检测暴露于有机氯农药的肝细胞线粒体功能的实验方案

Summary

了解环境有机氯农药（OCPs）对肝细胞线粒体功能的影响，对于探讨OCP引起代谢紊乱的机理十分重要。本文提出了检测肝线粒体功能的详细方法。

Abstract

本文提出了检测肝线粒体功能的详细方法，以便更好地了解肝细胞中环境有机氯农药（OCPs）引起的代谢紊乱的原因。HepG2细胞在同等剂量的内部接触下，在24小时内暴露在β-六氯环丙烷（+-六氯环丙烷）中。通过透射电子显微镜（TEM）对肝细胞的超结构进行了检查，以显示线粒体的损伤。线粒体功能通过线粒体荧光强度、腺苷5'-三磷酸（ATP）水平、氧消耗率（OCR）和线粒体膜电位（MMP）进一步评估，这些细胞在使用β-HCH孵育的HpG2细胞中。线粒体荧光强度后染色线粒体绿色荧光探针观察到荧光显微镜。荧光素-荧光酶反应用于确定ATP水平。在流式细胞学下检测出MMP。使用细胞外通量分析仪测量OCR。总之，这些协议用于检测肝细胞中的线粒体功能，以调查线粒体损伤。

Introduction

有机氯农药（OCPs）对健康的影响，如生殖干扰、免疫毒性、代谢变化等，此前已研究^{过1、2、3。,2,3}检测细胞代谢和发现线粒体功能障碍的方法使科学家能够理解线粒体功能的作用（即:，线粒体STAT3水平，乳酸，丙酮酸盐，乳酸与丙酮酸盐比，共酶Q10，线粒体质子泄漏，生物能量，生物发生和动力学）在老化，肥胖，糖尿病，心血管功能，癌症和安全毒性^4,54，5，6，7^,6等领域7。本文介绍了评估OCPs引起的线粒体功能障碍的方法。

我们向+-六氯环氧烷（+-H环环）暴露，一种具有代表性的OCPs，剂量相当于人体内部接触24小时。首先，TEM用于观察肝细胞的超结构，如核、线粒体和内质电^8。与普通显微镜相比，TEM能够探索细胞和细胞成分（细胞系或组织）的二、三D超结构、形态、化学成分以及在现代科学技术中起关键作用的自然或人工材料的功能。线粒体功能通过线粒体荧光强度、腺苷5'-三磷酸（ATP）水平、耗氧率（OCR）和线粒体膜电位（MMP）进一步评估，在使用β-HCH孵育的HpG2细胞中。Mito-跟踪器绿色是一种线粒体绿色荧光探针，可用于活细胞线粒体特异性荧光染色。肝细胞中的线粒体被线粒体染色的线托跟踪绿色溶液和线粒体荧光强度，数量和模式观察到与共理显微镜⁹。线粒体绿色荧光探针可用于染色活细胞。与罗丹胺123或JC-1相比，线粒体绿色荧光探针不依赖于线粒体染色的线粒体膜潜力。ATP水平由荧光素-荧光素试剂盒确定，并由蛋白质浓度进行规范化。ATP 检测试剂盒可用于检测常见溶液、细胞或组织中的 ATP 水平。此试剂盒基于萤火虫荧光素催化的荧光酶，当需要 ATP 提供能量时，可产生荧光。当萤火虫荧光酶和荧光素过量时，在一定浓度范围内，荧光的产生与ATP的浓度成正比。此外，该套件还经过专门设计，以优化 ATP 的化学发光。ATP作为最重要的能量分子，在细胞的各种生理或病理过程中起着重要的作用。ATP水平的变化可以反映细胞功能的缺陷，特别是线粒体能量的产生。通常在凋亡、坏死或处于一定毒性状态下，细胞ATP水平降低 ^10。JC-1 的 MSP 检测套件是使用 JC-1 作为荧光探针的试剂盒，可快速、灵敏地检测细胞、组织或纯化 MMP。它可用于早期发现凋亡。阳离子染料JC-1是一种荧光探针，用于检测MMP，可根据绿色和红色荧光比的变化在流式细胞仪下进行分析。当 MMP 高时，JC-1 在线粒体的基质中聚合，形成聚合物（J-聚合），产生红色荧光。当MMP低时，JC-1不能积累，形成单体产生绿色荧光¹¹。因此，红与绿荧光的比例可以反映MMP的水平。细胞的OCR是正常细胞功能^{12的关键指标}。它是研究线粒体功能的参数。细胞线粒体压力测试试剂盒为分析线粒体功能的关键参数提供了一种稳定的方法。该试剂盒提供质量控制和预测试剂，以及执行细胞线粒体应激测试的标准方法。它可用于检测所有细胞类型，包括原细胞、细胞系、悬浮细胞，也可用于小岛、线虫、酵母和孤立的线粒体。

