및 척수3에서. 반대로, 그것은 생각할 수 있는 척수와 hindbrain 피 질에는 없음 대체 NPC 하위 포함입니다.
마우스 배아 hindbrain 포유류 두뇌의 진화의 가장 오래 된 지역 이며, 소 뇌 및 brainstem 생성. 종에 걸쳐 그것의 보존에도 불구 하 고 상대적으로 작은 hindbrain 성체, 전인대 하위 또는 그들의 규칙을 포함 하 여에 대 한 알려져 있다. 마우스에서 hindbrain 연구의 대부분은 조직 세분화, Hox 유전자4, 포스트 mitotic 신경5의 패턴화에 의해 구동 하는 과정에 집중 했다. 또한,는 hindbrain 발달 신생6의 메커니즘 연구 모델로 사용 되었습니다.
마우스 hindbrain 달리 zebrafish hindbrain NPC 차별화와 척추 모델 생물 (예를 들어,7,8)에서 계보 진행에 따라 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 병아리 hindbrain 또한 척추 개발 (예를 들어,9,10) 동안 성체를 공부 고용 되었습니다. Zebrafish hindbrain11와 마찬가지로 여자 hindbrain 수 라이브12시간 동안 NPC 행동 규정을 공부 하 고 몇 군데. 라이브 영상에 의해 유사한 경도 관측 불가능 현재 포유류 유기 체에서 개발 하기 때문에 utero. 또한, 살아있는 zebrafish 태아 나 병아리 태아에서 비켜에서 (예를 들어,13), electroporation를 쉽게 적용할 수 있지만 이러한 기술은 또한 더 도전 에와 같은 기술을 통해 조작 대상으로 utero.
그럼에도 불구 하 고, 마우스 배아 hindbrain은 정교 하 게 성체를 제어 하는 분자 및 세포 메커니즘 정의 적합 합니다. 첫째, 마우스 hindbrain의 분석, 많은 경우에 정보를 제공할 더 낮은 척추 동물을 공부를 통해 얻은 것 보다 인간 개발에 관련 된. 또한, 유전자 변형된 마우스 긴장의 광대 한 수 있습니다 사용할 수 있는 하나 운명 murine NPCs 매핑 또는 관련 유전자의 제정 또는 조건부 돌연변이 체 대립 유전자와 규제 메커니즘을 변경. 마지막으로, 그것은 최근에 보였다 그 microinjection 창시자 비보 전 심 실 hindbrain의 hindbrain 전인대 속도 론14의 적어도 간단한 검사를 허용. 그러나, 현재, 아주 작은 spatiotemporal 조직 및 전체 기관 컨텍스트에서 hindbrain NPCs의 행동에 대 한 알려져 있다.
여기, wholemount 준비와 조직 섹션에서 포유류 NPC 행동을 분석 하기 위한 강력한 모델로 hindbrain 사용할 간단 하 고 빠른 방법을 설명 합니다. 우리는 추가 프로토콜을 사용 하 여 immunolabeling 다른 신생 매개 변수를 공부에 대 한 프로세스 hindbrain 샘플 추가 양적 역전사 (qRT) 등 다운스트림 분자 응용 프로그램에 대 한 제공-PCR.
Protocol
모든 동물 작품 영국 홈 오피스 및 로컬 윤리 지침에 따라 수행 되었다.
1입니다. 단계와 타이밍의 요약
- 배아 일 (전자) 9.5 e13.5 임신;를 조사 생물학 질문에 대답 하는 적합 한 스트레인에서 성인 쥐의 초과 matings를 수행 12-15 일이 필요합니다.
- 선택적으로, 준비 5-브로 모-2'-deoxyuridine (BrdU) / deoxyuridine (듀)-5-ethynyl-2' 솔루션 수행 주입 (프로토콜 섹션 2); 필요 합니다 ~ 전날 또는 듀/BrdU 라벨의 원하는 길이 따라 배아 격리의 하루에 1 시간.
