Summary
Здесь мы представляем протокол для увеличения производства Химера без использования нового оборудования. Изменение простой ориентации эмбриона для инъекций может увеличить количество зародышей и потенциально сократить сроки передачи микрофлорой.
Abstract
В целях повышения эффективности в деле создания генетически измененных мышей через клетки ES методологии мы представляем адаптация к нынешнему Протоколу инъекции бластоциста. Здесь мы приводим простой поворот эмбрион, и инъекции через транс-внутренней клеточной массы (TICM) увеличение доли химерных мышей от 31% до 50%, без дополнительного оборудования или дальнейшей специализированной подготовки. 26 различных инбредных клонов, и 35 всего клоны были введены в течение 9 месяцев. Существует никакого существенного различия в беременности или скорость восстановления эмбрионов между традиционными инъекций методы и TICM. Таким образом без каких-либо крупных изменений в процессе впрыска и простого позиционирования бластоцисты и инъекций через ICM, выпустив ES клеток в полость blastocoel потенциально может улучшить количество химерных производства и последующего микрофлорой передачи.
Introduction
Почти 25 лет создание генетически целенаправленные мышей был медленный процесс, часто препятствует узкое место на этапе микроинъекции клеток бластоцисты ES для поколения микрофлорой, препровождающее химер. Последние достижения, включая ТРИФОСФАТЫ/Cas91,2 ориентации в клетки ES и высок объём ES клеток поколения консорциумов как комп, улучшили поколения/наличие генетически модифицированных ES клеток. Однако поколение микрофлорой химер остается узким местом в создании генетически измененных мышей от этих клеток ES3,4. Высок объём ES клеток поколения проектов были страдает от высокой изменчивости качества клеток ES, который имеет решающее значение для успешного создания химер микрофлорой. Кроме того некоторые из часто используемых линий клетки ES известны высокой анеуплоидии и сложные производства микрофлорой компетентным химер5.
Многие методы были разработаны для создания мышей с либо выше химера, или полностью клеток ES производных мышей6,,78,9,10. Хотя каждая из этих систем имеет свои достоинства, они также имеют свои недостатки. Поколение тетраплоидные химер, в то время как генерации клеток ES 100% полученных мышей, является неэффективным и обычно ограничивается беспородных линии 5,6. Новые методы инъекций морулы может принести высокий процент химер, приближается к 100%, но как правило, требуют значительного дополнительного оборудования (лазеры или piezos) и подготовки10,11. В лабораториях, где эти методы уже на месте эта новая методология не может быть необходимым.
Это исследование цель заключалась в том, чтобы найти метод, который использует общие методы и оборудование легко доступны для увеличения скорости поколения химера, увеличивая микрофлорой передачи аллеля мутанта шанс создать последующие мыши колонии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все операции были проведены как часть нормальной эксплуатации объекта NIEHS Knock Out мыши Core. Все мышей держали на 12:12 ч света: темные цикл и были кормить диете из низ-31 и воды ad libitum. Все эксперименты были проведены в соответствии с животное уход и использование Комитета национального института окружающей среды медицинских наук.
1. животных подготовка
- Порода мышей доноров, В6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j. самок мышей на 8-10 недель возраста, естественно B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j. самцов мышей от 8 до 26 недель возраста. Вилки визуально проверьте следующее утро (E0.5).
- Порода получателей мышей, Швейцарский Уэбстер самок мышей между 6 и 9 недель возраста естественно разводят для вазэктомии Швейцарский Уэбстер самцов мышей. Вилки визуально проверьте следующее утро (E0.5).
2. Подготовка клетки ES
- Для 129-derieved AB2.2 ES клеток, культуры клеток в среде DMEM, с 15% FBS, 1% глютамина, 1% Пенн/воспаление и 0,1% β-меркаптоэтанол. Культура все другие клетки ES инструкции ES клеток поставщика, используя их Рекомендуемые протоколы.
3. эмбриона коллекция
-
Анатомирование животных
- Готовить несколько блюд 60 мм, примерно 1 / 5 мышей плюс 3 экстра, с 10 мл сбора абразива (BCM) (10% FBS в среде DMEM), и один из 4 хорошо блюдо с 0,5 мл BCM в колодец. Сбалансировать при 37 ° C, 5% CO2.
- Усыпить B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j. самок мышей на E3.5 с использованием CO2 удушья, с расходом 10%.
- После euthanizing, мышей в лежачем положении и мокрой живота тщательно с 70% этиловом спирте.
- Сделайте первый разрез через кожу только в середине живота, что делает открытие, как можно шире. Далее откройте через брюшную стенку, снова делая надрез максимально широким.
Примечание: Это в два этапа помогает уменьшить или устранить загрязнения меха. - Начиная яичника и проведение жировой ткани яичника с тупым щипцами, осторожно удалите, яичников, маточных труб и матки, принимая особую осторожность, чтобы свести к минимуму жировой ткани. Удаление матки, как единое целое или как отдельные рога, без изменения в следующей процедуре.
- После удаления место матки в блюдо 60 мм, содержащие абразив коллекции.
