Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

Published: January 18, 2018 doi: 10.3791/56832
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Dermatology, University of California Davis School of Medicine, University of California, Davis, 2Center for Biophotonics, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis

Summary

Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Abstract

Es ist bekannt, dass räumliche und zeitliche Regelung der Gene Bestandteil ist des Regierens richtige Genexpression. Daher ist es von unschätzbarem Wert zu verstehen, wo und wann Transkription in nuklearen Raum stattfindet und die Beziehung zwischen Episomes innerhalb der gleichen Zellkern infiziert zu visualisieren. Hier, Immunfluoreszenz (IFA) und RNA-Fische wurden Combinedto identifizieren aktiv Transkription Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) Episomes. Durch Färbung KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA), ist es möglich, zu finden, wo virale Episomes im Zellkern vorhanden. Darüber hinaus können durch die Gestaltung von RNA-FISH-Sonden, um der Intron-Region eines viralen Gens zu Zielen, die nur während der produktiven Infektion ausgedrückt wird, im Entstehen begriffenen RNA-Transkripte befinden. Mit dieser Kombination aus molekularen Sonden, ist es möglich, die Montage von großen virale Transkription Fabriken visualisieren und analysieren die räumlichen Regulierung der viralen Genexpression während KSHV Reaktivierung. Durch die Einbeziehung Anti-RNA-Polymerase II Antikörper Färbung, kann man auch die Assoziation zwischen RNA-Polymerase II (RNAPII)-Aggregation und KSHV Transkription bei Reaktivierung sichtbar machen.

Introduction

Es ist immer deutlicher geworden, dass die räumlich-zeitliche Organisation des Kerns eine wichtige Rolle spielt bei der Modulation der fein abgestimmten Genexpression in den Eukaryotes. Die meisten Gewebe spezifische Gene über viele Chromosomen verteilt sind und synchron geregelt werden, um auf bestimmte Reize in einer koordinierten Art und Weise1reagieren müssen. Zellen bauen aktiv Chromatin Naben (ACH) als eine Möglichkeit der Zusammenführung von Genen und deren Cis-regulatorische Komponenten auf einem bestimmten nuklearen Raum1.

Es wurde auch durch verschiedene Studien nachgewiesen, dass obwohl der Kern sehr dicht und Viskose scheint, biologisch aktive Molekülen Nucleus ziemlich schnell per Diffusion2durchlaufen können. Als Folge dieser ephemeren Eigenschaft springen"" die meisten DNA-bindende Proteine von verbindlichen Website Website, Gefühl, ihren Weg um die nuklearen Raum, ermöglicht eine sehr anpassungsfähige und vielseitige Kern2als verbindlich.

Trotz dieses dynamische Verhalten von Biomolekülen innerhalb des Zellkerns, nukleare Einrichtungen ohne Membranen wie z. B. (aber nicht beschränkt auf) die Nukleolus, Cajal Körper und Promyelocytic Leukämie nuklearen Einrichtungen (PML-NB) noch vorhanden sind. Es ist durch eine Vielzahl von Mechanismen wie DNA Tandemwiederholungen (Nukleolus), rRNA (Nukleolus) und Strukturproteinen wie coilin (Cajal Bodies) oder PML Proteine (PML-NB), die diese Konstrukte zusammen3,4,5 halten . Diese Strukturen und anderen Gemeinden wie Transkription Fabriken dienen als Gerüste, die erhöhen nicht nur die lokale Konzentration von erforderlichen Komponenten, sondern Regeln auch die Zusammensetzung von Proteinen und Nukleinsäuren in ihnen letztendlich schaffen eine zentraler Standort für effiziente Zellfunktionen6.

Wann und wo atomare Strukturen Form bietet eine Fülle von Informationen für Forscher studieren Epigenetik zu visualisieren. Aus Sicht der Virologie der Reaktivierung der latent infizierten Viren, z. B. KSHV, erheblich verändert die Landschaft des Kerns und Verteilung der nuklearen Enzyme, Transkription in erster Linie aus zellulären Genen auf virale Gene, letztlich zu verlagern, voll funktionsfähige virale Nachkommen7,8zu produzieren. Wie manipuliert KSHV zelluläre gen Ausdruck Maschinen, virale Genexpression zu erleichtern? Solche Informationen könnten auch Aufschluss über zeitliche zelluläre gen Regulationsmechanismen.