- 수행 하는 고립과 hindbrain 절 개 태아 (프로토콜 섹션 3); 필요 합니다 ~ 10 분/태아.
- 수행 하는 wholemount 면역 형광 라벨 (프로토콜 섹션 4); 3 일이 필요합니다.
- 부동 섹션 면역 형광 라벨 (프로토콜 섹션 4)을 수행 하는 vibratome를 사용 하 여 섹션: 2 일 필요 합니다.
- cryostat를 사용 하 여 섹션과 면역 형광 라벨 cryosections (프로토콜 섹션 5);의 수행 2 일 필요합니다.
2. 주입 임신 여성 마우스 BrdU 또는 듀 (선택 사항)
- 분해 BrdU 또는 듀 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) 10 mg/mL 및 1 mg/mL의 농도에서 각각.
주의: BrdU와 듀는 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오. - 임신 마우스 무게와 계산 BrdU 또는 듀 솔루션 BrdU 100 mg/kg를 도달 하는 관리 되는 볼륨 또는 5 mg/kg에 듀.
- 라벨의 필요한 길이 따라 배아를 수집 하기 전에 어느 1 h 또는 1 일 복 경로 통해 BrdU 또는 듀 솔루션을 주입.
참고: S-단계에서 hindbrain 셀 시각화 1 h에 대 한 라벨. 1 일 라벨 시각화 hindbrain NPCs의 자손.
3. Hindbrains e9.5-e13.5 마우스 배아에서에서의 해 부
- (예를 들면, 자 궁 경부 전위) 필요한 임신 단계에서 윤리적으로 승인 된 절차를 사용 하 여 타임-임신 여성 마우스 안락사 날카로운가 위를 사용 하 여 복 막 구멍을 자르면 고 신중 하 게 자 궁을 삭제할. 20 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 60 m m 플라스틱 접시에 배아를 포함 하는 삭제 자 궁을 놓습니다.
참고: 무 균 기술을 필요 하지 않습니다. - 모든 추가 절 개 해 현미경을 사용 하 여 수행 합니다. Using 시계 집게 번호 5, 배아를 노출, 각 배아 탯 severing 하 여 놓고 노른자위 낭 제거 자 궁 근육 벽 눈물.
- 넓은 구멍 열기와 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 깨끗 한 플라스틱 접시에 각 배아를 전송 합니다.
- Using 시계 집게 번호 55, 머리 (그림 1E) 서버.
- 필요에 따라 조직 (예를 들어, 노 른 자 삭 또는 약 2mm 꼬리 끝의 ¼) 게놈 DNA 분리 및 후속 유전형의 작은 조각을 유지 합니다.
- Using 시계 집게 번호 55, 삭제할 hindbrain 병렬 하 고 즉시 얼굴 및 개 조직 (그림 1 층)에서 분리 hindbrain neuroepithelium 아래를 포함 하는 조직.
- 위치는 hindbrain 및 꼬리 머리 조직 등 쪽 고 얇은 조직 층 (지붕 격판덮개)에 의해 덮여 있는 4번째 심 실 식별. 조심 스럽게 시계 집게 번호 55 (그림 1G)을 사용 하 여 지붕 판 피어스와 집게, rostrally는 중간 선 따라 midbrain, 위로 이동 함께 멀리 초과 조직 껍질 그리고 caudally 후부 hindbrain 척수 (그림 1G 이상 ); hindbrain 이제 오픈 책 준비 (그림 1 H)에 노출 되어야 합니다.
- Hindbrains wholemount immunolabeling (옵션 1)에 대 한 준비.
- Using 시계 집게 번호 55, 신중 하 게 나무 랄 수 멀리 나머지 머리 mesenchyme 및 hindbrain 집게 (그림 1I)를 사용 하 여의 pial 측에 연결 된 모든 meninges. Hindbrain 조직 (그림 1 K)만 두고 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J)를 제거 합니다.
