Summary
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, quantitative Real-Time reverse Transkription PCR verwenden, mit oder ohne Vorverstärkung. Dieses Protokoll bietet besseres Verständnis für die Menge an Plasma MiRNAs und qualitative Bewertung der entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien oder Labors ermöglicht.
Abstract
RT-qPCR ist eine der häufigsten Methoden, um einzelne Ziel MiRNAs bewerten. MiRNAs sind in der Regel im Vergleich zu einer Referenzprobe gemessen. Diese Methode eignet sich für die Prüfung von physiologischer Veränderungen im gen Ausdruck Zielwerte. Absolute Quantifizierung mit besseren statistischer Analyse ist jedoch für eine umfassende Bewertung der gen-Expression-Ebenen vorzuziehen. Absolute Quantifizierung ist noch nicht gebräuchlich. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, mit RT-qPCR, mit oder ohne Vorverstärkung.
Ein bestimmtes Volumen (200 µL) von EDTA-Plasma wurde aus dem Blut gesammelt von der femoral Ader des bewussten Cynomolgus Affen vorbereitet (n = 50). Gesamt-RNS war mit im Handel erhältlichen System extrahiert. Plasma-MiRNAs wurden durch Testbasierte RT-qPCR-Assays die MiRNA-spezifische Vor-/Rücklauf PCR Primer und Sonde enthält quantifiziert. Standardkurven für absolute Quantifizierung wurden mit handelsüblichen synthetische RNA-Oligonukleotide erzeugt. Eine synthetische Cel-MiR-238 diente als eine externe Steuerung für die Normalisierung und Qualität. Die MiRNAs, die Quantifizierung Zyklus (Cq) Werte über 35 gezeigt wurden vorverstärkt vor dem qPCR-Schritt.
Unter den 8 MiRNAs untersucht waren MiR-122, MiR-133a und MiR-192 nachweisbar ohne Vorverstärkung, während MiR-1 und MiR-206 MiR 499a Vorverstärkung aufgrund ihrer niedrigen Ausdruck erforderlich. MiR-208a und MiR 208b waren auch nach Vorverstärkung nicht nachweisbar. Probe Verarbeitungseffizienz wurde durch die Cq-Werte von Spike Cel-MiR-238 bewertet. Bei diesem Assay-Verfahren technische Variation war schätzungsweise weniger als 3-fold und die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) war 102 Kopie/µL, für den Großteil der untersuchten MiRNAs.
Dieses Protokoll ermöglicht eine bessere Schätzung der Menge an Plasma MiRNAs und Qualitätsbeurteilung von entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien ermöglicht. Wenn man bedenkt, dass die geringe Anzahl von MiRNAs in Körperflüssigkeiten, Vorverstärkung nützlich zur Erkennung von schlecht zu verbessern ist, äußerte MiRNAs.
Introduction
Eine wachsende Zahl von Studien wurden Mikro-RNAs (MiRNAs) als Biomarker für die Diagnose und Prognose von Krebserkrankungen zu erforschen oder Überwachung und Erkennung von anderen Krankheiten in präklinischen und klinischen Studien1,2,3 . Quantitative Real-Time reverse Transkription PCR (RT-qPCR) ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden verwendet, um einzelne Ziel MiRNAs, bewerten, weil diese Technik empfindlicher ist als Microarray4 und RNA Sequenzierung Plattformen5basierend. Im Allgemeinen ist MiRNA Ausdruck im Vergleich zu einer Referenzprobe mit der ΔCq Methode6gemessen. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung von physiologischer Veränderungen im gen Ausdruck Zielwerte. Allerdings hat relative Quantifizierung der zirkulierenden MiRNAs Dienstprogramm wegen ihrer geringen Mengen begrenzt. Darüber hinaus macht technische Variation es schwierig, die Ergebnisse aus verschiedenen Studien zu vergleichen, da verschiedene Labors der RT-qPCR experimentelle Protokolle unterschiedlich anpassen, was führt zum inkonsistenten oder sogar widersprüchlich ergibt sich aus verschiedene Studien7.
