Summary
Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.
Abstract
RT-qPCR tek tek hedef miRNAs değerlendirmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. MiRNAs düzeyleri genellikle örneği göre ölçülür. Fizyolojik değişiklikler hedef gen ifade düzeyleri incelenmesi için uygun bir yaklaşımdır. Ancak, mutlak miktar daha iyi istatistiksel analizi kullanılarak gen ifade düzeyleri kapsamlı bir değerlendirme için tercih edilir. Mutlak miktar ortak değil hala kullanın. Bu rapor plazma miRNA, RT-qPCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar.
EDTA-plazma sabit birim (200 µL) bilinçli cynomolgus maymunlar femoral ven toplanan kan üzerinden hazırlanan (n = 50). Toplam RNA ticari olarak mevcut sistemi kullanılarak ayıklandı. Plazma miRNAs miRNA özgü ileri/geri PCR astar ve yoklama içeren sonda tabanlı RT-qPCR deneyleri tarafından sayısal. Standart Eğriler mutlak miktar için piyasada bulunan sentetik RNA oligonucleotides kullanarak oluşturulan. Sentetik bir cel-miR-238 normalleştirme ve kalite değerlendirmesi için bir dış denetimi olarak kullanıldı. Miktar döngüsü (Cq) değerleri 35 yukarıda gösterdi miRNAs qPCR adım önce önceden güçlendirilmiş.
MiR-1, miR-206 ve miR-499a öncesi amplifikasyon onların düşük ifade seviyeleri nedeniyle gerekli ise muayene 8 miRNAs arasında miR-122, miR-133a ve miR-192 öncesi amplifikasyon tespit edildi. MiR-208a ve miR-208b sonra bile öncesi amplifikasyon tespit değildi. Örnek işleme verimliliğini çivili cel-miR-238 Cq değerleri tarafından değerlendirilmiştir. Bu tahlil yöntemde teknik değişim az 3 kat olarak tahmin edilmiştir ve miktar (LLOQ) alt sınırı 102 kopya/µL, çoğu muayene miRNAs için yapıldı.
Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi bir tahmin sağlar ve kalite değerlendirmesi farklı çalışmalar ilgili verileri sağlar. MiRNAs vücut sıvıları, ön amplifikasyon içinde az sayıda kötü tespiti geliştirmek yararlı olduğunu göz önünde bulundurarak miRNAs dile getirdi.
Introduction
Çalışmalar giderek artan sayıda edilmiş mikroRNA (miRNAs) Tanı ve Prognozunda kanserleri, biyolojik olarak keşfetmek veya izleme ve diğer hastalıklar tespit nonclinical ve klinik çalışmalar1,2',3 . Nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) Bu teknik Mikroarray4 ve RNA sıralamanın tabanlı platformlar5daha fazla duyarlı olduğundan tek tek hedef miRNAs, değerlendirmek için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir. Genel olarak, miRNA ifade ΔCq yöntem6kullanarak örneği göre ölçülür. Fizyolojik değişiklikler hedef gen ifade düzeyleri soruşturma için uygun bir yaklaşımdır. Ancak, miRNAs dolaşan göreli miktar yardımcı programı onların küçük miktarlarda nedeniyle sınırlıdır. Buna ek olarak, teknik değişim zor çünkü farklı laboratuvarlar RT-qPCR deneysel protokoller farklı, hangi için tutarsız açar özelleştirebilir veya hatta çelişkili sonuçlar farklı çalışmalar, sonuçlarını karşılaştırmak yapar Farklı çalışmalar7.
Endişeleri yukarıda belirtilen içinde görüş-in mutlak miktar miRNAs vücut sıvıları içinde küçük miktarlarda değerlendirilmesi için daha uygun olabilir. Mutlak miktar yöntem bilinen ilgili hedef miRNA8için sırayla aynı sentetik RNA oligonucleotides konsantrasyonları oluşturulan standart bir eğri kullanır. Sağlık ve Çevre Bilimleri Enstitüsü (HESI) teknik komite genomik üzerinde son zamanlarda birden çok test sitede plazma miRNAs, mutlak ölçümleri sonuçlarını karşılaştırmak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır. Sonuçlar miRNAs mutlak Nefelometri için standart bir protokol kullanarak birden çok test siteleri9arasında karşılaştırılabilir sonuç vermedi gösterdi. Bu da çalışmanın açıklanan RT-qPCR tahlil yöntemi birden çok miRNA hedefleri ve düşük ifade miRNAs tespiti yardım etmek için ön amplifikasyon çoğaltılmış analiz içeren HESI'ın standart iletişim kuralı için hemen hemen aynıdır.