참고:이 절차의이 단계 하지 따라야 한다 e9.5 또는 e10.5, 시도 hindbrain neuroepithelium; 손상 가능성이 것 때문에 또한, meninges 제거 되지 않습니다 필수 hindbrain neuroepithelium immunolabeling에 대 한 항 체의 효율적인 침투 수 있도록이 단계에서 충분히 얇은 이기 때문에. 그러나이 단계,, 한다 meningeal 조직 통합, hindbrain neuroepithelium에 항 체 침투를 향상 시킬 때 이후, e11.5에서 따라야. 해 부는 얼음 처럼 차가운 PBS (각 hindbrain에 대 한 사용 깨끗 한 PBS)에서 수행 될 때 가장 쉬운.
- Using 시계 집게 번호 55, 신중 하 게 나무 랄 수 멀리 나머지 머리 mesenchyme 및 hindbrain 집게 (그림 1I)를 사용 하 여의 pial 측에 연결 된 모든 meninges. Hindbrain 조직 (그림 1 K)만 두고 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J)를 제거 합니다.
- Hindbrains vibratome 및 cryosectioning (옵션 2)에 대 한 준비
- 시계 겸 번호 55를 사용 하면, 제거할 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J).
참고: 아니에요 mesenchyme 및 meninges 단면 ( 그림 1I에서 같이)를 위한 hindbrains의 제거 하는 데 필요한.
- 시계 겸 번호 55를 사용 하면, 제거할 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J).
- 플라스틱 접시에서 둥근 바닥 2 mL 튜브 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 hindbrains를 전송 하 고 모든 PBS, 발음 갓 해 동된 4 %w / v 포 름 알 데히드 PBS에 녹아 있는 부드러운 동요와 4 ° C에서 2 시간에 대 한 수정.
주의: 포름알데히드는 독성이; 적절 한 보호를 착용 하십시오. - Hindbrains 3 배 시간 PBS와 린스. Immunolabeling 2-3 일 이내에 시작 됩니다 또는-20° C에 저장을 위해 100% 메탄올을 전송 하기 전에 5 분 동안 50% methanol/50% PBS와 PBS를 대체 하는 경우 PBS에 4 ° C에서 저장
4. Wholemount 면역 형광 검사
- 필요한 경우, 순차적으로 감소 하는 5 분 동안 실 온 (RT)에서 (예를 들어, 75% 메탄올, 50% 메탄올, 25% 메탄올) PBS에 메탄올의 희석에 hindbrains를 rehydrate 하 고 PBS에 전송.
참고: 메탄올의 등급된 시리즈는 부드럽게 hindbrains를 rehydrate 하 고 적절 한 조직 보존을 보장 합니다. - 0.1%를 포함 하는 PBS에 4 ° C에서 30 분 동안 hindbrains를 permeabilize Triton X-100 (PBT) 부드러운 동요와 함께.
- PBT 포함 된 부드러운 동요와 함께 10% 열 비활성화 염소 혈 청에서에서 4 ° C에서 1 시간에 대 한 hindbrains를 품 어.
참고: 2 차 항 체에 제기 했다 호스트 종에서 혈 청을 사용 합니다. 염소에 1 차 항 체 혈 청 무료에서 품 어 대 한 단백질 차단, 예를 들어 5% 소 혈 청 알 부 민 PBS 또는 적당 한 상업적인 대안에 ( 재료의 표참조). 이 일반적인 염소에서 1 차 항 체를 사용 하는 경우 자주 관찰 얼룩을 줄일 것입니다. - Hindbrains 1% 열 비활성화 세럼과 부드러운 동요와 1 차 항 체를 포함 하는 PBT에서 4 ° C에서 하룻밤을 품 어 (예를 들어, 토끼 안티 인 히스톤 H3 [pHH3] 희석 1:400).
참고: 염소에서 기본 항 체, 혈 청 하지 않고 PBT를 사용 합니다. - 4 ° c 5는 hindbrains를 씻어 1 h PBT와 배.
- PBT 적절 한 fluorophore 활용 된 이차 항 체 (예를 들면, 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488) PBT 사용 기본 항 체에 대 한 대상에서 1: 200에서 포함에 4 ° C에서 하룻밤 hindbrains를 품 어. Photobleaching에서 fluorophores를 보호 하기 위해 여기 hindbrains 어둠 속에서 계속.