Angesichts der oben genannten Bedenken möglicherweise absolute Quantifizierung besser geeignet für die Beurteilung von kleinen Mengen von MiRNAs in Körperflüssigkeiten. Die absolute Quantifizierungsmethode verwendet eine Standardkurve generiert aus bekannten Konzentrationen von synthetische RNA-Oligonukleotide, die nacheinander auf die entsprechenden Ziel-MiRNA-8identisch sind. Gesundheit und Environmental Sciences Institute (HESI) Fachausschuss Genomics kürzlich durchgeführten umfassendere Studien um absolute Messergebnisse von Plasma MiRNAs Test standortübergreifend zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass vergleichbare Ergebnisse mit einem Standardprotokoll für die absolute Quantifizierung von MiRNAs über mehrere Test Seiten9erbracht werden. Die RT-qPCR-Assay-Methode in der vorliegenden Studie beschriebenen ist fast identisch mit der HESI Standardprotokoll, inklusive Multiplex Analyse mehrerer MiRNA Ziele und Vorverstärkung, die Erkennung von geringe Expression MiRNAs unterstützen.
In dieser Studie ein bestimmtes Volumen (200 µL) von EDTA-Plasma vorbereitet aus dem Blut gesammelt von der femoral Ader des bewussten Cynomolgus Affen (n = 50) verwendeten10war. Das folgende Protokoll beschreibt das Verfahren für die Herstellung von Plasma-Proben, Gewinnung von MiRNA und RT-qPCR, einschließlich Vorverstärkung. Noch wichtiger ist, wurde weitere technische Informationen über das Protokoll aufgenommen, so dass die Menge der Ziel-MiRNAs in den Proben in Kombination mit einem gut ausgebildeten Prozess überprüft werden kann. Zunächst wurde die Standardkurve jede MiRNA für seine individuelle Erfassungsbereich, vor seiner Quantifizierung in biologischen Proben überprüft. Zweitens war die Qualität der gegenwärtigen Methode mittels Cq-Werte für eine externe Steuerung (Cel-MiR-238) umfassend bewertet. Daher ergibt sich diese Plattform informativere und zuverlässige Daten für den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen Studien oder Laboratorien.
Die Profile der 8 MiRNAs wurden in diesem Bericht als repräsentative Ergebnisse aus der Assay-Methode, die hier beschrieben. Diese MiRNAs sind vorgeschlagen worden, wie mögliche Sicherheit Biomarker Gewebeschädigung der Leber (MiR-122 und MiR-192), Herz (MiR-1, MiR-208a, MiR 208b und MiR-499a) und Skelettmuskulatur (MiR-133a und MiR-206) in Nagetieren und Menschen3zugeordnet, 11,12,13.
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Protocol
Alle Experimente stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Daiichi Sankyo Co., Ltd.
1. die Probenvorbereitung
- Sammeln Sie Blut (mindestens 0,5 mL) der femoralen Ader Cynomolgus Affen in 2K-haltigen EDTA-Röhrchen.
Hinweis: Die Citrat und Heparin sind nicht akzeptabel, weil diese Antikoagulanzien anschließende PCR14,15hemmen. - Legen Sie die gesammelten Proben sofort auf Eis und Verfahren zur Isolierung von Plasma innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g bei 4 ° C für 5 min.
- Übertragen des Überstands in ein 2 mL Reaktionscup, gefolgt von Zentrifugation bei 16.000 x g bei 4 ° C für 5 min Zellenrückstand und restliche Thrombozyten zu entfernen.
Hinweis: Quantifizierung der MiRNAs kann Thrombozyten Kontamination16deutlich betroffen. - 200 µL-Aliquots des Überstands in frischen 2 mL Mikroröhrchen und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
Hinweis: Ein bestimmtes Volumen von jeder Probe wird für die RNA-Extraktion verwendet; Daher muss das Volumen der aliquoten genau zu sein.
2. RNA-Extraktion
- Auftauen von eingefrorenen Proben auf Eis (aus Schritt 1.5).
- Halten Sie Probe kalt auf dem Eis während der RNA-Extraktion. Chill-Lyse-Reagenz und chloroform auf Eis vor dem Gebrauch.
- 5 Bände (1000 µL) Lyse-Reagenz, mit monophasischen Lösung von Phenol und Guanidin erfolgt, um die Probe (200 µL) und mischen Sie kräftig durch Vortexen für 1 min.
- Fügen Sie 5 µL 5 nM synthetischen Caenorhabditis Elegans MiRNA (Syn-Cel-MiR-238-3 p).
- Fügen Sie 1 Volumen (200 µL) von Chloroform und mischen Sie kräftig durch Vortexen für 1 min.
- Halten Sie für 2 bis 3 min auf Eis, und dann Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g bei 4 ° C für 15 min.
- Übertragen Sie die wässrige Phase sorgfältig auf eine neue Reaktionscup.