-
Удаление эмбрионов
- Подготовки шприц 10 мл, заполненный БСМ и подходят с 25 G иглы.
- Один из матки, в то время, удалите их из Холдинг блюдо BCM, промокните их на ткани, чтобы удалить избыток крови и место в 60 мм блюдо под низким увеличением рассекает микроскопом.
- Удерживая тщательно и аккуратно матки чуть ниже дистального конца (возле маточных труб) с рассечения щипцы, Вставьте иглу в к центру матки в качестве параллельно плоскости как можно. Вставьте иглу только за советы щипцы.
- Применить некоторое давление на щипцы придерживаться иглы матки и высылать примерно 1 мл BCM через рога матки.
Примечание: Будьте внимательны на этот шаг, как слишком большое давление на шприц вызовет неконтролируемый поток средств массовой информации, часто оставляя блюдо. - После промывки матки, до 5 всего матки за 60 мм блюдо, поместите блюдо обратно в инкубаторе до коллекции.
-
Эмбрион коллекция
- С помощью пипетки Рисованные стекла руки и рот пипеткой аппарата, собирайте бластоцисты под областью рассечения, от 25 X 35 X. (Рис. 1).
Примечание: Рот пипеткой аппарат состоит из 30-40 см гибкий трубопровод, младше 5 мм и.д. вставить 1 000 наконечник пипетки мкл, первый пункт в один конец и прикрепите стеклянной пипетки в нем. Добавление фильтра шприц на другом конце, ствол прилагаемый 1 cc шприц, не поршень, чтобы действовать как рот кусок. - Удаление блюда из инкубатора и с помощью сетки, изучить каждый частью блюдо для эмбрионов. Эмбрионы выбираются индивидуально вверх и место на падение BCM в вторичной блюдо.
- После сбора всех блюд, мыть эмбрионы еще раз в капли свежего BCM, а затем место в 4 хорошо блюдо дождаться инъекций.
- С помощью пипетки Рисованные стекла руки и рот пипеткой аппарата, собирайте бластоцисты под областью рассечения, от 25 X 35 X. (Рис. 1).
4. эмбриона инъекций
- Подобрать клетки ES индивидуально с инъекционной иглы, на основе подтверждения.
- Приготовить блюдо инъекции, добавив 5-7 мл инъекционного СМИ (DMEM, 10% FBS и 20 мм HEPES) для инъекций блюдо дно стекла. Инъекции делаются при комнатной температуре.
- С помощью воздух или масло microinjector, обратиться иглу рисовать ES клеток вакуум. Позаботьтесь, чтобы сохранить как мало места как можно между ячейками. Подсчет клеток ES здесь, или на шаге инъекций.
- Выберите ES клеток, которые являются средних и небольших по размеру, по сравнению с общим населением клеток, с гладкой поверхностью и без явных дефектов, таких как вакуоли.
Примечание: ES клеточных популяций различаются в морфологические качества и стандартов, используемых потребуется скорректировать с ними.
- Придать эмбрионов с примерно 15 ES клеток (рис. 1).
- Прикрепить Холдинг пипетки подсказка для второго microinjector воздуха и положение эмбриона вблизи Открытие держателя. Применение вакуума для обеспечения эмбриона в держатель.
- Отрегулируйте по оси z, перемещая Холдинг пипеткой вверх или вниз так, что эмбрион просто трогательно слайда, затем тонкой упором на zona. Далее настройте оси Z инъекционной иглы, так что клетки ES недалеко от оконечности находятся в центре внимания.
- Теперь настройте эмбриона, осторожно нажав из иглу в верхней или нижней, повернув его положить ICM в нужное положение.
- Вставьте иглу через zona и ICM или трофобласта, используя фирмы, но контролируемые push. Приложите небольшое давление к microinjector инъекционной иглы, чтобы помочь сохранить blastocoel от коллапса.
- После того, как игла проникла blastocoel, давление от microinjector для передачи клетки ES blastocoel эмбриона. Пауза вкратце как скос иглы начинает выйти из эмбриона, чтобы позволить давление в эмбрион вернуться к нормальной жизни, сохраняя при этом клетки.
Примечание: Ссылки группы ES клеток вводили обычно телефоны, следуя традиционной ES инъекции протокол9, стараясь не коснуться ICM. Клетки ES были также вводят через ICM, толкая иглы непосредственно через ICM (TICM) (Рисунок 2Дополнительные фильм).
5. Передача eEmbryos
- Трансфер эмбрионов мышей Swiss Вебстер на E2.5, используя устройство передачи-безоперационное эмбриона, за производство процедуры. Это не хирургическая процедура не требует анестезии или специальное послеоперационное ухода. Дом мышей индивидуально после переноса эмбрионов и путем доставки и последующих отъема.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лечении линия клетки как случайный эффект, смешанные эффекты линейная модель была использована для анализа данных в программном обеспечении (например, SAS (версия 9.2)). Каждый анализ, контролируемых количество эмбрионов переведены и линии клеток. Второй анализ, также контролируется количество детенышей, которые выжили.