Bu çalışmada, EDTA-plazma kandan hazırlanan bir sabit hacmi (200 µL) toplanan bilinçli cynomolgus maymunlar femoral ven (n = 50) kullanılan10yapıldı. Aşağıdaki iletişim kuralı ayıklama miRNA ve RT-qPCR öncesi amplifikasyon dahil olmak üzere, plazma numuneleri, hazırlanması için yordamı açıklar. Daha da önemlisi, böylece hedef miRNAs örneklerde miktarı nitelikli bir süreç ile birlikte onaylanabildiğini protokolü hakkında ek teknik bilgiler dahil, oldu. İlk olarak, her miRNA standart eğri onun miktar biyolojik örneklerde önce kendi bireysel algılama aralığı için doğrulandı. İkinci olarak, geçerli metodoloji kalitesini kapsamlı bir dış denetim (cel-miR-238) Cq değerlerinin yoluyla değerlendirilmiştir. Bu nedenle, bu platformun farklı çalışmalar veya laboratuar sonuçlarını karşılaştırmak için daha bilgilendirici ve güvenilir veri verir.
Temsilcisi sonuçları olarak 8 miRNAs profilleri bu rapora dahil burada açıklanan tahlil yöntemi. Bu miRNAs (miR-1, miR-208a, miR-208b ve miR-499a) kalp ve iskelet kası (miR-133a ve miR-206) kemirgenler ve insanlar3(miR-122 ve miR-192), karaciğer doku yaralanması ile potansiyel Emanet biyolojik ilişkili olarak önerilmiştir, 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Daiichi Sankyo Co., Ltd. tarafından kabul edildi
1. numune hazırlama
- Kan (en az 0.5 mL) cynomolgus maymunlar femoral ven EDTA 2 K içeren tüpler içine toplamak.
Not: Bu antikoagülanlar sonraki PCR14,15inhibe çünkü sitrat ve heparin kabul edilebilir değildir. - Toplanan örnekleri hemen buz ve plazma yalıtım koleksiyonunun 2 saat içinde için süreç üzerine koyun.
- 10.000 x g 5 min için 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant Santrifüjü 16.000 x g hücre artıkları ve kalan trombosit kaldırmak 5 min için 4 ° C'de, ardından 2 mL microtube içine aktarın.
Not: MiRNAs miktar önemli ölçüde trombosit kirlenme16tarafından etkilenebilir. - 200 µL aliquots süpernatant, taze 2 mL-mikrotüpler yerleştirin ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
Not: Her örnek sabit bir hacim RNA çıkarma için kullanılır; Bu nedenle, aliquot hacmi tam olması gerekir.
2. RNA çıkarma
- Donmuş numuneler (Kimden adım 1.5) buz çözme.
- Örnek buza RNA ayıklama sırasında soğuk tutmak. Lizis reaktif chill ve kullanmadan üzerinde buz önce kloroform.
- Lizis reaktif, Sample (200 µL), fenol ve guanidin isothiocyanate monophasic solüsyon içeren 5 cilt (1000 µL) ekleyin ve 1 dk. için vortexing tarafından kuvvetle karıştırın.
- 5 nM sentetik 5 µL eklemek Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
- Kloroform 1 hacmi (200 µL) ekleyin ve 1 dakika vortexing tarafından kuvvetle karıştırın.
- 2-3 dk için buz üzerinde tutun ve 12.000 x g 15dk için 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi.
- Sulu faz için yeni bir microtube dikkatli bir şekilde aktarın.
Not: herhangi bir organik faz (kırmızı) veya Interphase (beyaz) aktarılmaz. Toplanan sulu faz hacmi artan teknik değişim sonucu tutarsızlık işleme önlemek için tek tip olmalıdır. Sulu faz bu protokol için transfer her zamanki miktarı 650 µL oldu. - 1,5 birimleri (975 µL) etanol ve de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
- Örnek bir karşılık gelen sütun ve 3 min vakum manifoldlar kullanarak için vakum kurutma ardından Bağdaştırıcı, içine aktarın. Örnek birim 700'den fazla µL ise, kalan çözüm işlemek için bu adımı yineleyin.