Hinweis: Übertragen Sie die organische Phase (rot) oder Interphase (weiß) nicht. Das Volumen der wässrigen Phase gesammelt sein um zu vermeiden, Umgang mit Inkonsistenz, die erhöhte technische Variation führt einheitlich. Die übliche Höhe der wässrigen Phase, die in diesem Protokoll übertragen wurde 650 µL. - Fügen Sie 1,5 Mengen (975 µL) Ethanol, und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter.
- Übertragen Sie die Probe in einer entsprechenden Spalte und Adapter, gefolgt von Vakuumtrocknung für 3 min mit Vakuum Mannigfaltigkeiten. Wenn das Probenvolumen mehr als 700 µL ist, wiederholen Sie diesen Schritt, um die restliche Lösung verarbeiten.
Hinweis: Spaltenbasierten RNA Isolierung ist kompatibel mit Vakuum und Zentrifugation Methode. - Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 1 min fügen Sie 200 µL Ethanol hinzu.
- Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 2 min fügen Sie 800 µL RWT Puffer hinzu.
- Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 2 min fügen Sie 800 µL RPE Puffer hinzu.
- Wiederholen Sie Schritt 2.11.
- Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 1 min fügen Sie 300 µL Ethanol hinzu.
- Setzen Sie die Säule auf eine neue Reaktionscup, und bei 12.000 x g bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 1 min zentrifugieren.
- Übertragen Sie die Spalte an eine neue Reaktionscup zu, und fügen Sie 50 µL Nuklease-freies Wasser.
- Bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 3 min und Zentrifuge bei 8.000 × g bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 1 min stehen.
- Wenden Sie das Eluat erneut in die Spalte.
- Wiederholen Sie Schritt 2.16 und speichern Sie Eluat bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu.
(3) cDNA Synthese
- Auftauen von eingefrorenen Proben (aus Schritt 2.18).
-
Bereiten Sie bekannten Konzentration der synthetische RNA-Oligonukleotide, die MiRNAs Ziel entsprechen.
- Verwenden Sie synthetische RNA-Oligonukleotid zur Erzeugung einer Standardkurve in qPCR. Stammlösung 1 x 108 Kopie/µL Konzentration ist für Speicherzwecke vorbereitet.
- Verdünnen Sie die Stammlösung 10-fach um 1 x 107 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 Kopie/µL (vorverstärkt Proben) funktionierende Lösung als die höchste Konzentration für die Erstellung der Standardkurve zu erhalten. Im Allgemeinen ist eine empfohlene Intervall für die Konzentrationen der Standardkurve 1 x 107 bis 1 x 102 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL (vorverstärkt Proben).
- Bereiten Sie multiplex RT Primer Pool durch Mischen gleiche Volumina von 20 X RT Primer für Ziel MiRNAs.
Hinweis: Wie in Abbildung 2gezeigt, ein Schwimmbad mit bis zu 4 Ziel MiRNAs erfolgen durch das Mischen von 20 X RT Primer aller MiRNAs im Pool. Als eines der Ziel-MiRNAs in jedem Röhrchen beizufügen Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung). Fügen Sie bei weniger als 4 Ziel MiRNAs gleiche Volumina von 1/10-TE-Puffer statt 20 X RT Primer hinzu. - RT Reaktion Mischung vorbereiten: 3 µL RT-Grundierung (aus Schritt 3.3), Schwimmbad, 0,15 µL 100 mM dNTPs mit dTTP, 1 µL Reverse Transkriptase (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT Puffer, 0,19 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL) und 4.16 µL Nuklease-freies Wasser.
- Mischung 10 µL RT Reaktion durch Pipettieren mit 5 µL RNA-Probe (aus Schritt 3.1) oder Oligonukleotide (aus Schritt 3.2) mischen und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
- Reversen Transkription auf einem Thermocycler Apparat laufen: 16 ° C für 30 min, 42 ° C für 30 min, gefolgt von einer endgültigen Reverse Transkriptase Inaktivierung Schritt bei 85 ° C für 5 min. Store reverse Transkription Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung.
(4) Vorverstärker (Optional)
Hinweis: Die MiRNAs, die Cq-Werte über 35 oder mehr im nachfolgenden qPCR zeigen sind vorverstärkt.
- Auftauen von eingefrorenen Proben (aus Schritt 3,6).
- 10-divisibel serielle Verdünnungen von RT Produkt aus synthetischen RNA-Oligonukleotide zu machen; 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL für die Erstellung der Standardkurve.
- Bereiten Sie Multiplex-Assays Grundierung Pool durch Mischen gleichen Volumina (5 µL) 20 x Assay Primer für Ziel MiRNAs mit die Endkonzentration jedes Assay-Grundierung, 200-fach verdünnt von TE-Puffer in einem Endvolumen von 1.000 µL.