Wie alle anderen Herpesviren hat KSHV zwei Lebenszyklen lytischen Replikation und Latenz genannt. KSHV befindet sich in erster Linie in der Latenz-Phase, in der die meisten seiner viralen Gens Ausdruck zum Schweigen gebracht wird, außer Latenz Gene9,10verbunden. Während der Wartezeit, die KSHV produziert verbundene Latenz nuclear Antigen (LANA), die konstitutiv bindet das virale Genom und Anbindehaltung virale Chromatin der menschlichen Chromosom11. Wegen Lanas intime Beziehung mit das virale Genom ist es möglich, IFA und DAPI zu färben und zu lokalisieren, wo der viralen Episomes in Bezug auf die Host-Chromatin waren zu verwenden.

Um KSHV Reaktivierung auf der Ebene der einzelnen Episome und die Assoziation mit anderen viralen Episomes in einer infizierten Zelle zu untersuchen, wurde eine Strategie suchen aktiv Transkription viraler Chromatin in Situ gegründet. Dementsprechend wurden LANA und RNAPII IFA mit Intron-RNA-Fisch kombiniert, durch die Generierung von RNA-FISH-Sonden, die an der Intron-Region (genaue Sonde finden Sie Sequenzen in die Izumiya Lab neueste Veröffentlichung8) binden KSHV K-Rta-die wichtigsten virales Protein, das ist, notwendig und ausreichend für KSHV Reaktivierung-es möglich war, wo Transkription tatsächlich nahm Platz8,11,12,13,14,15 . Diese Intron-RNA-FISH-Technik ermöglicht Forschern zu visualisieren, wo mRNA transkribiert ist, sofort bevor es gespleißt und, Zytoplasma16,17 exportiert.

KSHV kann reaktiviert werden, durch verschiedene chemische Reize, einschließlich Phorbol Ester wie 12-O-Tetradeconoyl-Phorbol-13acetate (TPA) und Histon-Deacetylase-Hemmer wie Natrium Butyrat, zusätzlich KSHV durch Überexpression von reaktivieren induziert werden können die virale Transkriptionsfaktor, K-Rta-19. Forscher haben erfolgreich erhöht die Effizienz der KSHV Reaktivierung durch die Synchronisation der Zelle Zyklen vor Induktion Reaktivierung18. So wurden für diese Spezialuntersuchungen Zellen synchronisiert, mit einen doppelten Thymidin-Block (Protokoll beschrieben) und für eine kurze Zeit mit TPA und Doxycyclin (Dox) inkubiert. Doxycyline wurde verwendet, weil in diesen Experimenten verwendeten Zelllinie eine Doxycyclin-induzierbaren K-Rta-Kassette, die wurde von cDNA kloniert und beinhaltet nicht die Intron-Region von K-Rta hat. Es ist zwar möglich, reaktivieren KSHV mit K-Rta Ausdruck nur induziert, es ist von anderen Forschern nachgewiesen worden, dass aufgrund einer Vielzahl von verschiedenen biochemischen Faktoren K-Rta Ausdruck allein erweist sich als ein schwacher Reaktivierung Reize20. Durch die Kombination aller dieser, und durch die Droge Inkubationen für einen kurzen Zeitraum zu begrenzen wurde eine robuste, aber nicht übermäßig künstliche KSHV Reaktivierung für die Bildgebung erreicht.

Nach LANA, RNAPII, Kennzeichnung K-Rta Introns und DNA als in diesem Dokument beschriebenen, 3D Fluoreszenz-Bildgebung erfolgte mittels einer Weitfeld Dekonvolution Mikroskop. Nach der Bearbeitung mit imaging-Software kann die räumliche Verteilung der aktiven viralen Episomes richtig ausgewertet werden. Mit dieser Technik können die zentralen Fragen über die grundlegende Natur der Bildung von aktiven Chromatin Hubs und andere atomaren Strukturen untersucht werden. Mit identischen virale Episomes in eine einzelne Zelle, die die gleichen regulatorischen Elemente verarbeitet kann eine einzigartige Recherche-Tool zur Vertiefung des Verständnisses der raumzeitlichen gen Regulationsmechanismen darstellen.