Not: Sütun tabanlı RNA izolasyon vakum ve Santrifüjü yöntemi ile uyumludur. - Etanol 200 µL vakum kurutma için 1 dk ardından sütun ekleyin.
- RWT arabellek 800 µL vakum kurutma için 2 dk ardından sütun ekleyin.
- RPE arabelleği 800 µL vakum kurutma için 2 dk ardından sütun ekleyin.
- 2.11 arasındaki adımları yineleyin.
- Etanol 300 µL vakum kurutma için 1 dk ardından sütun ekleyin.
- Sütun yeni bir microtube üzerine yerleştirin ve 12.000 x g 1 dk (15-25 ° C) oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi.
- Sütun için yeni bir microtube aktarmak ve 50 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin.
- Oda sıcaklığında (15-25 ° C) 3 dk ve 1 dk. için 8.000 × g oda sıcaklığında (15-25 ° C), santrifüj taşımaktadır.
- Eluate sütun için yeniden uygulayın.
- 2.16. adımı yineleyin ve-80 ° C'de eluate kullanmak kadar saklamak.
3. cDNA sentezi
- Donmuş numuneler (Kimden adım 2.18) çözülme.
-
Hedef miRNAs için karşılık gelen sentetik RNA oligonucleotides bilinen konsantrasyonu hazırlayın.
- Sentetik RNA Oligonükleotid qPCR içinde standart bir eğri oluşturmak için kullanın. 1 x 108 kopya/µL konsantrasyon hisse senedi çözüm depolama amacı ile hazırlanmıştır.
- Hisse senedi çözüm 10 kat 1 x 107 kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 105 kopya/µL (önceden yükseltilmiş örnekleri) çalışma çözüm standart eğri oluşturmak için en yoğun olarak elde etmek için sulandırmak. Genel olarak, standart eğri konsantrasyonları için önerilen Aralık 1 x 107 ' ye 1 x 102 kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 105 ' e 1 x 100 kopya/µL (önceden yükseltilmiş örnekleri) dir.
- Multiplex RT astar havuzu 20 x RT astar hedef miRNAs için eşit miktarda karıştırılarak hazır olun.
Not: Şekil 2' de gösterildiği gibi 4 hedef miRNAs içeren bir havuzu 20 x RT astar her havuzda miRNAs karıştırılarak yapılabilir. Cel-miR-238 (dış denetimi) hedef miRNAs her tüpün içinde biri olarak dahil edilmelidir. Az 4 hedef miRNAs durumunda, 1/10 TE arabellek 20 x RT astar yerine eşit miktarda ekleyin. - RT tepki karışımı hazırlayın: (adımından 3,3), havuz 100 mM dNTPs dTTP ile 0,15 µL, ters transkriptaz (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT arabellek, RNase inhibitörü (20 U/µL) 0,19 µL 1 µL 3 µL RT astar ve su 4,16 µL nükleaz ücretsiz.
- Mix 10 µL RT tepki pipetting tarafından RNA örnek (Kimden adım 3.1) veya oligonucleotides (Kimden adım 3.2) 5 µL karıştırın ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
- Ters transkripsiyon termal cycler cihazları üzerinde çalıştırın: 16 ° C 30 dk, 30 dk, 42 ° C için tarafından takip son ters transkriptaz inactivation adım 5 dk. 85 ° C'de mağaza ters kopya etmek örnekleri-80 ° c kadar kullanmak.
4. preamplification (isteğe bağlı)
Not: Cq değerleri 35 veya daha sonraki qPCR yukarıda göstermek miRNAs önceden güçlendirilmiş.
- Donmuş numuneler (Kimden adım 3.6) çözülme.
- Sentetik RNA oligonucleotides RT ürün 10 kat seri dilutions olun; 1 x 10-5 1 x 100 kopya/µL standart eğri oluşturmak için.
- Multiplex tahlil astar havuzu eşit birimleri (5 µL) karıştırılarak tahlil astar x 20 hedef miRNAs son konsantrasyon 200-fold seyreltilmiş her tahlil astar ile hazırlamak son hacmi 1000 µL'TE arabellek tarafından.
Not: kimin hedef miRNAs sonraki qPCR öncesi amplifikasyon ve olanlar için cel-miR-238 (dış denetimi) olmadan tespit olabilir tahlil astar astar havuza dahil değildir. - Öncesi amplifikasyon tepki karışımı hazırlayın: 2 x kullanıma hazır preamplification reaktif, tahlil astar Havuzu (Kimden adım 4.3) 3.75 µL ve su nükleaz ücretsiz 6,25 µL 12.5 µL.