Hinweis: Die Assay-Primer, deren Ziel MiRNAs in nachfolgenden qPCR ohne Vorverstärkung und die Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung) nachweisbar sein kann, nicht Grundierung Pool gehören. - Vorverstärkung Reaktion Mischung vorbereiten: 12,5 µL 2 x Ready-to-Use sorgt Reagenz, 3,75 µL Assays Grundierung Pool (vom Schritt 4.3) und 6,25 µL Nuklease-freies Wasser.
- Mix-22,5 µL Vorverstärkung Reaktion durch Pipettieren mit 2,5 µL reverse Transkription Musters (aus Schritt 4.1) oder Oligonukleotide (aus Schritt 4.2) mischen und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
- Reaktion auf einem Thermocycler Apparat laufen: 95 ° C für 10 min; gefolgt von 12 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 4 min. vorverstärkt Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
5. Quantitative Real-Time PCR (qPCR)
- Auftauen von eingefrorenen Proben (von 3,6 oder Schritt 4.6).
- Verdünnen Sie die Proben 5-Fach mit sterilem Wasser.
- Bereiten Sie 10-divisibel serielle Verdünnungen von der RT Produkt aus synthetischen RNA-Oligonukleotide vor; 1 x 107 bis 1 x 102 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL (vorverstärkt Proben) zur Erzeugung von Standardkurven.
- QPCR Reaktion Mischung vorbereiten: 10 µL 2 x Ready-to-Use Verstärkung Reagenz, 1 µL 20 x Assay Reagenz, mit vor-/Rücklauf PCR Primer und Sonde entsprechend Ziel MiRNA und 7 µL Nuklease-freies Wasser.
- Übertragen Sie 18 µL von qPCR Reaktion Mischung auf die schnelle optische Reaktion der 96-Well-Platten, und fügen Sie 2 µL der verdünnten Proben (von 5.2 oder 5.3 Schritt) in die Vertiefungen.
Hinweis: Proben und Standards für qPCR sind Duplikate gegründet. - Die Dichtplatte mit Klebefolie und Zentrifugieren Sie kurz.
- Reaktion auf eine Echtzeit-Thermocycler laufen: 95 ° C für 20 s, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 1 s bis 60 ° C für 20 s.
(6) Datenanalyse
- Berechnen Sie die rohen Kopienzahl jeder Probe mit Datenanalyse-Software, die mit entsprechenden Echtzeit-Thermocycler arbeitet.
Hinweis: Schwelle Linie manuell auf "1.0" in alle Platten in der Studie soll die Reproduzierbarkeit im Vergleich zu ihren Cq Täler zu bestätigen. Abkürzungniveau befindet sich im Cq > 40 Zyklen. - Berechnen Sie den Mittelwert der rohen Kopienzahl jeder Probe von Duplikaten.
- Berechnen Sie Korrekturfaktor, indem eine Kopienzahl der Cel-MiR-238 in jeder Probe durch den Durchschnitt der Kopienzahl des Cel-MiR-238 aus allen Proben in einem entsprechenden Rohr.
Hinweis: Wie in Abbildung 2dargestellt, enthält jedes Rohr bis zu 4 Ziel MiRNAs einschließlich Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung). Daher wird Korrekturfaktor für jedes Rohr mit entsprechenden Cel-MiR-238-Wert berechnet. - Berechnen Sie die angepasste Kopie Anzahl dividiert die gemittelten roh Kopienzahl jeder Probe (ab Schritt 6.2) durch den Korrekturfaktor (aus Schritt 6.3) für jede Probe.
- Die absolute Kopienzahl durch Multiplikation der Anzahl der eingestellten raw Kopie jeder einzelnen Probe (ab Schritt 6.4) zu berechnen, indem die den Verdünnungsfaktor für jede Probe.
Hinweis: Der Verdünnungsfaktor ist "5" in diesem Protokoll Schritt 5.2 abgeleitet ist. - Berechnen Sie die Effizienz der PCR Verstärkung von der Neigung des Grundstücks die Cq-Werte für jede serielle Verdünnung gegen Log cDNA Konzentration.
Hinweis: Formel für die Berechnung der Effizienz; E = (10(-1/Neigung) -1) x 100 %. - Berechnen Sie die technische Variante mit den Cq-Werten von Cel-MiR-238 aus allen Proben mit Hilfe der Formel E = (2 X Verstärkung Wirksamkeit)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
Hinweis: Schritte, 6.5 und 6.7 dienen zur Qualitätsbewertung des Verfahrens.