Eine Einschränkung von imaging-mehrere Zelle Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert um eine von Natur aus molekularen Dynamik zu charakterisieren ist, dass subtile oder kleine Änderungen bei Fluoreszenz Verteilung unentdeckt oder als unbedeutend. Dies gilt, sofern in dem seltenen Fall, jede Zelle beobachtet die gleiche subtile Änderung zeigt. Daher kann nicht die volle raumzeitliche Beziehung aktive virale Transkription und anderen atomaren Strukturen mit festen Bildgebung kritisch beurteilt werden. Um diese technischen Herausforderungen zu begegnen, ist der beste Ansatz, Bild lebenden Zellen, die virale Episomes geprägt haben und die Lage der wichtigsten zellulären Enzymen im Laufe der Zeit folgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Achtung: Zelllinien verwendet in diesem Verfahren infektiöse Viren enthalten, seien Sie vorsichtig und nur in Stufe 2 BSL Anlage oder höher gehen.

1. Handy-Vorbereitung und Wartung

  1. Kulturzellen TREx-K-RTA BCBL-1 (oder ein anderes KSHV infiziert PEL-Zell-Linien) in RPMI1640 Medium mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung ergänzt.
  2. Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2) sicherstellen, dass kontinuierlich wachsen und Zellen geteilt durch ein Verhältnis von 1:4 alle 2 – 4 Tage.
  3. Überwachen Sie Zellkulturen mit einem Lichtmikroskop jeden Tag bestätigen gute Zellwachstum und Morphologie, ansonsten empfiehlt es sich, die Zellkultur neu zu starten oder die Zelle Kulturbedingungen entsprechend anpassen.

(2) Thymidin-Synchronisation und lytischen Induktion

  1. In einer 10 cm Petrischale Platte TREx-K-Rta BCBL-1 Zellen in frisch zubereitete Medien (1 x 106 Zellen/2 mL der Medien)
  2. Fügen Sie 200 mM Thymidin (Endkonzentration: 2 mM) in die Schale mischen und 18 h inkubieren.
  3. Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in frisch zubereiteten Medien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In frisch zubereiteten Medien aufzuwirbeln.
  4. Lassen Sie die Zellen, die S-Phase für 8 h beenden.
  5. Hinzufügen von Thymidin (Endkonzentration: 2 mM), mischen und 16 h inkubieren.
  6. Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in frisch zubereiteten Medien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In frisch zubereiteten Medien aufzuwirbeln.
  7. Um virale Reaktivierung zu induzieren, 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, Endkonzentration 20 ng/mL) und Doxycyclin (DOX, Endkonzentration 100 ng/mL) für die Zellkultur, mischen und 4 h inkubieren. Stimulieren Sie für Zell-Linien ohne eine K-Rta induzierbaren Kassette Reaktivierung mit TPA (Endkonzentration 20 ng/mL und Natrium Butyrat (1 mM)).
  8. Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in komplette Kulturmedien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In komplette Kulturmedien aufzuwirbeln.
  9. Lassen Sie die Zellen für 24 h zu wachsen.

(3) Fixierung und Permeabilisierung

Hinweis: Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher Befestigung Lösung (3,7 % Formaldehyd in DEPC-behandeltem PBS) Diethyl Pyrocarbonate behandelt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DEPC-PBS), Glycin DEPC PBS (Endkonzentration von Glycin: 100 mM) und Permeabilizating Lösung (50 % Aceton, 50 % Methanol) sind bereit. In der Regel wird jede Folie benötigen mindestens 0,5 Millionen Zellen, vermehren, wenn notwendig und umfassen zusätzliche Zellen für Rücken vor allem, wenn Zellen nicht gesund sind.