- Mix 22,5 µL öncesi amplifikasyon tepki pipetting tarafından ters kopya etmek örnek (Kimden adım 4.1) veya oligonucleotides (Kimden adım 4.2) 2.5 µL karıştırın ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
- Reaksiyon termal cycler cihazları üzerinde çalıştırın: 95 ° C 10 dakika; 15 s ve 60 ° C 4 dakika süreyle-80 ° C'de önceden yükseltilmiş örnekleri kullanmak kadar saklamak için 95 ° C 12 döngüsü tarafından takip ettim.
5. kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR)
- Donmuş numuneler (Kimden adım 3.6 veya adım 4.6) çözülme.
- Örnekleri 5-fold seyreltik steril su ile.
- Sentetik RNA oligonucleotides türetilmiş RT ürünün 10 kat seri dilutions hazırlamak; 1 x 107 ' ye 1 x 102 kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 105 ' e 1 x 100 kopya/standart eğriler oluşturmak için µL (önceden yükseltilmiş örnekleri).
- QPCR reaksiyon karışımı hazırlayın: 2 x kullanıma hazır amplifikasyon reaktif, 20 x tahlil reaktif, ileri/geri PCR astar ve hedef miRNA için karşılık gelen yoklama içeren 1 µL ve 7 µL nükleaz ücretsiz su 10 µL.
- 18 µL qPCR reaksiyon karışımından hızlı optik 96-iyi tepki tabakaları bana aktarın ve (Kimden adım 5.2 veya adım 5.3) seyreltilmiş örnekleri 2 µL kuyu ekleyin.
Not: Örnekleri ve qPCR için standartlar çoğaltmaları ayarlanır. - Yapıştırıcı film ile plaka mühür ve kısaca santrifüj kapasitesi.
- Tepki gerçek zamanlı bir termal cycler çalıştırın: 20 95 ° C s 95 ° C 45 döngüsü tarafından takip, 1 s ve 60 ° C 20 s.
6. veri analizi
- Her örnek ile ilgili gerçek zamanlı termal cycler çalışan veri analiz yazılımı kullanarak ham kopya sayısını hesaplamak için.
Not: Eşik satırı el ile çalışma, tüm plakaları "1.0" onların Cq vadilerin yasland tekrarlanabilirlik onaylamak için ayarlanır. Cut-off düzeyi Cq ayarla > 40 döngüleri. - Yinelenenleri alınan her örneğin ham kopya sayısı ortalamasını hesaplamak.
- Düzeltme faktörü cel-miR-238 karşılık gelen tüp içinde tüm örnekleri kopya sayısı ortalama cel-miR-238 her örnek kopya sayısı bölünerek hesaplayın.
Not: Şekil 2' de gösterildiği gibi cel-miR-238 (dış denetimi) dahil olmak üzere 4 hedef miRNAs kadar her tüp içerir. Bu nedenle, düzeltme faktörü karşılık gelen cel-miR-238 değerini kullanarak her tüp için hesaplanır. - Düzeltilmiş kopya sayısını her örnek (Kimden adım 6.2) ortalama ham kopya sayısı bölerek her örnek için düzeltme faktörü (Kimden adım 6.3) tarafından hesaplamak.
- Tarafından her örnek (Kimden adım 6.4) ayarlanan ham kopya sayısını çarparak mutlak kopya sayısını hesaplamak için her örnek seyreltme faktörü.
Not: Adım 5.2 türetilmiştir bu iletişim kuralı, "5" seyreltme faktörüdür. - Cq değerler günlük cDNA konsantrasyon karşı her seri seyreltme için arsa PCR güçlendirme yamaç üzerinden verimliliği hesaplayın.