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Representative Results
Workflow der MiRNA-Assay von RT-qPCR und Qualität Assessment
Abbildung 1 zeigt den Workflow der MiRNA-Assay aus Blutproben mit qPCR10. Die Qualität der Versuche kann durch einschließlich Cel-MiR-238 als eine externe Kontrolle überprüft werden. Dadurch wird erkennbar, dass technische Variationen in RNA-Extraktion und anschließende RT-qPCR verarbeitet. In dieser Studie wurde der Mittelwert ± SD der Cq-Werte von 50 Proben berechnet 21,0 ± 0,4 (Tabelle 1). Wenn die Cel-MiR-238 wegen der Vorverstärkung Schritt verdünnt wurde, war der Cq-Wert 24,2 ± 0,4 (Tabelle 1). In der hier beschriebenen Test-Methode wurde das Ausmaß der technische Variation auf weniger als 3-fold werden auf Basis der Differenz in der Cq-Werte geschätzt. Der Grad der Variation blieb konsequent, auch wenn zusätzliche Vorverstärkung Schritt aufgenommen werden musste. Diese Werte sind mit denen für andere Proben aus verschiedenen Tierarten, wie z. B. Mäuse, Ratten und Menschen in diesem Labor (Daten nicht gezeigt) durchgeführt.
Nachweisbare reichen von der Standardkurve für Ziel-miRNA
Keine Vorverstärkung der Proben
Reverse Transkription (RT) Ware aus synthetische RNA-Oligonukleotide in Konzentrationen von 1 x 107 Kopie/µL wurde vor nachfolgenden qPCR seriell verdünnt. Diese Serie dienten zur Erzeugung von Standardkurve die konsequente Abdeckung aller biologischen Proben gewährleistet, die ohne Vorverstärkung Schritt nachweisbar waren. Die Cq-Werte der Standardprobe in 1 x 102 Kopie/µL Konzentration waren in der Regel in der Nähe der Cut-off-Level für jede Ziel-MiRNA. Daher wurde die Nachweisgrenze beträgt schätzungsweise 1 x 102 Kopie/µL (Abbildung 3).
Vorverstärkt Proben
Um festzustellen, die nachweisbar Reihe von Proben erfordern Vorverstärkung, wurden zwei verschiedene Serien von verdünnten Proben verglichen, wie in Abbildung 4dargestellt. Für die Erzeugung von standard Kurve A, wurden serielle Verdünnungen des RT-Produkts vor Vorverstärkung Schritt vorbereitet. Dann wurden die Normenreihe vorverstärkt für nachfolgende qPCR verwendet. Für die Erstellung der Standardkurve B, wurde die erste Verdünnung vorverstärkt Proben zu einer Konzentration von 1 x 105 Kopie/µL. Diese Standardkurven zeigte offenbar unterschiedliche Nachweisgrenzen (Abbildung 5). Obwohl die Standardkurve B linearen Bereich der Anstieg bis auf 1 Kopie/µL zeigte, standard Kurve A konnte nicht verwendet werden, für bestimmte Amplifikate bei Konzentrationen von weniger als 102 oder 103 Kopie/µL (Abbildung 5). Dieses Ergebnis vorgeschlagen, dass extrem kleine Mengen von MiRNAs auch mit Vorverstärkung Schritt bewertet werden können. Darüber hinaus sollte die vorverstärkt Proben sorgfältig interpretiert werden, wenn die Cq-Werte sind > 30, weil die Nachweisgrenzen der vorverstärkt Proben waren nah an diesen Wert. Standardkurve B diente daher in der Regel in der Methode, die hier beschrieben wird, nach der Bestimmung des nachweisbaren Bereichs, nur um zu vermeiden, mit unzureichenden Anzahl von standard-Plots.
Infolgedessen war die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) 102 Kopie/µL für den Großteil der MiRNAs (Abbildung 3 und Abbildung 5). Nur MiR-1 eine höhere LLOQ zeigte (103 Kopie/µL) (Abbildung 5). Die durchschnittliche Verstärkung Effizienz war ca. 90 %, mit der Korrelationskoeffizient (R2) der standard von 0.998 bis hin zu 1.000 Kurven. Die Kennzeichen der eine genaue RT-qPCR-Assay gelten als eine lineare R2 gleich oder größer als 0,98 und einen PCR-Amplifikation Wirkungsgrad von 90 bis 110 %17. Daher war die Qualität der standard Kurven im Test überprüft.