참고: 염소에서 1 차 항 체에 대 한 일반적인 얼룩을 줄이기 위해 2 차 항 체의 항 염소 Fab 조각을 사용 합니다. - 4 ° c 5는 hindbrains를 씻어 1 h PBT와 배.
- 항 체 바인딩의 장기 보존을 위한 RT에서 15 분 동안 4% 포름알데히드 PBS에 있는 hindbrains 접미사 짧게 PBS에 두 번 씻어.
- 검은 전기 테이프의 2 개의 층으로 유리 현미경 슬라이드 커버 하 고 작은 사각형 하나의 hindbrain를 충분히 큰 주머니를 만들 계층된 테이프에서 삭제할.
- 각 hindbrain 파스퇴르 피 펫으로 주머니에 전송, 과잉 액체를 제거 하 고 추가 적절 한 antifade 시 약 주머니는 coverslip에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 유리 coverslip로 천천히 그것을 취재 하기 전에. coverslip 봉인 하 고 매니큐어의 얇은 층을 가진 슬라이드에 부착. 이미지 수집 (프로토콜 섹션 7)까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
5입니다. Vibratome 단면 및 부동 섹션 면역 형광 검사
- 4.1 단계에서 설명한 대로 필요한 경우 메탄올에서 hindbrains rehydrate.
- 증류수에 녹은 3 %w / v agarose에 hindbrains를 포함 합니다.
참고: 녹은 agarose hindbrain에 열 손상을 방지 하기 위해 포함 하기 전에 짧게 약 55 ° C에 냉각 허용 합니다. - vibratome을 사용 하 여 70 µ m의 두께로 가로 hindbrain 섹션을 잘라. 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 24-잘 접시의 한 잘에는 붓으로 갓 커트 각 섹션을 전송 합니다.
- 4.2-4.7, 단계에서 설명한 대로 부동 섹션 라벨 하지만 단계를 다음과 같이 수정: 세척 부동 섹션 4 ° C에서 3 x PBT와 15 분 각, 2 h, 2 차 항 체에 대 한 보육 시간을 단축 하 고 실시간에 이차 항 체에 품 어
- 필요한 경우, 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 다른 epitopes에 대 한 항 체와 라벨, 후 듀+ 핵은 듀 라벨 제조업체의 지침에 따라 장비를 사용 하 여 검색. 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 칵테일 반응에서 부동 섹션을 품 어. 세척 hindbrain 섹션 4 ° C에서 15 분 동안 PBT와 3 배.
- 필요한 경우, 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 다른 epitopes에 대 한 라벨, 후 감지 BrdU+ 핵 다음과 같습니다.
- 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 2 N 염 산에 부동 섹션을 품 어.
- 두 번 5 분 동안 각 RT에 염 산을 중화 하는 어둠 속에서 0.1 M 나트륨 붕 산 염 버퍼 pH 8.5에서에서 부동 섹션을 품 어.
- 부동 섹션 3 짧게 x PBS에 4 ° c.에 세척
- 면역 형광 검사 BrdU 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 대 한 라벨을 수행 합니다.
- 10 µ g/mL 4', counterstain 세포 핵에 PBS에서 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)에 실시간에 2 분 동안 부동 섹션을 품 어.
- 실시간에서 15 분 동안 4% 포름알데히드에 부동 섹션 후 위
- PBS에서 짧게 부동 섹션을 씻어. 신중 하 게 유리 현미경 슬라이드는 페인트 브러시를 사용 하 여 부동 섹션 전송. 초과 PBS 압 종이 또는 직물을 사용 하 여 섹션 주위를 청소 하십시오.
- 섹션 사용 하 여 PBS에 커버 80% 글리세롤 천천히 유리 coverslip 트랩 공기 방울을 피하기 위해 탑재 합니다. 이미지 수집 (7 단계)까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
6. cryostat 단면화 및 Cryosection 면역 형광 라벨
- 4.1 단계에서 설명한 대로 필요한 경우 메탄올에서 hindbrains rehydrate.