Not: verimlilik hesaplamak için formül; E = (10(-1/yamaç) -1) x %100. - Cel-miR-238 E formülü kullanarak tüm örnekleri Cq değerleri kullanarak teknik değişim hesaplamak = (2 x amplifikasyon etkinliği)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
Not: Adımlar 6.5 ve 6.7 yordamı kalite değerlendirmesi için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RT-qPCR tarafından miRNA testin iş akışı ve kalite assessment
Şekil 1 qPCR10kullanarak kan örnekleri miRNA tahlil iş akışı gösterir. Deneyler kalitesini cel-miR-238 dış denetimi de dahil olmak üzere tarafından doğrulanabilir. Bu RNA ayıklama teknik farklılığı ortaya çıkaracaktır ve sonraki RT-qPCR işler. Bu çalışmada, Cq değerleri 50 örnekleri hesaplanan ortalama ± SD 21,0 ± 0,4 (Tablo 1) yapıldı. Cel-miR-238 öncesi amplifikasyon adım nedeniyle düşürülmüştü, Cq değeri olsaydı 24.2 ± 0,4 (Tablo 1). Burada açıklanan tahlil yönteminde teknik değişim ölçüde daha az 3 kat Cq değerleri arasındaki farkı temel alan tahmin edilmiştir. Bile dahil edilecek ek öncesi amplifikasyon adım vardı değişim derecesi tutarlı kaldı. Fare, sıçan ve insan bu laboratuvar (veri gösterilmez) gerçekleştirilen gibi bu değerleri farklı hayvan türleri, diğer örnekleri için o ile uyumlu.
Hedef miRNA için standart eğri tespit aralığı
Örnekleri öncesi yok amplifikasyon
1 x 107 kopya/µL konsantrasyonları, sentetik RNA oligonucleotides ters kopya etmek (RT) ürün seri olarak sonraki qPCR önce düşürülmüştü. Bu serisi öncesi amplifikasyon adım tespit tüm biyolojik örneklerin tutarlı kapsama sağlamış standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır. 1 x 102 kopya/µL konsantrasyon standart örnek Cq değerleri genellikle yakın düzeyleri için her hedef miRNA kesik vardı. Bu nedenle, algılama sınırı 1 x 102 kopya/µL (şekil 3) olarak tahmin edildi.
Önceden yükseltilmiş örnekleri
Öncesi amplifikasyon gerektiren örnekleri tespit aralığı belirlemek için iki farklı dizi seyreltilmiş örnekleri, şekil 4' te gösterildiği gibi karşılaştırıldı. Standart eğri A oluşturmak için önce ön amplifikasyon adım RT ürünün seri dilutions hazırlanmıştır. O zaman önceden güçlendirilmiş standartları dizi sonraki qPCR için kullanıldı. Standart eğri B oluşturmak için ilk seyreltme önceden yükseltilmiş örnekleri 1 x 105 kopya/µL bir konsantrasyon için yapılmıştır. Bu standart eğrileri görünüşte farklı algılama sınırları (şekil 5) gösterdi. Standart eğri B doğrusal Aralık 1 kopya/µL aşağı artış olsa da, standart eğri A konsantrasyonlarda 10'dan daha az belirli amplicons için kullanılamadı2 veya 103 kopya/µL (şekil 5). Bu sonuç miRNAs son derece küçük miktarlarda bile öncesi amplifikasyon adım ile değerlendirildi önerdi. Cq değerler olduğunda buna ek olarak, önceden yükseltilmiş örnekleri dikkatle yorumlanmalıdır > 30, çünkü önceden yükseltilmiş örnekleri algılama sınırları kapatmak için bu değeri. Bu nedenle, bir kural olarak, standart eğri B burada, tespit aralığı belirledikten sonra açıklanan yöntemi yalnızca standart araziler yetersiz sayıda kullanarak önlemek için kullanılmıştır.
Sonuç olarak, miktar (LLOQ) alt sınırı 102 kopya/µL miRNAs (şekil 3 ve şekil 5) çoğu için yapıldı. Sadece daha yüksek bir LLOQ miR-1 gösterdi (103 kopya/µL) (şekil 5). Ortalama amplifikasyon verimliliği yaklaşık % 90, korelasyon katsayısı (R2) ile 0.998 1.000 için değişen standart eğrilerinin olduğunu. Doğru bir RT-qPCR tahlil işaretlerinden bir doğrusal R2 0,98 ve PCR güçlendirme verimliliğini 90-%11017daha büyük veya eşit olarak kabul edilir. Bu nedenle, tahlil standart eğrileri kalitesini doğrulandı.