Auswirkungen der Vorverstärkung für kleine Mengen von miRNAs
Die MiRNAs, die Cq-Werte über 35 oder höher in nachfolgenden qPCR zeigte waren vorverstärkt. Dieses Verfahren verbessert die Erkennung kleiner Mengen von MiRNAs. Zum Beispiel war die Cq-Werte (Mittelwert ± SD) der nicht Pre-verstärkten MiR-206 37,9 ± 1,9, während diejenigen vorverstärkt MiR-206 sank auf 27,0 ± 2,2. Signifikante Unterschiede zwischen doppelten Messung Paare wurden nicht Pre-verstärkten Proben bei hohen Cq-Werten (Abbildung 6) beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten vorverstärkt Proben fast gleiche Werte in Duplikate (Abbildung 6). Diese Ergebnisse zeigten, dass Vorverstärkung für die Bereitstellung genauer und zuverlässiger Daten im Falle von geringen Mengen von Proben wirksam wäre.
Profilierung der Plasma MiRNAs bei Cynomolgus Affen
Mit der etablierten Assay-Plattform, analysiert die Plasmaspiegel von 8 MiRNAs (MiR-1, MiR-122, MiR-133a, MiR-192, MiR-206, MiR-208a, MiR 208b und MiR-499a) von 50 Cynomolgus Affen waren (Abbildung 7)10. In diesem Test waren MiR-122, MiR-133a und MiR-192 nachweisbar ohne Vorverstärkung, während MiR-1 und MiR-206 MiR 499a Vorverstärkung aufgrund ihrer niedrigen Ausdruck erforderlich. Allerdings war MiR-208a weder MiR 208b auch mit Vorverstärkung nachweisbar. Die Daten wurden nicht normal verteilt; Daher wurde eine logarithmische Transformation durchgeführt, um ihren Mittelwert und Standardabweichung zu berechnen. Unter die MiRNAs untersucht, MiR-122 zeigte die höchste mittlere Plasmaspiegel (5,71 x 104 Kopie/µL), mit einem kleinen Dynamikbereich (20-fache). Im Gegensatz dazu wurden große dynamische Bereiche beobachtet für MiR-1 (581-fold), MiR-133a (971-fold), und MiR-206 (426-fold).
Abbildung 1 : Schematische Workflow der MiRNA-Assay von RT-qPCR. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Schematische Workflow der reversen Transkription von MiRNA Assay. Ein Schwimmbad mit bis zu 4 Ziel MiRNAs kann erfolgen durch das Mischen von 20 X RT Primer aller MiRNAs im Pool. Als eines der Ziel-MiRNAs in jedem Röhrchen beizufügen Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| MiR-238 Datenanalyse | ||
| Ohne Vorverstärkung |
Mit Vorverstärkung |
|
| N | 50 | 50 |
| Meine | 21.0 | 24.2 |
| SD | 0,4 | 0,4 |
| Max Cq | 21,8 | 25,3 |
| Min Cq | 20.3 | 23,5 |
| Median | 21.0 | 24.2 |
| Max-Min | 1.3 | 1.8 |
| Verstärkung der Wirksamkeit | 89 | 89 |
| Variation | 2.4 | 2.8 |
Tabelle 1: Qualitätsbewertung mit Quantifizierung Zyklus (Cq) Werte der Cel-MiR-238. Technische Varianten wurden von den Cq-Werten von MiR-238 in jedem Test ausgewertet. 50 Proben wurden eingeteilt in zwei Gruppen entsprechend mit (rechts) oder ohne (links) die Vorverstärkung Schritt. Variation wurde berechnet mit der Formel E = (2 X Verstärkung Wirksamkeit)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Die Verstärkung der Wirksamkeit wurde von der Piste der Standardkurve berechnet. Die Proben erfordern Vorverstärkung Schritt wurden während der Vorverstärkung Schritt verdünnt (MiR-238 selbst war nicht vorverstärkt). Diese Zahl wurde von unserem Bericht10geändert.