OCR 测量可以提供对细胞的生理状态或变化的宝贵见解。它由细胞外通量分析仪确定，以检测呼吸基线、质子泄漏、最大呼吸、ATP 周转量和储备能力。简言之，在对OCR进行基线测量后，每井依次添加寡霉素（ATP，FCCP（线粒体氧化磷酸化未结合）和抗霉素甲/罗酮（氧气消耗抑制剂）后，检测到OCR。

为了促进在体外检测肝细胞中线粒体功能的更具体的方案，我们在此介绍TEM、共生显微镜、发光计、流细胞仪和细胞外通量分析仪的实验，并在未来用于线粒体损伤相关不良结果研究。

Protocol

所有实验和实验规程都按照有关准则和规定进行，并经南京医科大学地方伦理委员会批准。

1. TEM 的线粒体超结构

1. 收集 HepG2 细胞
   1. 种子 HepG2 细胞在 100 毫米的菜肴。储存在37°C和5%CO2₂。
   2. 1.5 mLEP 管中具有 0.25% EDTA 的消化细胞。
   3. 在室温 （RT） 下以 1000 x g 的离心机 3 分钟。丢弃上一杯。
   4. 收集 4-6 x 10⁵ HepG2 细胞。
2. 加入1 mL的5%谷胱甘肽（溶剂:双蒸馏水）与移液器和孵育在4°C2小时。
3. 添加和洗涤4个变化1 mL的磷酸盐缓冲液（含_{Na 2}HPO_4，KH2PO_4，NaCl和KCl，pH 7.4），各15分钟。用移液器吸出磷酸盐缓冲液。
4. 加入200μm的1%的1%的硅（溶剂:双蒸馏水），在4°C下孵育2小时到黑色样品中。
   注意: Osmium 是剧毒和挥发性物质。应在药柜中小心操作。
5. 加入并洗涤2个1mL磷酸盐缓冲液，每个5分钟。吸出磷酸盐缓冲液。
6. 在 1.5 mL EP 管中染色 2% 醋酸尿酸溶液（溶剂:双蒸馏水和醋酸），2 小时。
7. 脱水和淹没通过50%丙酮，70%丙酮，90%丙酮（溶剂:双蒸馏水），2个绝对丙酮的变化，每个15分钟。
8. 在RT下渗透2滴丙酮（100%）/嵌入剂（1:1），1.5小时。Epon812嵌入剂，配方如下:A:Epon812、62 mL和DDSA，100 mL;B: Epon812， 100 mL 和 MNA 89 mL.A:B=2:8（v:v，冬天），A:B=1:9（v:v，夏天）。嵌入嵌入模具（带格子格的软塑料板）。
9. 在37°C连续孵育12小时，45°C12小时，然后60°C孵育48小时。
10. 通过超薄截面机和 TEM（2 μm 和 500 nm）准备和观察超薄截面（最大区域不能超过 0.5 mm × 0.3 mm）。