MiRNAs küçük miktarlarda için ön amplifikasyon etkileri
Cq değerleri 35 veya daha yüksek yukarıda sonraki qPCR gösterdi miRNAs önceden güçlendirilmiş. Bu yordamı miRNAs küçük miktarlarda tespiti gelişmiş. Örneğin, pre amplifikatör miR-206 Cq değerleri (Ortalama ± SD) azalma 27.0 ± 2.2 37,9 ± 1.9, süre önceden güçlendirilmiş miR-206 oldu. Yinelenen ölçüm çiftleri arasında önemli farklılıklar öncesi güçlendirilmiş örneklerinde yüksek Cq değerlerinde (şekil 6) tespit edildi. Buna ek olarak, önceden yükseltilmiş örnekleri hemen hemen eşit değerler çoğaltmaları (şekil 6) gösterdi. Bu sonuçlar bu öncesi amplifikasyon örnekleri küçük miktarlarda durumlarda daha doğru ve güvenilir veri sağlamak için etkili olacağını belirtti.
Plazma miRNAs cynomolgus maymunlar içinde profilleme
Kurulan tahlil platformu kullanarak, 50 cynomolgus maymunlar vardı üzerinden 8 miRNAs (miR-1, miR-122, miR-133a, miR-192, miR-206, miR-208a, miR-208b ve miR-499a) plazma seviyeleri (Şekil 7)10analiz. MiR-1, miR-206 ve miR-499a öncesi amplifikasyon onların düşük ifade seviyeleri nedeniyle gerekli ise bu tahlil, miR-122, miR-133a ve miR-192 öncesi amplifikasyon tespit edildi. Ancak, ne miR-208a ne de miR-208b bile öncesi güçlendirme ile saptanabilir. Verileri normal dağıldığı değil; Bu nedenle, bir Logaritmik dönüşüm onların ortalama ve standart sapma hesaplamak için gerçekleştirilen. Muayene, miR-122 miRNAs arasında en yüksek ortalama plazma seviyesi (5.71 x 104 kopya/µL), (20) ile küçük bir Dinamik Aralık gösterdi. Buna ek olarak, büyük dinamik aralıkları (581-fold), miR-1 için gözlendi miR-133a (971-fold) ve miR-206 (426-fold).
Resim 1 : RT-qPCR tarafından miRNA testin şematik iş akışı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Şematik iş akışı miRNA tahlil, ters transkripsiyon. 4 hedef miRNAs içeren bir havuzu 20 x RT astar her havuzda miRNAs karıştırılarak yapılabilir. Cel-miR-238 (dış denetimi) hedef miRNAs her tüpün içinde biri olarak dahil edilmelidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| miR-238 veri analizi | ||
| Olmadan Öncesi amplifikasyon |
İle Öncesi amplifikasyon |
|
| N | 50 | 50 |
| Demek | 21.0 | 24,2 |
| SD | 0,4 | 0,4 |
| Max Cq | 21,8 | 25,3 |
| Min Cq | 20,3 | 23,5 |
| Medyan | 21.0 | 24,2 |
| Max-Min | 1.3 | 1.8 |
| Amplifikasyon etkinliği | 89 | 89 |
| Varyasyon | 2.4 | 2.8 |
Tablo 1: kalite değerlendirmesi miktar döngüsü (Cq) değerlerinde cel-miR-238. Teknik varyasyonlar miR-238 her tahlil Cq değerlerinden değerlendirildi. Öncesi amplifikasyon olmadan (sol) adımı veya elli örnekleri (sağ) karşılık gelen iki gruba ayrıldı. Varyasyon E formül kullanılarak hesaplanan = (2 x amplifikasyon etkinliği)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Amplifikasyon etkinliği standart eğrinin eğimini hesaplanır. Öncesi amplifikasyon adım gerektiren örnekleri öncesi amplifikasyon adımı sırasında seyreltilmiş (miR-238 kendisi önceden yükseltilmiş değildi). Bu rakam bizim rapor10değiştirildi.