- Hindbrains cryoprotect hindbrains 동결 이전에 PBS에서 30 %w / v 자당에서 품 어.
참고: Hindbrains 그들은 일반적으로 ≤ 2 h 하는 관의 바닥에 침 몰 하는 때 동결에 대 한 준비가 e9.5 10.5 hindbrains 및 3-6 h e11.5 13.5 hindbrains. - 잠수함 복합 광학 절삭 온도에 hindbrains (10 월) 및-40 ° C와-50 ° C에서 드라이 아이스 냉각 isopentane를 10 월에 hindbrains를 포함 하는 금형을 전송 하 여 신속 하 게 동결.
참고: 고정 된, 포함 된 hindbrains는-20 ° C 단기 및 장기 단면까지 보기 위해-80 ° C에 저장할 수 있습니다. - Cryostat 및 전송 정전 접착제 현미경 슬라이드를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 가로 hindbrain 섹션을 잘라.
참고: Hindbrain cryosections-20 ° C 단기 및 장기 라벨까지 보기 위해-80 ° C에 저장할 수 있습니다. - 슬라이드 슬라이드 섹션 건조 15 분 RT에서 품 어. PBS 가진 cryosections 세척 디졸브 10 월 및 마크 cryosections PAP 펜을 사용 하 여 주위 소수 성 장벽. 5.4-5.8 단계를 반복 합니다.
- 5.10 글리세롤 대신 폴 리 비닐 알코올 기반 설치 매체를 사용 하 여 단계를 반복 합니다.
7. 이미지 수집
- Epifluorescent 또는 수성 미디어 탑재 슬라이드 및 광학 필터 fluorophores immunolabeling 사용에 대 한 적합 한 적합 한 렌즈를 장착 하는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 이미지 샘플.
- 전체 hindbrain 또는 hindbrain 섹션 이미지를 사용 하 여 렌즈를 10 배 확대 (예를 들어, 그림 2B);에 대 한 정량화에 대 한 hindbrains 영역을 시각화 하려면 40 배율 (예를 들어, 그림 2D) X 개별 셀을 시각화, 63 x 확대 (예를 들어, 그림 2C)와 함께 사용 하는 렌즈를 사용 합니다.
8. 다른 방법
- 3.8 단계, cytometry 응용 프로그램15에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 생산 하기 위해 고정 되지 않은 hindbrains 균질.
- 3.8 단계, 실시간 정량 (예를 들어, 16)에 대 한 단일 셀 정지에서 RNA 추출 하 고정된 hindbrains 균질.
참고: 확인 모든 시 약 및 장비 살 균과 RNase-무료 전체 RNA의 저하를 방지 하기 위해 유지 됩니다. - 3.8 단계, NPCs를 격리 하 여 neurospheres hindbrain NPC 행동17의 분석으로 그들을 생체 외에서 전파 고정된 hindbrains 균질.
주: 모든 시 약 및 장비 neurosphere 문화의 세균/곰 팡이 오염을 방지 하기 위해 살 균 보관 됩니다 확인 하십시오.
Representative Results
이 섹션에서는 wholemount 및 조직 섹션 분석을 통해 마우스 배아 hindbrain에 성체를 공부 하면 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다.
우리는 mitotic 마커 pHH3 시각화 나누어 NPCs VZ ( - 를그림 2B D)에 대 한 항 체와 microdissected hindbrain의 wholemount immunolabeling 그를 보여줍니다. 우리 쇼 pHH3+ NPCs 유사 분열 (그림 2C)의 여러 단계를 강조 하 고 확대. 우리는이 표기 방법은이 기관 (그림 2D)에 있는 NPC 유사 분열의 시간 과정을 관찰 하 hindbrain 개발의 여러 가지 연속 단계에 걸쳐 수행 적합 하 그림 있다.