  1. Sammeln Sie Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  2. Zentrifuge für 2 min bei 200 X g. waschen den Zellen die Zellen 3 Mal mit 1 mL sterile DEPC PBS. In 1,2 mL DEPC PBS aufzuwirbeln.
  3. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Deckgläsern (bestimmt durch den Versuchsaufbau) in den Böden der 6-Well-Platte.
  4. Pipette 200 µL der Zelle DEPC PBS-Mischung auf jeden Deckglas, sicherzustellen, dass mindestens 0,5 Millionen Zellen auf jeder Folie. Können Sie die Zellen für 2 min zu begleichen, und aspirieren Sie überschüssige DEPC PBS verlassen nur eine dünne Schicht von Zellen. Es ist normal, dass Zellen in diesem Prozess entfernt werden.
    Achtung: PFA ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.
  5. Fügen Sie sorgfältig 1 mL der Lösung (3,7 % Formaldehyd in DEPC PBS) für jede Deckglas Befestigung. Lassen Sie die Zellen für 10 min beheben.
  6. Waschen Sie Deckgläsern 3 Mal mit DEPC PBS.
  7. Sorgfältig fügen Sie 1 mL Glycin DEPC PBS (Endkonzentration von Glycin: 100 mM) auf jeder Deckglas. Lassen Sie die Zellen für 5 min zu stillen.
  8. Fügen Sie 1,5 mL DEPC PBS und entweder auf einen Shaker für 5 min hinzu oder schütteln Sie fest aber vorsichtig in die hand zu, für 1 min. Absaugen des überschüssigen DEPC PBS. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Zellen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.
  9. Hinzugeben Sie 1 mL permeabilizing Lösung (50 % Aceton, 50 % Methanol) für jede Deckglas sorgfältig. Lassen Sie die Zellen, die für 15 min permeabilize.
    Hinweis: An dieser Stelle können die Deckgläsern in einem Gefrierschrank-20 ° C nicht länger als eine Woche gespeichert werden. Vermeiden Sie einfrieren zu oder minimieren Sie die Zeit in den Gefrierschrank, wie schnell die Bildqualität verschlechtern kann. Sicherstellen Sie, dass wenn Sie in den Gefrierschrank, den die Zellen bleiben feucht und bedeckt in Methanol/Aceton und um sicherzustellen, dass sie nach der Entnahme aus der Tiefkühltruhe richtig mit DEPC PBS rehydrieren.
  10. Fügen Sie 1,5 mL DEPC PBS und entweder auf einen Shaker für 5 min hinzu oder schütteln Sie fest aber sanft in der hand für 1 min. aspirieren Sie die überschüssige DEPC PBS, achten Sie darauf, die Zellen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.

4. IFA und RNA-Fisch

Hinweis: In Bezug auf RNA Fisch Sonde Kennzeichnung und Vorbereitung: für die K-Rta Intron 959 Basenpaare, 31 verschiedenen Sonden wurden generiert, die begnügten 20 Basenpaare jeweils mit einem GC von etwa 50 %. Arbeits- und Lager Lösungen der Sonden wurden bzw. regelmÄÑig in 100 µM und 2,5 µM Konzentrationen.

  1. Objektträger mit notwendigen experimentellen Daten oder irgendeine Art von unterscheidbar Label zu kennzeichnen.
  2. Linie unten einen verschließbaren Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch.
  3. Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung (1,5 µL LANA Antikörper, 0,75 µL RNA-Pol-II-Antikörper, 3 µL des Bäckers Hefe tRNA, DEPC PBS bis zu 30 µL), und multiplizieren Sie Rezept für jede vorhanden Deckglas. Platz 30 µL Primärantikörper Lösung auf jeder beschrifteten Objektträger.
    1. Titrieren Sie zunächst den primären Antikörper von Interesse und nutzen Sie die optimale Menge. Achten Sie darauf, gereinigte IgG zu verwenden, da Serum (Aszites-Flüssigkeit) große Menge von RNase enthalten kann.
  4. Das Deckgläschen (Zellen mit Blick auf die Lösung) auf die beschrifteten Objektträger und verschieben Sie die Folien in den Behälter mit der feuchten Papiertuch. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Das äußere des Containers mit Plastikfolie abdecken. Bewegen Sie den Container in einen Inkubator, eingestellt auf 37 ° C für 1 h.
  5. Bereiten Sie ein Fisch-Waschpuffer (2 X Kochsalzlösung Natriumcitrat Puffer (SSC) (final), 10 % Formamid, 90 % DEPC dH2O).
  6. 2 x Hybridisierung Puffer vorzubereiten (4 X SSC, 20 % Dextran Sulfat).
  7. Bereiten Sie den sekundären Antikörper und Fisch Intron Sonde Puffer (20 µL 2 x Hybridisierung Puffer (letzte 1 x Hyb-Puffer), 4 µL der Bäckerhefe tRNA (letzten 10 %), 4 µL Formamid (letzten 10 %), Intron K-Rta-Sonde (final 125 nM), 0,8 µg Sekundärantikörper, DEPC dH2 O bis zu 40 µL). Multiplizieren Sie Rezept für jede Folie benötigt.
  8. Waschen Sie nach der Inkubation Zellen 3 Mal mit DEPC PBS in einer 6-well-Platte für 5 min.
  9. Waschen Sie mit Waschpuffer Fisch 3 Mal für 5 Minuten. Halten Sie Deckglas in Fisch-Waschpuffer bis Ziel vorbereiten Mischung von Zweitens Antikörper und Intron Sonde (Schritt 4,7).
  10. Sauberen Objektträger für Primärantikörper Inkubation für die Hybridisierung verwendet.
  11. Platz 40 µL der Sekundärantikörper und Fisch Intron-Sonde, die Lösung in jedem Glas Folie enthalten.
  12. Legen Sie Deckgläsern mit den Zellen auf dem Objektträger mit der Zelle-Seite nach unten auf den Puffer, darauf achten, nicht sein, Luftblasen einzuführen.
  13. Legen Sie die Folien in einem Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch auf den Boden. Wickeln Sie Kunststoffbehälter in ersten Plastikfolie und dann in Alufolie.
  14. Inkubieren Sie die Container mit den Folien bei 37 ° C für 16-24 h.
  15. Nach der Inkubation sorgfältig schieben Sie das Deckglas aus der Glas-Folie-Rand und setzen Sie wieder in 6 well-Platten nach oben und waschen Sie Zellen mit Fisch-Waschpuffer 3 Mal in einem 6-well-Platte für 5 min.
  16. Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 2 X SSC.
  17. Fügen Sie DAPI (1:1 000) in den 2 X SSC und für 5 min bei Raumtemperatur sitzen lassen.
  18. Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 2 X SSC.
  19. Reinigen Sie die Glas-Folien für die Hybridisierung verwendet, und fügen Sie 10 µL Montagelösung auf den Objektträger.
  20. Legen Sie das Deckgläsern Gesicht nach unten auf die Montage-Lösung. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.
  21. Entfernen Sie mit einem Labor Gewebe vorsichtig das überschüssige Befestigungslösung, wobei Sie darauf achten, nicht um die Zellen zu zerquetschen.
  22. Mit Nagellack, ein reichlich auftragen um den Rand der Deckgläsern und trocknen lassen.
  23. Fahren Sie mit Fluoreszenz-Mikroskopie durchzuführen.