Şekil 3 : Arsa pre amplifikatör örnekleri için standart eğrilerinin. Standart eğrileri (N = 3, yinelenen) günlük konsantrasyon Cq. lineer regresyon analizi hesaplanan amplifikasyon verimliliği için karşılık gelen yamaç belirlemek için karşı komplo tarafından oluşturuldu. Standart eğrileri miR-122 (üst), miR-192 (orta) ve miR-133a (alt) test mesafeden Cq ve konsantrasyon arasında doğrusal ilişki gösterdi. Standart eğrileri hata çubukları üç bağımsız deneyleri bir standart sapmayı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Yordam önceden yükseltilmiş örnekleri için standart eğriler oluşturmak için. (Standart eğri A) Sentetik oligo (1 x 105 kopya/µL) temsilcisi bir konsantrasyon transkripsiyonu, standart örnek 10 kat seri seyreltme dizi hazırlayarak takip geri vitese gitti. Önceden güçlendirilmiş bu standartları için sonraki qPCR kullanılmıştır. (Standart eğri B) Sentetik oligo (1 x 105 kopya/µL) temsilcisi bir konsantrasyon transkripsiyonu ve önceden güçlendirilmiş geri vitese gitti. O zaman, standart örnekleri 10 kat bir seri seyreltme serisi sonraki qPCR önce hazırlanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Önceden yükseltilmiş örnekleri için standart eğrileri A ve B arsa. Standart eğri A (n = 1, yinelenen) ve standart eğri B (n = 3, yinelenen) günlük konsantrasyon Cq. lineer regresyon analizi hesaplanan amplifikasyon verimliliği için karşılık gelen yamaç belirlemek için karşı komplo tarafından oluşturuldu. (Üst) Standart eğri B (düz çizgi) Cq ve konsantrasyon arasında doğrusal ilişki miR-1 test mesafeden gösterdi, ancak standart eğri bir (noktalı çizgi) 1 x 102 kopya/µL, görünüşe göre non-spesifik amplicon gösterdi. (Orta ve alt) Standart eğri bir (noktalı çizgi) hiçbir amplicon 1 x 102 kopya/µL ya da alt, konsantrasyonları gösterdi standart eğri ise B (düz çizgi) gösterdi Cq ve konsantrasyon arasında doğrusal ilişki miR-499a test mesafeden ve miR-206. Standart eğri B, hata çubukları üç bağımsız deneyleri bir standart sapmayı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Güçlendirme arsa pre amplifikatör ve önceden yükseltilmiş örnekleri için. (Üst) miR-206 temsilcisi örneklerinde (A, B, C) olmadan (üst), amplifikasyon arsa veya öncesi amplifikasyon (alt) ile. Ölçüler içinde yinelenen tuzağa düşürüldük. Çoğaltmaları pre amplifikatör örnekleri, özellikle yüksek Cq örnekleri (A ve B) olarak ayarlamak iki örnek arasındaki farklar vardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Plazma mikroRNA (miRNAs) cynomolgus maymunlar mutlak değerini. MiRNAs ifade düzeyleri nokta araziler tarafından gösterilir. Ortalama ve değer ve üstü (gri kutusunda gösterilen) demek, iki standart sapma aşağıdaki için logaritmik dönüşüm sonra belirlenmiştir. Bu rakam bizim rapor10değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim kapsamlı değerlendirme ölçüde bireysel örnekleri arasında varyasyon büyüklüğü test miRNAs arasında son derece farklı olduğunu açıkça belirtti dinamik aralığının daha titiz bir istatistiksel analize sağlanan. Bu varyasyonlar vücut sıvıları onların küçük miktarlarda atfedilebilecek olabilir, ancak bu veriler sadece biyolojik varyasyonları, aynı zamanda teknik varyasyonlar yansıtmak belirtmek gerekir. Teknik değişim çoğu aracılığıyla diğer tahlil platformlar18' kullanılan dış denetim (cel-miR-238), Cq değerlerinin tespit edilebilir. MiRNA analizde Standart İç Denetim olmuştur beri teknik değişim hakkında bilgi tahlil19kalitesini belirlemek için analiz, dahil edilmelidir. Teknik değişim tahmin daha az 3 kat olmak bu raporda açıklanan yöntemi. Diğer araştırma karşılaştırılabilir teknik bilgi eksikliği nedeniyle bu yordamı için kalite düzeyini belirlemek mümkün olmasa da, dahil olmak üzere güvenilirliği geliştirmek için katkıda bulunur ve arasında uyumluluk sağlar Farklı çalışmalar.