우리는 분열 방향 mitotic NPCs (그림 3B), 순환의 pseudostratified, interkinetic 핵 이동 패턴의 시각화 듀 주입 후 가로 immunolabeled vibratome 섹션 hindbrain 1 h의 이미징 쇼 창시자18 (그림 3B, D), 그리고 전반적인 VZ 구조 (그림 3B - D). 참고 그 mitotic pHH3+ NPCs는 심 실 표면에만 존재 하 고 하지 더 basally (그림 3C)는 대조19개 더 전념된 NPCs의 기저 부 패턴.
우리는 또한 어떻게 사이클링 NPCs 및 차별화 된 그들의 자손 수 있습니다 표시 평가 NPC 혈통 진행 (그림 4) BrdU 또는 듀 보여 줍니다. 마우스 hindbrain BrdU와 Ki67 BrdU 주입 후 1 일의 가로 cryosections immunolabeling수와 사이클링 NPCs (그림 4A, B), neuroepithelium에 의하여의 수의 위치를 보여 줍니다 자동 갱신 NPCs Ki67의 비율을 계산 하 여 정의할 수 있습니다+ + BrdU (그림 4A, C) BrdU+ 셀 사이 세포.
마지막으로, 우리는 r c 2는 신경 관련 중간 필 라 멘 트 NPC endfeet (그림 5B)와 프로세스 (그림 5C) 시각화 nestin에 항 원에 대 한 hindbrain vibratome 섹션의 immunolabeling의 예를 보여줍니다. 얇은 cryosections, 보다는 오히려 Vibratome 섹션, 높은 분기 NPCs의 그리고 또한 전체 neuroepithelial 구조 향상 된 관측을 허용 한다.
그림 1 : 키 e11.5 마우스 배아에서 한 hindbrain의 해 부에 단계. (A - D) Hindbrain 서의 도식 묘사입니다. (A) 꼬리 머리 조직 빨간 점선 따라 절단 하 여 제거 됩니다. (B) 지붕 판 피어 싱 이며 다음 중간 선 (빨간색 세로선)를 따라 rostral와 꼬리 방향에서 떨어져 찢 어 그리고 hindbrain neuroepithelium을 옆으로. (C)는 neuroepithelium 두 구조 사이 집게를 삽입 한 후 meninges에서 들어올려서는 고 midbrain 및 척수 조직 빨간 점선 따라 집게와 조직을 절단 하 여 제거 됩니다. (D)이이 절차는 병합된 hindbrain을 생성합니다. (KE-) 이미지 캡처 hindbrain 서 절차의 주요 단계. (E) 태아는 점선을 따라 절단 하 여 참입니다. (F)는 hindbrain 지붕 접시로 4번째 심 excised 및 점선 따라 severing 하 여 머리에서 분리. 작은 구멍은 지붕 판 (별표)에 피어 싱 전에 (G) 4번째 심 실 방향의 위쪽입니다. 구멍은 중간 선 (화살표)는 hindbrain 노출에 따라 신중 하 게 rostrally와 caudally 조직을 박 리 하 여 확대 됩니다. hindbrain 이며 아래로 위치 pial 쪽 오픈 책 준비에 접어 왼쪽 (H; 블랙 화살촉 나타냅니다 hindbrain 신경 조직). hindbrain에 필요한 경우 wholemount immunolabeling, pial 막 부드럽게 캐 겸 자 (나)를 사용 하 여 주변의 meningeal 세포 막에서 hindbrain neuroepithelium에 의해 제거 됩니다. 초과 midbrain (mb) 및 척수 (sc) 조직 제거 (점선 J에)은 hindbrain (K)을. 눈금 막대: 500 µ m (E), (F - K) 300 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Wholemount immunolabeling는 hindbrain에 걸쳐 NPC mitoses 척도를 사용할 수 있습니다. (A) 회로도 hindbrain 심 실 계층에 mitotic NPCs의 en 얼굴 이미지를 보여주는 V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. (B) 공초점 타일 스캔 z 스택 e10.5 hindbrain mitotic 마커 pHH3 (빨간색)에 대 한 wholemount immunolabeling 다음의. 백색 상자 (D)에 두 번째 패널에 높은 확대에 표시 된 영역을 나타냅니다. (C) 사전 anaphase (흰색 화살표) 및 anaphase (검은 화살표) mitotic 수치 mitotic NPCs. (D) 시간 과정 wholemount pHH3 e9.5-13.5에서 라벨의 전체 코 호트 내에서 구별할 수 있습니다. 