5. 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

Hinweis: Protokolle variiert mit der Art der Fluoreszenz-Mikroskop-System verwendet, werden die folgenden Schritte helfen, um den Erwerb von optimalen Bilddaten für die Quantitative Analyse zu gewährleisten.

  1. Vorbehandeln Sie feste Proben und montieren Sie in Anti-Fade Medien, Immunofluoreszenz Fluoreszenz während der Bildgebung zu verzögern.
  2. Verwenden Sie ein hochwertiges Ziel (z. B. ein 60 X 1,42 N.A Ölimmersion Objektiv), das eine ganze Zelle (oder einen Zellkern) erfassen kann in das Blickfeld.
  3. Belichtungsparameter (z.B.Erregerleistung, Belichtungszeit) für jeden Farbkanal Fluoreszenz, mit positiven und negativen Kontrollproben festgelegt. Fluoreszenzbilder zu erwerben.
    Hinweis: Positivkontrolle Proben, die nur eine fluoreszierende Label enthalten sollte auch zur Bestimmung der Höhe des "Übersprechen" zwischen Farbkanäle verwendet werden. Für bildgebende feste Zelle Proben kann Fluoreszenz Erregerleistung (mit etwas längeren Belichtungszeiten) reduziert werden, um Immunofluoreszenz zu minimieren.
  4. Sobald das Image-Protokoll festgelegt worden, erhalten die gleichen Belichtungsparameter konsistent für alle Proben in einer Studie — so dass Bilddaten genau analysiert und verglichen werden können.
  5. Führen Sie nach der Übernahme Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion. Identifizieren Sie die K-Rta-Transkripte von RNA-FISH-Signal (rot), LANA-Moleküle durch Immunfluoreszenz (grün) und nuklearen Chromatin (falls zutreffend) gebeizt mit DAPI (blau).
    Hinweis: Regionen des Zellkerns, in denen K-Rta und LANA Co gruppierten sind sind somit vermutlich virale Transkription Fabriken und Replikation komplexer zugeordnet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eine leicht gekürzte Protokoll wurde durchgeführt, wo BCBL-1-Zellen dienten und nur LANA und K-Rta RNA (Abbildung 1 gefärbt wurden). Dieses Experiment kann wir prüfen, wo aktiv Universalklassifikation virale Episomes sind und die Heterogenität der Reaktion auf KSHV Reaktivierung Reize in einer Bevölkerung der Zellen. In der Zelle wird durch den Pfeil in Abbildung 1ist die verschiedene K-Rta-Fluoreszenz in Regionen, in denen die Verteilung der viralen Episomes (gekennzeichnet mit LANA) entsprechen Beweis für aktive Transkription stattfindet, in der Nähe von KSHV Genome. In der gleichen Probe können Zellen wie das Signifikat durch die Pfeilspitze in Abbildung 1 beobachtet werden, die viel schwächer und diffuse K-Rta Fluoreszenz, die nicht deutlich überlappt mit LANA aufweisen. Dies zeigt die allgemeine Feststellung, dass innerhalb einer Bevölkerung der Zellen gibt es erhebliche Unterschiede im Grad der Reaktion auf Reaktivierung Reize.