Для этого исследования, каждая линия клетки ES и клон был введен как с традиционными, так и TICM методы, чередующихся между двумя методами после каждого эмбриона. После инъекции эмбрионы были отделены на блюдо и сгруппированных по передачи, как правило, между 12 и 15 эмбрионов за получателей девушки. Эмбрионов, которые не имеют четко видны blastocoel, не хватало Zona pellucida, или там, где microinjected клетки ES удалось войти blastocoel, были исключены из этого эксперимента.
Первые данные изучены был беременности. Как показано на рисунке 3, показатели беременности были неизменными в группе TICM из контрольной группы. Кроме того, равное количество детенышей выжили до отъема (P = 0,50, рис. 4). Самое главное, тогда как количество мышей при отлучке, остается неизменным, количество детенышей отображение пальто цвета химеризма увеличилась с 31% до 50% для группы TICM (p = 0,005, рис. 5). Степень пальто цвета химеризма считался слишком субъективный характер, должны оцениваться в этом исследовании и не действительно отношение к химеризма микрофлорой.
Рисунок 1: специализированное оборудование. (Слева) Инъекции Микроскоп установки, включая микро манипуляторов (A) и (B) клеток трамвай воздуха. (Справа) Рот пипеткой аппарат, с Рисованные стеклянные пипетки (C) , наконечник пипетки (D) 1000µL, трубы (E) , фильтр (F) и (G) шприц ствол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: пример бластоциста эмбриона инъекций. (A, B) Традиционные инъекционный метод, где Инъекционная игла входит напротив от ICM, избегая какого-либо взаимодействия с ICM. (C, D) TICM метод, где Инъекционная игла входит непосредственно через ICM в blastocoel. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: коэффициент беременности. Частота беременности показали никакого существенного различия между традиционными (39/50) и TICM (64/76). Средние плюс Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: выживаемость. Выживаемость — это количество детенышей, которые выжили в отлучке, где был помет отучить. Щенков, которые не сохранились до отъема и пометы, где не детенышей выжили в отлучке, не были включены в эти данные. Средние плюс Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: скорость химеризма. Эти данные только представляет номер, если химер производства и не затрагивает качество химеризма. В традиционной группе 31% (34/110) потомства показали химеризма, где группа TICM в среднем на 50% (79/158). Средний плюс Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Долго думал, что любое нарушение ICM может привести к смертности, в самом деле, текущий бластоциста микроинъекции протоколы еще предупредить этот12,13. То, что мы показали здесь, что микроинъекции через ICM не наносит ущерба эмбриона и увеличивает доходность химер.
Точный механизм этого эффекта выявлено не было. Однако механические нарушения ICM и сопутствующие Гипобласт, следует увеличить масштабы интеграции клетки ES в новообразованной ICM, после микроинъекции. Последние работы в области iPSCs показал, что механическая стимуляция помогает перепрограммировать человеческий iPSC14. Если механические манипуляции имеет аналогичный эффект в ICM эмбриона мыши, он может иметь эффект возвращения клетки ICM, который потенциально начал различать обратно к состоянию pluripotent, удаление потенциал «старт» бластоциста донора производные ячейки в формировании эмбриональных тканей. И наконец вполне возможно, что инъекции через результаты ICM в смерти неизвестное количество клеток в ICM, снижение уровня конкуренции для microinjected генетически модифицированы ES клеток.
Основные преимущества этого метода изменения являются, что он не требует новых знаний, устранение неполадок или оборудования. Все методы переносятся из стандартных бластоциста инъекций. Наиболее важные шаги также остаются неизменными; надлежащего и своевременного сбора эмбрионы, и надлежащей культуры условий для эмбрионов до, во время и после инъекции. При использовании метода передачи-безоперационное эмбриона, становятся более важное значение для выбора правильного получателя мышей. С хирургической переводов, хирург имели возможность изучать мыши для проверки надлежащего состояния репродуктивного, где с не хирургического переводов, это не возможно. Мышей должны быть премьер репродуктивного возраста (6-9 недель), и должны использоваться только мышей с видимыми вилки. Наиболее важным аспектом этой техники и все инъекции клеток ES, является качество ES клеток.
Когда дело с высоким качеством, надежные клеточных линий, этот метод может принести только минимальные различия, но с неоптимальной ES клеток линии или трудно работать с линиями, любые, даже незначительные улучшения, может быть значительным и сделать разницу между успехом проекта и неудачи. Это также следует отметить, что в течение этого исследования, несколько коммерчески доступных линий клетки ES генерируется микрофлорой химер, и почти все из коммерческих линий ES, генерируемые микрофлорой химер были TICM инъекции. Здесь мы показали, что простое изменение в технике может привести к значительное улучшение производительности, без каких-либо дополнительных расходов для нового оборудования, обучение или увеличения использования животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не конкурирующие интересы раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано [в частности] интрамуральных исследовательской программы NIH, Национальный институт экологических наук о здоровье. Особая благодарность Shyamal Peddada для статистического анализа. Мы также хотим поблагодарить Хамфри Яо, Гэри птица и Yuki Arao для обзора этой рукописи и Франко мая за его неизменную поддержку и консультации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