스케일 바: (B); 500 µ m 20 µ m (C); (D) µ 하 m 100 이다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Rostral hindbrain에 그들의 새싹 내 자전거 NPCs. (A) 회로도 mitotic (녹색)와 S-위상 (레드) Npc hindbrain 실의 표면에 뇌 영역에서의 위치를 각각 묘사 hindbrain 통해 가상 횡단면 더 높은 확대 오른쪽에 표시 됩니다. 검은색 화살표 차별화 영역으로 세포 주기 종료 NPC 자손의 이동의 방향을 나타냅니다. 1 h 듀 펄스; 받은 배아에서 부동 e11.0 hindbrain 섹션의 (B) 공초점 z 스택 immunolabeling pHH3와 듀 각각 mitotic (녹색)와 S-위상 (레드) Npc를 시각화 하기 위해 사용 되었다. Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. 흰색 상자에 표시 된 지역 삽입; 더 높은 확대에 표시 됩니다. 화살표는 심 실 표면에 상대적인 anaphase에서 NPC의 분열 비행기를 나타냅니다. (C) 단일 채널 pHH3 immunolabeling만을 표시. Mitotic NPCs; 시안색 화살촉으로 표시 됩니다. 기저 부의 부족은 Δ. (D) 단일 채널 듀 라벨만 표시로 표시 됩니다. 듀+ NPCs 채택 그들의 interkinetic 핵 이동으로 인해 pseudostratified 배포 합니다. 대표 주황색 선으로 표시 된 대로 NPCs 실의 표면에서 이동 거리를 측정할 수 있습니다. 스케일 바:에 100 µ m (B -D); (B)에서 삽입에 개의 하 µ 10 m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Hindbrain NPC 자체 갱신 용량을 확인 Ki67 라벨와 함께 결합 BrdU. (A) Confocal z 스택 Ki67 (녹색) BrdU (빨간색) BrdU 1 일 다음 펄스에 대 한 라벨링 후 e10.5 hindbrain cryosection의. 심 실 영역에서 두 배 긍정적인 세포 Ki67 라벨에 표시 된 대로 BrdU를 통합 하 고 아직도 세포 주기를 통해 이동 하는 Npc는. 총 BrdU+ 인구 사이 이중 표시 된 셀의 비율 자체 갱신 NPCs. (B, C)의 비율을 나타냅니다 단일 채널 Ki67 표시 (B)와 (C) BrdU immunolabeling만. BrdU+ 셀을 Ki67 부족 하 고 따라서 세포 주기 종료 가능성이 (A,C) 시안색 화살촉으로 표시 됩니다. Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. 눈금 막대: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : Nestin immunolabeling 시각화 NPC 프로세스와 endfeet. A - ( C) RC2 nestin 신경 중간 필 라 멘 트에는 epitope를 인식에 대 한 면역 형광 hindbrain neuroepithelium에 걸쳐 NPC 형태를 보여 줍니다. RC2 immunolabeling; 다음 e11.5 hindbrain에서 부동 섹션의 (A) Confocal z 스택 박스형된 영역에서 더 높은 확대에 표시 됩니다 (B, B', 꼭대기/심 실 지역)와 (C, C'; 기저 지역). Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. (B, C) (A); 박스형 영역의 confocal z 스택 단일 광학 섹션에 표시 됩니다 (B', C'), 각각. 심 실 표면에 고정 하는 NPC 꼭대기 endfoot (B')에 화살표로 표시 됩니다. 단일 및 fasciculated NPC 프로세스에서 흰색과 검은색 화살촉으로 표시 됩니다 (C'), 각각. 스케일 바: 100 µ m, (A); (B, C)에 대 한 개의 하 µ 25 m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜 개발 성체의 메커니즘 연구 모델로 마우스 배아 hindbrain를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 다양 한 다른 immunolabeling 메서드를 사용 하 여, hindbrain NPCs 구상 될 수 있다 그리고 그들의 수 정량 조직 섹션에서 나 기관 wholemounts 전. 절 개 플랫 해부학의 용이성은 hindbrain 기관 전체 성체 패턴에 대 한 정보를 수집 하는 '열린 책' 준비에 몇 군데 될 수 보장 합니다.