Son Makaleler bir dizi örnek işleme, saklama koşulları ve işlemeden önce depolama süresi gibi çeşitli önceden analitik değişkenleri güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik miRNA ölçümleri20 dolaşan etkisi olabilir bildirdin , 21. her ne kadar bu çalışmada önceden analitik değişkenleri etkileri dikkate almadı, aşağıdaki adımları dikkatlice varyasyonları en aza indirmek için numune hazırlama sırasında takip edildi. İlk olarak, plazma (içinde 2 saat sonrası koleksiyonu) mümkün olduğunca çabuk miRNAs plazma8,22kararlılığını etkisini en aza indirmek için işlendi. MiRNAs oda sıcaklığında (15-25 ° C) istikrarlı olarak kabul rağmen kan toplanması ve işlenmesi plazma veya serum arasındaki aralığı miRNA düzeylerini etkileyip hala belli değil. İkinci olarak, plazma örnekleri görsel olarak analitik önyargı ile hemolyzed kırmızı kan hücreleri, bir miRNAs23dolaşan düzeyde etkileyebilir karıştırıcı faktörlerin temsil eden kirlenme kaynaklanan ortadan kaldırmak için kontrole tabi tutuldu.
Öncesi amplifikasyon olmadan tanıtan bir algılama önyargı24miRNAs biofluids içinde son derece küçük miktarlarda tespiti geliştirmek yararlıdır. Bu da çalışmanın, önceden güçlendirilmiş sentetik oligonucleotides kullanılarak inşa standart eğrilerinin Cq değerleri yüksek tekrarlanabilirlik deneyleri arasında gösterdi. Bu miRNAs küçük miktarlarda algılama etkin önceden yükseltilmiş örnekleri kullanarak mutlak Nefelometri izin verdi. Öte yandan, düşük kopya numarası standartları (1 x 102 veya 103 kopya/µL) öncesi güçlendirme ile birlikte belirli amplicons, gösterme. Mestdagh ve ark. 24 düşük kopya numarası miRNAs ölçümü orta ya da yüksek kopyaya miRNA sonucu olabilir ters transkripsiyon düşük verimlilik nedeniyle numara miRNAs kıyasla daha yüksek değişim öncesi amplifikasyon yordamı sonra gösterdi bildirdi sıra özellikleri. Bu nedenle, algılama mesafesi her miRNA için standart eğrilerinin miktar için özellikle önceden güçlendirilmiş miRNAs yanlış pozitif sonuçları ortadan kaldırmak için biyolojik örneklerin önce doğrulanması gerekir. Daha da önemlisi, bu önceden yükseltilmiş örnek miktarı her miRNA belirtilmediği için önceden güçlendirilmiş ve öncesi güçlendirilmiş örnekleri gibi farklı şekilde işlenmiş miRNAs mutlak düzeyde doğrudan karşılaştırıldığında olamaz belirtmek gerekir.
Bu raporu kullanarak RT-qPCR plazma örnekleri mutlak miRNA düzeylerinin tayini için bir yordam açıklanır. Bazı miRNAs sonra bile öncesi amplifikasyon algılanmadı. Böyle düşük ifade miRNAs algılamak için kullanılmak üzere farklı bir yaklaşım olabilir. Daha büyük bir örnek miktar kullanarak basit bir çözüm olarak bu sorunu aşmak rağmen büyük miktarlarda örnek her zaman mevcut değildir. Bugüne kadar teknolojik gelişmeler çeşitli platformlar için25,26profil oluşturma miRNA gelişimi etkinleştirdiniz. Damlacık dijital PCR (ddPCR) son zamanlarda geliştirilen ve geleneksel RT-qPCR mutlak miktar için alternatif bir yöntem sunar. Bu yenilikçi teknoloji hedef miRNA 1 kopya/µL27,28seviyede algılayabilir kesin, tekrarlanabilir ve hassas bir yöntem olmaya bildirilmiştir. DdPCR miRNAs öncesi amplifikasyon adım olmadan düşük konsantrasyon algılarsa, çünkü birden çok miRNAs düzeyde birbirleriyle karşılaştırılabilir büyük bir avantaj olur. Çıkarma yordamları ve sonraki RT-qPCR, moleküler platformu ve kullanılan reaktifler değişiklikler kaçınılmaz değişken sonuçlar verir. Ancak, harici kontroller ve bireysel miRNAs için mutlak düzeyleri saydam sonuç verdiyse bu varyasyonlar çözülebilir. Uygun kalite değerlendirmesi yönteminin çalışmalar profil oluşturma miRNA biyolojik değişiklikler muhakeme geliştirmek anahtarıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması vardır.
Acknowledgments
Bu araştırma belirli herhangi bir hibe finansmanı kuruluşları kamu, ticari veya değil, kar amacı gütmeyen sektörlerde üzerinden almadı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