Figure 1
Abbildung 1: Visualisierung aktive Transkription der viralen Episomes. IFA und RNA-Fisch wurde am BCBL-1-Zellen durchgeführt. Die BCBL-1-Zellen wurden nicht synchronisiert, sondern mit TPA und Natrium Butyrat für 4 Std. verwenden LANA Immunostaining behandelt, virale Genom wurden in grün, während die RNA-Fisch durchgeführt wurde gezielt K-Rta Introns, befindet sich aktive Transkription in rot visualisiert. Zelluläre Chromatin war Post Fixierung und Permeabilisierung mit DAPI gefärbt. K-Rta Intron und LANA Flecken waren miteinander verschmolzen. Der vollständige Pfeil zeigt auf eine Zelle, die hat voll reaktiviert und VTFs bildet. Während die Pfeilspitze in Richtung einer Zelle, die nur langsam wieder zu aktivieren verweist, wie vorgeschlagen, durch das schwache Signal K-Rta. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Als nächstes wurde die Wirksamkeit der Thymidin Synchronisation untersucht, durch die Visualisierung der Expression von viralen Protein K-Rta (Abbildung 2). Nachdem ein doppelte Thymidin-Block um TREX BCBL-1-Zellen am G1/S Phasenübergang zu synchronisieren durchgeführt wurde, wurde das zuvor beschriebene Protokoll durchgeführt (ohne LANA und RNAPII Färbung). Durch die Untersuchung der K-Rta-Färbung, ist es klar ersichtlich, dass synchronisierte Zellen mehr auf die Reaktivierung Reize als die nicht synchronisierten Bevölkerung reagierte. Aus früheren Studien im Labor Izumiya (Daten nicht gezeigt) wurde bestätigt, dass RNAPII auch immer häufiger mit K-Rta nach Zellzyklus Synchronisierung colocalizes.

Figure 2
Abbildung 2: Thymidin Wirksamkeit. RNA-Fisch wurde an TREX K-Rta BCBL-1-Zellen durchgeführt. Die Zellen (angezeigt durch die "2 X dein" Titel) wurden mit einem doppelten Thymidin-Block synchronisiert. Beide nicht synchronisierten und synchronisierter Zellpopulationen wurden mit TPA und DOX behandelt, für 4 Std. K-Rta Introns RNA Fish Sonden hybridisiert waren. Zellen, die einheitlich leuchtend rot sind sind nicht K-Rta überexprimieren, sondern sie sind tot, mit DAPI-Färbung (nicht dargestellten) validiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Als allgemeine Anmerkung ist es sehr wichtig, um Zellen mit DAPI färben, bei der Durchführung dieses Protokolls. Apototic Zellen erkennt man leicht an nuklearen Fragmentierung und Blebbing. Angesichts der schweren Induktion Reize und allgemeine Zelle Kultur-Übungen, ist es üblich, dass einige toten Zellen gesehen werden. Es ist wichtig, immer mit DAPI färben als primäre Methode, zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Manchmal Antikörper oder RNA-Sonden werden in der Apoptotic Zellen erwischt und Signale zu produzieren, daher ist es wichtig, diese Zellen von Analysen auszuschließen. DAPI-Färbung kann dienen mehrere Zusatzfunktionen, zum Beispiel in Abbildung 3, es ist klar, dass das Objekt wird durch den Pfeil tatsächlich drei getrennte Zellen anstelle von einem.