우리 더는 NPC 형태학 및 세포 주기 관련 NPC 위치 구상 될 수 있다 쉽게 부동에 표시-또는 cryosections는 hindbrain의. 두 동작 이전 포유류 telencephalon20에서 수행 된 새로운 조상 인구 정의 악용 될 수 있습니다. 예를 들어 초기 형성 Sox2+ neuroepithelia 및 Pax6+ 꼭대기 방사형 명과 hindbrain21,22에 존재 하지만 hindbrain 부족 Tbr2+ 기저 창시자3 .
여기에 설명 된 프로토콜 또한 라이브 이미징 및 혈통 추적 고정된 조직에서의 형광 라벨 특정 NPC 모집단의 동작을 관찰 하는 것 적용할 수 있습니다. 이 얻을 수 있습니다, 예를 들어 마우스 들고 tamoxifen을 유도할 수 있는 Sox1 iCreERT2 transgene와 Rosa26tdTomato 기자23에서 hindbrains를 공부 하 여.
Murine 성체의 지식 강화, 이외는 hindbrain 공부 수 있습니다 명료 종에 걸쳐 공유 되는 광범위 하 게 관련 neurogenic 메커니즘은 hindbrain 더 비슷할 것으로 예상 되는 높은 보존된 뇌 영역 이므로 사이는 개 보다 척 추가 있는 종.
Hindbrain 신생 개 신생23보다 비교적 짧은 시간 창 동안에 일어난다, 그것은 적절 하 게 비교 하기 위한 필요 개최 배아를 고려 하는 것이 중요. 따라서, 실험적인 바이어스 계산 하 고 그 hindbrain 분리 이전 배아에 somite 쌍의 수를 기록 하 여 피 한다. Hindbrain 조직 자체는 연약한과 집게 따라서 처리 해야 신중 하 게 머리 mesenchyme meninges;에서 hindbrain 조직 분리 하는 경우 '연습 실행'의 몇 따라서 귀중 한 배아의 해 부를 시도 하기 전에 권장 수 있습니다. 또한, hindbrains (피 펫의 여 수 수 확대의 끝을 절단 하 여 깨끗 한가 위)의 손상을 방지 하려면 집게 대신 넓은 구멍 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 다른 하나의 튜브에서 메시지를 전송 한다. 마지막으로, 비록 드문, S 상 Npc에 듀/BrdU 정관의 범위 수 있습니다 변수, 특히 짧은 (즉, 1 시간) 펄스 동안. 라벨 개선, 듀/BrdU 주사기에는 솔루션을 로드 하기 전에 제대로 해산 확인 하 고 복 막 구멍에 조심 스럽게 삽입 합니다. 사고, 피하 만든 같은 불 쌍 한 주사 지 나 듀/BrdU 솔루션을 트래핑 하 고 순환에 들어가기에서 방지.
Disclosures
작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.
Acknowledgments
우리는 마우스 축산에 대 한 안과의 UCL 학회에 생물 자원 단위의 직원과 타임된 matings 수행에 대 한 Vasiliki Chantzara 감사 합니다. 이 연구는 Wellcome 신뢰 조사 상 095623/Z/11/Z CR에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
| Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
| Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
| 29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
| Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
| Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
| Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
| Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
| 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
| Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
| Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
| Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
| Mowiol | Millipore | 475904 | |
| OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
| Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
| Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Thermometer | VWR | 620-0858 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |
References
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