Abbildung 3 : Grundstück von Standardkurven für nicht Pre-verstärkten Proben. Standardkurven (N = 3, doppelte) wurden durch die Log-Konzentration im Vergleich zu Cq. lineare Regressionsanalyse berechnet wurde, um die Steigung zu bestimmen, welche die Verstärkung Effizienz entspricht Plotten erzeugt. Standard Kurven für MiR-122 (oben), MiR-192 (Mitte) und MiR-133a (unten) zeigte lineare Beziehung zwischen Cq und Konzentration bei den geprüften Bereich. In den standard Kurven repräsentieren Fehlerindikatoren eine Standardabweichung von drei unabhängigen Tests. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Verfahren zur Standardkurven für vorverstärkt Proben erzeugen. (Standard Kurve A) Eine repräsentative Konzentration von synthetische Oligo (1 x 105 Kopie/µL) war umgekehrter transkribiert, gefolgt von 10-divisibel serielle Verdünnungsreihen von der Standardprobe vorbereiten. Diese vorverstärkt Standards wurden für spätere qPCR verwendet. (Standardkurve B) Eine repräsentative Konzentration von synthetische Oligo (1 x 105 Kopie/µL) war umgekehrter transkribiert und vorab verstärkt. Dann, 10-divisibel serielle bereit eine Verdünnungsreihe von standard Proben wurden vor der nachfolgenden qPCR. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Grundstück von Standardkurven A und B für vorverstärkt Proben. Standard-Kurve A (n = 1, doppelte) und Standardkurve B (n = 3, doppelte) wurden durch die Log-Konzentration im Vergleich zu Cq. lineare Regressionsanalyse berechnet wurde, um die Steigung zu bestimmen, welche die Verstärkung Effizienz entspricht Plotten erzeugt. ()Oberen) Standardkurve (gepunktete Linie) zeigte offenbar nicht-spezifischen Amplifikate auf 1 x 102 Kopie/µL, während Standardkurve B (durchgezogene Linie) lineare Beziehung zwischen Cq und Konzentration auf die geprüfte Auswahl an MiR-1 zeigte. (Mittlere und unten) Standardkurve (gepunktete Linie) keine Amplikons bei Konzentrationen von 1 x 102 Kopie/µL oder niedriger, während Standard Kurve B (durchgezogene Linie) zeigte lineare Beziehung zwischen Cq und Konzentration auf das getestete Angebot an MiR 499a und MiR-206. In der Standardkurve B repräsentieren Fehlerindikatoren eine Standardabweichung von drei unabhängigen Tests. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Verstärkung Grundstück für non-Pre-verstärkt und vorverstärkt Proben. (Oberen) Verstärkung Grundstück von MiR-206 in repräsentativen Stichproben (A, B, C) ohne (oben), oder mit Vorverstärkung (unten). Messungen wurden in zweifacher Ausführung eingerichtet. Gab es Unterschiede zwischen den zwei Beispielen, die als Duplikate nicht Pre-verstärkten Proben, vor allem in höheren Cq-Proben (A und B) eingerichtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Absolutwert des Plasma MicroRNAs (MiRNAs) bei Cynomolgus Affen. Der Ausdruck Niveaus von der MiRNAs werden durch Punkt plottet dargestellt. Den Mittelwert und den Wert für zwei Standardabweichungen unter und über dem Mittelwert (siehe grauer Kasten), wurden nach einer logarithmischen Transformation bestimmt. Diese Zahl wurde von unserem Bericht10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Unsere umfassende Bewertung zur Verfügung gestellt einer strengeren statistischen Analysis des Ausmaßes der Dynamikumfang, die eindeutig darauf hingewiesen, dass das Ausmaß der Unterschiede zwischen den einzelnen Proben sehr unterschiedlich die MiRNAs getestet wurde. Obwohl diese Variationen auf ihre Kleinmengen in Körperflüssigkeiten zurückzuführen sein können, sollte angemerkt werden, dass diese Daten nicht nur biologische Variationen, sondern auch technische Unterschiede widerspiegeln. Die meisten der technische Variation können mittels Cq Werte der externen Kontrolle (Cel-MiR-238), die in anderen Test-Plattformen-18verwendet wird beurteilt werden. Da gab es keine standardisierten internen Kontrollen in MiRNA Analyse, sollten Informationen über technische Variation in der Analyse zur Bestimmung der Qualität der Assay-19einfließen. Technische Variation war schätzungsweise weniger als 3-fold in der Methode, die in diesem Bericht beschrieben. Obwohl es nicht möglich, die Qualitätsstufe für dieses Verfahren wegen des Mangels an vergleichbare technische Informationen in anderen Forschungseinrichtungen zu bestimmen ist, einschließlich Informationen trägt zur Verbesserung der Zuverlässigkeit und gewährleistet die Kompatibilität zwischen verschiedene Studien.
