DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

Yazan Haddad; Simona Dostalova; Jiri Kudr; Ondrej Zitka; Zbynek Heger; Vojtech Adam

doi:10.3791/56815

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Methodenartikel

DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

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DOI:

10.3791/56815

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9. November 2017

Yazan Haddad¹^,² , Simona Dostalova¹^,² , Jiri Kudr¹^,² , Ondrej Zitka¹^,² , Zbynek Heger¹^,² , Vojtech Adam¹^,²

¹Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, ²Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von magnetischen Partikeln und Bewertung ihrer DNA-bindende Eigenschaften über dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung. Diese Methode konzentriert sich auf die Überwachung von Änderungen der Partikelgröße, ihre Polydispersität und Zeta-Potential der Partikeloberfläche die spielen wichtige Rolle bei der Bindung von Materialien wie DNA.

Zusammenfassung

Isolierung der DNA mit Hilfe magnetischer Partikel ist ein Feld von hoher Bedeutung in der Biotechnologie und Molekularbiologie. Dieses Protokoll beschreibt die Auswertung der DNA-Magnetteilchen über dynamische Lichtstreuung (DLS) und elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) verbindlich. Analyse von DLS liefert wertvolle Informationen über die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel wie Partikelgröße, Polydispersität und Zetapotenzial. Letzterer beschreibt die Oberflächenladung des Teilchens die Hauptrolle in elektrostatische Bindung von Materialien wie DNA spielt. Eine vergleichende Analyse nutzt hier drei chemische Modifikationen von Nanopartikeln und Mikropartikel und ihre Auswirkungen auf die DNA-Bindung und Elution. Chemische Veränderungen durch verzweigte Polyethylenimine, Tetraethylblei Orthosilicate und (3-Aminopropyl) Triethoxysilane untersucht werden. Da DNA eine negative Ladung aufweist, ist zu erwarten, dass Zeta-Potential der Partikeloberfläche bei der Bindung von DNA sinkt. Bildung von Clustern sollte auch Auswirkungen auf die Partikelgröße. Um die Effizienz dieser Partikel isoliert und Elution der DNA zu untersuchen, werden die Partikel mit DNA in niedrigen pH-Wert (~ 6), hohe Ionenstärke und Dehydrierung Umwelt gemischt. Partikel werden auf Magneten gewaschen und dann ist die DNA von Tris-HCl-Puffer eluiert (pH = 8). DNA-Kopienzahl ist anhand quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geschätzt. Zeta-Potential, Partikelgröße, Polydispersität und quantitative PCR-Daten werden ausgewertet und verglichen. DLS ist eine aufschlussreiche und die Unterstützung der Analysemethode, die eine neue Perspektive auf den Prozess der Überprüfung der Partikel für die DNA-Isolierung hinzufügt.

Einleitung

DNA-Isolierung ist einer der wichtigsten Schritte in der molekularen Biologie. Die Entwicklung von Nukleinsäure-Extraktionsmethoden hat großen Einfluss auf den aufstrebenden Bereichen Genomik, Metagenomik, Epigenetik und Transkriptom. Es gibt eine Vielzahl von biotechnologischen Anwendungen für die DNA-Isolierung einschließlich medizinische (forensische/Diagnose-Tools und prognostische Biomarker) und Umweltanwendungen (metagenomische Biodiversität, Erreger Prävalenz und Überwachung). Steigende Nachfrage, zu reinigen und DNA zu isolieren, aus verschiedenen Materialien und in unterschiedlichen Maßstäben wie Blut, Urin, Boden, Holz und andere Arten von Proben stattgefund....