2. 线粒体荧光强度检测

1. 种子 2x 10⁴ HepG2 细胞在 6 孔板。添加+-六氯氯氯二，24小时。
2. 加入无水DMSO，形成1 mM线粒体绿色荧光探针的最终浓度。
3. 将1 mL线粒体绿色荧光探针溶液（最终浓度:200 nM）加入到6孔板的每个孔中，在37°C下孵育45分钟。
4. 取出线粒体绿色荧光探针溶液，在成像前在37°C下加入新鲜准备好的细胞培养基（DMEM）。
5. 使用荧光显微镜（10倍）观察线粒体绿色荧光。检测时最大激发波长为 490 nm，最大发射波长为 516 nm。

3. 细胞ATP水平的测定

1. 种子 HepG2 细胞在 6 孔板。添加+-六氯氯氯二，24小时。
2. 从荧光素-荧光素ATP检测试剂盒中加入200μL的解液缓冲液，加入到6孔板的每个孔中。在 4 °C 下以 12，000 x g 的离心机 5 分钟，用移液器将上流液收集到新管中。
3. ATP 检测试剂以 1:5 的比例稀释 ATP 检测试剂，作为 ATP 检测缓冲液。
4. 准备标准曲线测定:用 ATP Lysis 缓冲液将 0.5 mM 的 ATP 标准溶液稀释至 10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 μM。
5. 在RT的96井板中加入100μL的ATP检测缓冲液5分钟，并添加100μL的上流细胞，通过发光计（化学发光检测器）检测。通过标准曲线计算 ATP 浓度 （nmol/L）。
6. 使用多模读取器通过 BCA 蛋白质检测试剂盒检测蛋白质浓度。
   1. 准备标准曲线测定:用双蒸馏水将5mg/mL的蛋白质标准溶液稀释至0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5毫克/mL。
   2. 在96井板中加入1 μL的细胞上水，加入19μL的双蒸馏水。
   3. 为每一个井添加 200 μL 的 BCA 检测解决方案。在37°C下孵育30分钟。通过具有 562 nm 的多模读卡器检测 OD（光学密度）值。通过标准曲线计算蛋白质浓度（mg/mL）。
7. 纠正每毫克蛋白质浓度的ATP含量（单位:ATP浓度/蛋白质浓度，nmol/mg）。

4. JC-1的线粒体膜电位（MMP）评估

1. 收集在6孔板中播种的 HepG2 细胞。在 1.5 mL EP 管中具有 0.25% EDTA 的消化细胞，在 1000 x g 下离心 3 分钟，丢弃上一代并收集细胞。
2. 将 JC-1 （200X） 的 50 μL 添加到 8 mL 的蒸馏水中加入漩涡并混合。添加 2 mL JC-1 （5X） 染色缓冲液作为 JC-1 检测解决方案。
3. 在37°C下，用0.5 mL细胞培养基和0.5 mL的JC-1检测溶液的混合物孵育细胞20分钟。
4. 在 4 °C 下以 600 x g 离心 3 分钟。 丢弃上一杯。
5. 在 2 个变化的 JC-1 （1X） 染色缓冲液中冲洗 1 mL，在 600 x g 下离心机，在 4 °C 下 3 分钟。 并丢弃上一液。
6. 悬浮细胞在0.5 mL的JC-1（1X）染色缓冲液中，通过流式细胞仪进行分析，以检测绿色和红色荧光。检测到 JC-1 聚合物时，将激励光设置为 490 nm，将发射光设置为 530 nm。检测到 JC-1 聚合物时，将激发光设置为 525 nm，将发射光设置为 590 nm。