Es ist wichtig zu beachten, dass die in Abbildung 3 und Abbildung 4 gezeigten Bilder deconvolved wurden somit mehr punktförmige Muster erstellen. Durch die Untersuchung des RNAPII Flecks, der Unterschied zwischen den Zellen durch den Pfeil angezeigt und die umgebenden Zellen gesehen werden können. Es ist bemerkenswert zu erwähnen, dass das RNAPII-Signal als normal aufgrund Dekonvolution viel ausgeprägter ist.

Mit 3D Mikroskopie neben diese Technik ermöglicht es uns, die räumliche Beziehung zwischen RNAPII, LANA und K-Rta zu befragen. Zum Beispiel in Abbildung 4, ringartige RNAPII Strukturen mit KSHV Genome verstreut an der Peripherie erkennbar. In der Regel colocalizes LANA in der Regel mit RNAPII in Zellen, die Transkription Fabriken zu entwickeln. Jedoch nicht alle Punkte LANA colocalize mit RNAPII, Studien, darunter die 4th Dimension (Zeit) würde diesen Phänotyp geklärt werden. Es ist wichtig hinzuzufügen, dass die paar LANA-Punkte, die nicht mit K-Rta Signale colocalize die episomal Heterogenität in der Antwort auf Reaktivierung Reize sogar innerhalb einer einzelnen Zelle (Abbildung 4) vertreten.

Figure 3
Abbildung 3: Kombiniert IFA und Intron-RNA-Fisch. IFA und RNA-Fisch wurde am TREX K-Rta BCBL-1-Zellen durchgeführt. Virale Genom befanden sich mit Immunostaining von LANA (grün), aktive Transkription wurde visualisiert mit RNA-Fisch der Region Intron K-Rta mRNA (gelb), RNAPII (rot) Gemeinden wurden mit IFA beschriftet und die Zellen wurden schließlich gebeizt mit DAPI Bild DNA (blau). TREx K-RTA BCBL-1-Zellen wurden mit einer doppelten Thymidin-Block, synchronisiert, dann Zellen durch Inkubation mit TPA und DOX für 4 h reaktiviert wurden, und 24 h später die Zellen fixiert waren, permeabilized und weitere in Vorbereitung für die Bildgebung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: 3D Visualisierung der virale Transkription Fabriken. Intron-RNA-Fisch mit K-Rta Intron Sonden (hellblau), Immunostaining DNA DAPI-Färbung (dunkelblau), RNAPII (rot) und LANA (grün). Deconvolved 3D-Rendering eines Z-Stack am Mikroskop aufgenommen, verarbeitet und auf kommerzielle Software zur Abbilderstellung konstruiert (siehe die Tabelle der Materialien). TREx-K-Rta BCBL-1 Zellen doppelt Thymidin synchronisiert und dann mit TPA und DOX für 4 Std. Zellen behandelt wurden 28 h nach Reaktivierung stimuliert wurde verarbeitet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Es gibt einige Aspekte des Protokolls, die geändert werden können, um außergewöhnliche Umstände zu berücksichtigen. Die Wahl der Fixierung und Permeabilisierung Puffer kann auch geändert werden. Für Fixierung Puffer Paraformaldehyd ist auch wirksam und Ethanol für Permeabilisierung genutzt werden.

Abschrecken von Formaldehyd mit Glycin, die PBS empfohlen wird, da es verhindert, dass Formaldehyd deaktivieren die Antikörper in Abwesenheit von Rinderserumalbumin (BSA), aber wenn die Deckgläsern gründlich genug gewaschen werden, der Glycin-PBS-Schritt übersprungen werden kann. Vermeiden Sie im Protokoll die Verwendung von Rinderserumalbumin als blockierende Lösung. Pilotstudien durchgeführt im Izumiya Labor zeigte schwächere Signale der RNA-Fisch, vermutlich aufgrund der RNA-Abbau. Wenn Sperrung für den primären Antikörper benötigt wird, empfiehlt es sich, RNase frei BSA zu verwenden. Aus Erfahrungen, der Vergangenheit es fiel auf der Antikörper spezifisch ist, Einbeziehung der BSA nicht nötig ist, wenn in der Reaktion. Aber es wird empfohlen, immer ein Übermaß an Hefe tRNA in allen Inkubation zur Schritte RNA-Abbau zu verhindern. Man hat festgestellt, dass mit tRNA als Agent blockieren bestimmte RNA-FISH-Signale erhöht.