Eine Reihe von Publikationen haben berichtet, dass verschiedene pre-analytische Variablen wie Probenbehandlung, Lagerbedingungen und Lagerdauer vor der Verarbeitung die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der zirkulierenden MiRNA Messungen20 auswirken können , 21. Obwohl diese Studie nicht die Effekte von pre-analytische Variablen berücksichtigt, die folgenden Schritte folgten sorgfältig während der Probenvorbereitung, Variationen zu minimieren. Zuerst war Plasma so schnell wie möglich (innerhalb von 2 Stunden Post-Sammlung) verarbeitet, um die Wirkung der Stabilität der MiRNAs in Plasma8,22zu minimieren. Obwohl MiRNAs gelten bei Raumtemperatur (15-25 ° C), ist noch unklar, ob das Intervall zwischen Blutentnahme und Verarbeitung von Plasma oder Serum MiRNA Ebenen auswirkt. Zweitens wurde jede Probe Plasma Sichtprüfung beseitigen analytische Verzerrungen aufgrund von Kontamination mit lipämischen roten Blutkörperchen repräsentiert eines der Störfaktoren, die das Niveau der zirkulierenden MiRNAs23beeinflussen könnten.
Vorverstärkung ist nützlich, um den Nachweis sehr kleiner Mengen von MiRNAs in auszahlt zu verbessern, ohne die Einführung einer Erkennung Bias24. In der vorliegenden Studie zeigten die Cq-Werte der standard Kurven konstruiert vorverstärkt synthetische Oligonukleotide hohen Reproduzierbarkeit über die Assays. Dies erlaubt absolute Quantifizierung mit vorverstärkt Proben, die die Erkennung kleiner Mengen von MiRNAs aktiviert. Auf der anderen Seite zeigen niedrige Kopie Zahl Normen (1 x 102 oder 103 Kopie/µL) in Kombination mit Vorverstärkung nicht spezifischen Amplifikate. Mestdagh Et Al. 24 berichtet, dass die Messung von niedrigen Kopie Nummer MiRNAs höhere Schwankungen nach Vorverstärkung Verfahren zeigten im Vergleich zu mäßige oder hohe Kopie Nummer MiRNAs, aufgrund der geringen Effizienz der reversen Transkription, die das Ergebnis der MiRNA sein könnte Sequenz-Eigenschaften. Daher muss die Reichweite von Standardkurven für jede MiRNA vor der Quantifizierung von biologischen Proben, vor allem für vorverstärkt MiRNAs, um falsch-Positive Ergebnisse zu beseitigen validiert werden. Noch wichtiger ist, ist darauf hinzuweisen, dass die absolute Höhe der unterschiedlich verarbeitete MiRNAs wie vorverstärkt und nicht Pre-verstärkten Proben direkt verglichen werden können, da die Menge der vorverstärkt Probe nicht in jede MiRNA angegeben ist.
Dieser Bericht beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der absoluten MiRNA Niveaus im Plasma-Proben mit RT-qPCR. Auch nach Vorverstärkung konnten einige MiRNAs nachgewiesen werden. Um solch geringe Expression MiRNAs erkennen, möglicherweise ein anderen Ansatz verwendet werden. Obwohl mit einem größeren Stichprobenmenge dieses Problem als eine einfache Lösung umgehen kann, sind große Mengen an Probe nicht immer verfügbar. Bisher haben technologische Fortschritte die Entwicklung der verschiedenen Plattformen für MiRNA profiling25,26ermöglicht. Droplet digitale PCR (DdPCR) hat vor kurzem entwickelt worden und bietet eine alternative Methode zur konventionellen RT-qPCR für absolute Quantifizierung. Diese innovative Technologie wurde berichtet, um eine exakte, reproduzierbare und empfindliche Methode sein, die ein Ziel-MiRNA auf Ebene 1 Kopie/µL27,28erkennen kann. Wenn DdPCR eine niedrige Konzentration von MiRNAs ohne eine Vorverstärkung Schritt erkennen kann, wäre es ein großer Vorteil, da die Ebenen von mehreren MiRNAs miteinander verglichen werden können. Änderungen im Extraktionsverfahren und anschließende RT-qPCR und molekulare Plattform verwendeten Reagenzien werden unweigerlich Variable Ergebnisse bringen. Diese Variationen können jedoch gelöst werden, wenn transparente Ergebnisse der externen Kontrollen und absoluten Werte für einzelne MiRNAs zur Verfügung gestellt werden. Angemessene Qualitätsbewertung der Methode ist der Schlüssel zur Verbesserung der Unterscheidung von biologischen Veränderungen im MiRNA profiling Studien.
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Disclosures
Der Autor hat keine Interessenskonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung erhielten keine spezifischen Einräumung von Fördereinrichtungen in den öffentlichen, kommerziellen oder Non-Profit-Sektor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
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