5. 耗氧率 （OCR） 测量

1. 96孔细胞培养微孔板中的胚胎 HepG2 细胞，密度为每孔 4500 个细胞/100 μL。确保细胞在24小时后覆盖每一个井。
2. 根据先前的文献^13，将适当体积的试剂加入到适当的注射口中。端口 A:25 μL 1 μM 的寡霉素（ATP 对口）;端口 B:25 μL 0.75 μM 的 FCCP（电子节气门控制、ETC 加速器）;端口 C:25 μL 0.5 的 μM 抗霉素 A/rotenone（线粒体抑制剂 A 和线粒体抑制剂 B）。
3. 将墨盒存放在 37°C 培养箱中，在_{准备使用之前没有 CO2。}
4. 通过从每一个井中去除运行介质并添加到新的 DMEM 中，对电池板进行介质更换。每一个井的最终体积为180μL。
5. 在检测前将细胞板存放在37°C的培养箱_{中，无CO21} 小时。
6. 通过软件自动记录 OCR。
   1. 打开 OCR 软件。
   2. 在"应用"下拉菜单中选择"单元格 Mito 压力测试工具包"。
   3. 单击"开始应用"按钮。
   4. 单击"运行压力测试"按钮。将显示"单元格压力测试设置"屏幕。
   5. 执行以下步骤:
      1. 在"细胞种子 #框"中输入每井的种子细胞数。
      2. 在"平均基础 OCR"框中输入平均 OCR。
      3. 输入每个试剂的最终工作浓度并注射试剂。
         注:在优化细胞种子浓度时，在运行优化分析之前，应检测到细胞的平均基底 OCR 值。
      4. 单击"下一步"按钮。将显示组信息屏幕。
      5. 通过选择颜色并给出名称，然后单击相应的井，将组分配给未分配的井。
         注:在进行细胞米托压力测试之前，不同的组被定义为不同的治疗。当压力测试运行时，所有微孔都会得到相同的试剂注射。
      6. 单击"下一步"按钮。将显示"压力测试喷射布局"屏幕。
      7. 单击"开始"。压力测试现在在分析器上运行。运行结束时，按照软件中的点 s，取出并丢弃墨盒和电池板。

Results

HepG2细胞暴露在+-六氯上细胞中的线粒体受到明显损伤。散落的线粒体有轻微扩张，形状不规则，线粒体脊消失，线粒体结构相对异常（图1）。

平均线粒体绿色荧光强度，代表线粒体，在接触+-HCH的 HepG2 细胞（图2）和ATP水平（图3） 中下降。荧光强度和ATP水平随着暴露浓度的增加而逐渐减少。潜在的，线粒体数量的减少，或受损的线粒体，导致观察到的线粒体荧光强度，从而减少ATP的产量。

流式细胞学结果表明，+-六氯环线组红/绿JC-1荧光比明显低于控制值（图4）。HepG2细胞的OCR在+-HC...

Discussion

检测协议成功的关键是使用各种实验方法，这些实验方法涵盖了从表型到机制的研究。在这项研究中，HepG2细胞在DMEM中培养青霉素和链霉素和10%胎儿牛血清。当细胞达到40-50%汇合时，添加+-HCH（0，10，100纳克/mL）并孵育24小时。我们首先使用TEM，它显示了代表性的OCPs引起的肝细胞的超结构变化，+-HCH，显示了线粒体结构的损伤（图1）。)此外，还进行了荧光染色测定((（(图2），)荧光酶-荧光素ATP检测(（图3），JC-1测定（图4）和细胞线粒体应激检测（

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
透射电子显微镜	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	高对比度、高分辨率成像、低剂量观察和成像、低温观察、出色的分析性能、便利性和高性能的自动化
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green 是一种线粒体绿色荧光探针，可用于活细胞线粒体特异性荧光染色。
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	700B	设计紧凑、稳定、光程最短、光度高、光精度高、创新技术和精密扫描技术相结合，可产生完美的三维标本图像。
增强型 ATP 检测试剂盒	Beyotime	S0027	增强型 ATP 检测试剂盒可用于检测常见溶液、细胞或组织中的 ATP（5'-三磷酸腺苷）水平。细胞和组织样品可分液完成样品制备，检测灵敏度可达0.1nmol/L，化学发光可维持30分钟。
光度计	Berthold	Centro LB 960	光度计是化学发光检测器，测试样品本身可以很轻，不需要刺激。光度计是检测化学发光的仪器。
BCA 蛋白检测试剂盒	Beyotime	P0012	BCA 蛋白检测试剂盒是检测蛋白浓度最常用的方法之一。
多功能微孔板检测	TECAN	InfiniteM200	多功能微孔板检测仪用于检测蛋白质一致性。