Zellzyklus Synchronisation wurde implementiert, um eine effizientere und synchrone KSHV Reaktivierung zu produzieren. Für Zellzyklus Synchronisierung möglicherweise Hydroxyurea oder Serum Hunger alternative Ansätze. Es wurde bestätigt, dass Hydroxyharnstoff so effektiv wie mit einem Thymidin-Block ist, obwohl Inkubation mit Hydroxyurea allein KSHV schwach reaktiviert.

Wie kann diese Technik auf andere Studien werden angewendet? In jüngsten Publikation Izumiya Labor zeigte sich, dass NS1 der aktiv Transkription KSHV Episomes und RNA Pol II, ein wesentlicher Enzym für RNA-Transkription. Es ist jedoch bekannt, dass es eine Reihe von Co-Aktivatoren, Co Repressors und zellulären transcriptional Faktoren KSHV Genregulation beteiligt gibt. Quantitative RT-PCR wurde historisch verwendet bei einer Bevölkerung (Mischung aus reaktiviert und latente) von kultivierten Zellen, viralen Transkripte Quantifizierung und Bewertung der Auswirkungen auf die virale Genexpression. Mit dem oben beschriebenen Ansatz, können Analysen auf episomal einstufig, virale Transkription untersuchen eingegrenzt werden. So kann die räumlich-zeitliche Regelung der anderen zellulären und virale Enzyme untersucht werden, um Einblick in ihre Assoziation mit KSHV Reaktivierung. Es ist auch bemerkenswert zu erwähnen, dass da die RNA-Intron-Region Vergänglichkeit ihren Abbau abhängig ist, die RNA Fisch Sonden hybridisieren und in der Regel zu lokalisieren wo aktive Transkription stattfindet, aber wenn die Introns nicht abgebaut werden FISH-Sonden können sofort Signale präsentieren, die nicht immer in der Nähe von aktive Transkription befinden.

Im Moment ist es schwierig, das Verhältnis zwischen der Bildung der zellulären Transkription Fabriken und anschließende Genexpression aufgrund ihrer genomischen Grösse und Komplexität der Konfiguration von zellulären Promotoren zu studieren. In diesem Zusammenhang kann KSHV Episomes ein ideales Werkzeug aufgrund ihrer relativ geringen Genomgröße, definierten Reaktivierung Mechanismen mit klaren RNA Pol II Aggregat Formationen. Mithilfe KSHVs manipulierbaren virale Mini-Chromosom kann Herpesvirology aus einem einzigartigen Blickwinkel zu Bereich der zellulären Epigenetik-Forschung beitragen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren dieses Papiers haben keine finanziellen Verbindungen oder konkurrierenden Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch die National Institutes of Health Grant (R01-DE025985) und durch eine amerikanische Krebs Gesellschaft Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch unterstützt durch Zuschüsse aus dem US Department of Agriculture (2015-67015-23268 und 2014-67015-21787) und neue Research Initiative Grant University of California, Davis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium 1650 GlutaMAX Gibco by Life Technologies 61870-036 Needs to be warmed to 37 °C
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Inc. FB-11
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco by Life Technologies 10378-016
Thymidine  Sigma Aldrich T9250
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution Gibco by Life Technologies 14190-144
TPA Sigma Aldrich P1585
Sodium Butyrate  Sigma Aldrich B5887
Formaldehyde Solution  Sigma Aldrich 252549 Corrosive, toxic, health hazard
Diethyl Pyrocarbonate Sigma Aldrich D-5758 Acute toxicity 
Glycine Sigma Aldrich 410225
Acetone Sigma Aldrich 179124 Flammable, toxic
Methanol Fisher Chemical  67-56-1 Flammable, toxic, health hazard
Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 EMD Milipore 05-623
Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae)  Sigma Aldrich 9014-25-9
Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) Thermo Fisher Scientific  15557044
Formamide  Sigma Aldrich 295876
Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution EMD Milipore 1916C093
DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific  D1306
slowFade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Micro cover glass 22x22 Matsunami C022221
VoloCITY 3D imaging software
DeltaVision microscope
Superfrost/Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
  2. Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
  3. Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
  4. Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
  5. Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
  6. Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
  7. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  8. Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
  9. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
  10. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
  11. Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
  12. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
  13. Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
  14. Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
  15. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  16. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
  17. Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
  18. McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
  19. Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
  20. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).

Tags

Mikrobiologie Ausgabe 131 virale Transkription Fabrik KSHV Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus Transkription RNA-Polymerase II RNA-Fisch aktive Transkription
Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. … More

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56832, doi:10.3791/56832 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter