Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए लंबी अवधि के प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग के साथ circadian आणविक लय की निगरानी करने के लिए अनुकूलित पूर्व vivo Drosophila लार्वा मस्तिष्क संस्कृति स्थापित करने के लिए है । औषधीय परख करने के लिए इस विधि के आवेदन भी चर्चा की है ।
Abstract
circadian पेसमेकर सर्किट इस तरह के दिन/रात चक्र के रूप में पर्यावरण cues के साथ समंवित लयबद्ध व्यवहार और शारीरिक outputs के उद्घोष । प्रत्येक पेसमेकर के भीतर आणविक घड़ी ंयूरॉन जीन अभिव्यक्ति है, जो लयबद्ध ंयूरॉन आबाद सर्किट के संचालन के लिए आवश्यक कार्यों में circadian लय उत्पंन करता है । पेसमेकर न्यूरॉन्स के विभिन्न उपवर्गों में व्यक्तिगत आणविक oscillators के गुणों की जांच और न्यूरॉन सिग्नलिंग पैदावार circadian पेसमेकर सर्किट की एक बेहतर समझ के साथ उनकी बातचीत. यहां, हम एक समय चूक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म दृष्टिकोण को संस्कृतिपूर्ण Drosophila लार्वा मस्तिष्क की घड़ी ंयूरॉंस में आणविक घड़ी पर नजर रखने के लिए विकसित वर्तमान । इस विधि एकल सेल संकल्प पर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट circadian पत्रकारों की लय की बहु दिन की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । इस सेटअप औषधीय जोड़तोड़ के साथ संयुक्त किया जा सकता है बारीकी से विभिंन यौगिकों के लिए आणविक घड़ी की वास्तविक समय प्रतिक्रिया का विश्लेषण । circadian लय से परे, शक्तिशाली Drosophila आनुवंशिक तकनीक के साथ संयोजन में इस बहुउद्देशीय विधि लाइव मस्तिष्क ऊतक में विविध न्यूरॉन या आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है.
Introduction
Circadian घड़ियां जीवों को पृथ्वी के 24 घंटे के रोटेशन द्वारा उत्पन्न आवधिक पर्यावरणीय परिवर्तनों के अनुकूल बनाने में मदद करती हैं । इंटरलॉकिंग transcriptional-शोधों प्रतिक्रिया छोरों सामांयतः प्रजातियों के पार circadian घड़ियों की आणविक मशीनरी आबाद1। घड़ी युक्त न्यूरॉन्स से बना circadian पेसमेकर सर्किट दैनिक शारीरिक की एक बहुतायत की लय का उद्घोष करने के लिए, इस तरह के प्रकाश/अंधेरे (एलडी) और तापमान चक्र के रूप में पर्यावरण cues, द्वारा प्रेषित समय के दिन की जानकारी को एकीकृत करता है और व्यवहार प्रक्रियाओं2,3। न्यूरॉन इनपुट और outputs के साथ आणविक लय का समन्वय circadian सर्किट के संचालन के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है, लेकिन केवल आंशिक रूप से समझा रहता है.
Drosophilaमें, आणविक घड़ी के मूल में, घड़ी/चक्र (CLK/CYC) heterodimer की प्रतिलिपि को सक्रिय करता है अवधि (प्रति) और कालातीत (टिम) । प्रति और टिम एक जटिल फार्म और नाभिक, जहां वे CLK/CYC और फलस्वरूप अपने प्रतिलेखन के transcriptional गतिविधि को बाधित प्रवेश । पोस्ट-transcriptional और बाद के शोधों के नियमों के अनुसार CLK/CYC-मध्यस्थता प्रतिलेखन और दमन के बीच देरी के कारण प्रति/टिम, लगभग 24-एच आणविक दोलनों की पीढ़ी को सुनिश्चित करना1,3,4 . इन आणविक घड़ियों युक्त के बारे में १५० न्यूरॉन्स एक सर्किट फार्म वयस्क के circadian व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए5मक्खियों. एक बहुत सरल अभी तक पूरी तरह कार्यात्मक circadian सर्किट घड़ी ंयूरॉंस के 3 समूहों से मिलकर-5 ventral पार्श्व ंयूरॉंस (LNvs; 4 pdf-पॉजिटिव LNvs और एक पीडीएफ-नेगेटिव LNv, नीचे देखें), 2 पृष्ठीय न्यूरॉन 1s (DN1s) और 2 पृष्ठीय न्यूरॉन 2s (DN2s)-लार्वा में मौजूद है मस्6,7.
सरल लार्वा circadian सर्किट एक उत्कृष्ट मॉडल के लिए अंतर के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए ंयूरॉन संचार और आणविक घड़ी प्रदान करता है । TDT, जो प्रति प्रोटीन और उसके सेलुलर स्थान के स्तर की नकल हमारे नव विकसित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का प्रयोग, हम लार्वा circadian सर्किट में अलग घड़ी ंयूरॉन उपसमूहों में आणविक घड़ी की गतिशीलता विशेषताएं की मांग की 8. इसके अलावा, neuropeptide वर्णक-dispersing फैक्टर (पीडीएफ) की महत्वपूर्ण भूमिका जानने के लिए ंयूरॉन स्तर पर circadian लय को विनियमित करने में 4 LNvs द्वारा उत्पादित9,10,11, हम प्रत्यक्ष की जांच करना चाहता था आणविक घड़ियों पर पीडीएफ का प्रभाव । इस अंत करने के लिए, हम समय-चूक फोकल माइक्रोस्कोपी से कई दिनों से अधिक लार्वा मस्तिष्क explant में circadian जीन अभिव्यक्ति लय पर नजर रखने के लिए एक विधि विकसित की है । प्रोटोकॉल भी औषधीय परख के लिए अनुकूलित करने के लिए प्रति-TDT के स्तर पर पीडीएफ या अंय यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण किया गया । इस प्रकार, अनुकूलन मस्तिष्क explant संस्कृति दवा आवेदन करने के लिए सुलभ बनाने के होते हैं, एक छोटी अवधि के लिए लौकिक संकल्प और इमेजिंग बढ़ रही है ।
विभिंन विकासात्मक चरणों के Drosophila दिमाग की पूर्व वीवो संस्कृति पहले से स्थापित किया गया है12,13,14,15,16,17 ,18. जबकि इन प्रोटोकॉल इमेजिंग विभिंन जैविक घटना के लिए इस्तेमाल किया गया है, उनमें से कुछ एकल सेल संकल्प पर इमेजिंग के साथ संगत नहीं कर रहे है या अधिक से अधिक कई घंटे के लिए संस्कृति का समर्थन नहीं करते । वैकल्पिक विधियों में circadian न्यूरॉन्स की दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग करने के लिए Drosophila में आणविक लय के bioluminescence इमेजिंग19,20,21 और प्रतिदीप्ति इमेजिंग शामिल प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के साथ कैल्शियम सूचक22,23. हालांकि bioluminescence इमेजिंग उच्च लौकिक संकल्प प्राप्त कर सकते है और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी vivo इमेजिंग में के लिए अनुकूलनीय जा सकता है, वे स्थानिक संकल्प पर सीमित है और विशेष माइक्रोस्कोप सिस्टम की आवश्यकता है ।
विधि यहां वर्णित एक से अधिक दिनों में एक सेल संकल्प पर पूरे मस्तिष्क संस्कृति में फ्लोरोसेंट संकेतों कल्पना सिलवाया है । इस सतही और बहुमुखी विधि संस्कृति वयस्क मक्खी दिमाग और औषधीय प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए Drosophila तंत्रिका में कई विभिंन समस्याओं का अध्ययन ।
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Protocol
1. एक संस्कृति हूड के तहत स्टॉक समाधान की तैयारी
- 1x Schneider सक्रिय माध्यम (सैम) लार्वा दिमाग के पूर्व vivo संस्कृति (संदर्भ24,25) (तालिका 1) से संशोधित के लिए अनुकूलित की ४०० मिलीलीटर तैयारकरें। Aliquot के लिए 5 मिलीलीटर और तरल नाइट्रोजन (LN2) में फ्लैश फ्रीज, दुकान पर-८० ° c ।
- कमजोर 10x स्टॉक समाधान (संदर्भ26से संशोधित) (तालिका 2) द्वारा 1x विदारक खारा समाधान (DSS) तैयार करें ।
- Aliquot फाइब्रिनोजेन को 10 मिलीग्राम और एक ही उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
चेतावनी: लामिना प्रवाह के तहत फाइब्रिनोजेन तौलना, दस्ताने पहने, के रूप में यह हानिकारक है । - सैम में thrombin स्टॉक समाधान तैयार (१५०० NIH यूनिट/मिलीग्राम) और aliquot 10 µ एल, LN में फ्लैश फ्रीज2 और रखें-८० ° c ।
चेतावनी: दस्ताने पहनते है जब thrombin हैंडलिंग के रूप में यह हानिकारक है । - 100x पेनिसिलिन-Streptomycin के Aliquot स्टॉक सॉल्यूशन । -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
- polytetrafluoroethylene (PTFE) झिल्ली के हलकों में कटौती (सामग्री तालिका देखें) आकार है कि एक गिलास नीचे पकवान के अंदर फिट बैठता है । उन्हें ७०% ेतोः में कुल्ला करें और फिर autoclaved डीएच में2O. निष्फल और यूवी के साथ लामिना प्रवाह के तहत सूखी । बाँझ पेट्री डिश में रखें । एकल उपयोग ।
नोट: PTFE एक असुरक्षित लचीला झिल्ली है कि गैस विनिमय की अनुमति देता है और मध्यम लंबी अवधि के दौरान वाष्पीकरण से रोकता है रिकॉर्डिंग ।
2. समय चूक माइक्रोस्कोपी सेटअप
नोट: निम्नलिखित सेटअप एक गुंजयमान स्कैनर (८,००० हर्ट्ज) के साथ सुसज्जित एक मिलकर स्कैनर औंधा फोकल माइक्रोस्कोप (सामग्री तालिका देखें) के लिए है. प्रणाली एक अति संवेदनशील फोटो गुणक डिटेक्टर, जो गुंजयमान स्कैनर के साथ एक साथ phototoxicity और photobleaching रोकता शामिल है । तापमान और आर्द्रता एक माइक्रोस्कोप पर्यावरण चैंबर के भीतर नियंत्रित कर रहे हैं ( सामग्री तालिकादेखें) कि माइक्रोस्कोप के सबसे शामिल हैं.
- एक मंच-शीर्ष आर्द्रता चैंबर प्लेस ।
- 25 डिग्री सेल्सियस और ८०% आर्द्रता के लिए माइक्रोस्कोप चैंबर equilibrate करने के लिए तापमान और आर्द्रता नियंत्रकों पर बारी ।
- लगातार अंधेरे (डीडी) में प्रयोग करने के लिए, एक अपारदर्शी कपड़े के साथ माइक्रोस्कोप पर्यावरण चैंबर कवर (जब तक माइक्रोस्कोप चैंबर एक अपारदर्शी सामग्री से बना है) ।
- यदि एक पानी के विसर्जन उद्देश्य का उपयोग, स्थिति एक जल विसर्जन उद्देश्य और कार्यक्रम के साथ एक प्रोटोकॉल को एक स्थिर दर पर समय-चूक इमेजिंग के दौरान पानी बांटना के उद्देश्य के शीर्ष पर माइक्रो मशीन ।
नोट: जल विसर्जन उद्देश्यों के साथ एक पानी की मशीन या शुष्क उद्देश्य लेंस के साथ दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए सिफारिश कर रहे हैं, विसर्जन माध्यम के अंय प्रकार के रूप में बाहर शुष्क होगा । - मंच पर एक पेट्री डिश धारक, आर्द्र कक्ष के अंदर रखें ।
- माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर लांच और पहली बातचीत बॉक्स से गुंजयमान स्कैनर मोड का चयन करें । संकेत मिलने पर अवस्था प्रारंभ करने के लिए ठीक का चयन करें । कॉन्फ़िगरेशन टैब पर जाएँ और प्रासंगिक लेज़र रेखाओं पर स्विच करने के लिए हार्डवेयर कॉन्फ़िगरेशन करने के लिए ।
- टैब प्राप्त करने के लिए और XY पैनल के लिए द्वि-दिशा मोड का चयन करें और छवि अधिग्रहण पैरामीटर सेट जाओ ।
नोट: वर्णित इमेजिंग सेटअप यहां प्रस्तुत (चित्रा 2, चित्रा 3 और फिल्म 1) विशिष्ट फ्लोरोसेंट पत्रकारों के circadian अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने के लिए अनुकूलित है । निम्नलिखित मापदंडों के लिए सबसे अच्छा फिट हमारे विनिर्देशों के लिए चुना गया: 40X जल विसर्जन उद्देश्य, ५१२ × ५१२ छवि संकल्प के साथ $ x लाइन औसत । बहुरंगा इमेजिंग के लिए, अनुक्रमिक छवि अधिग्रहण की आवश्यकता है जब एक fluorophore के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य और एक और ओवरलैप के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (यहां, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तरंग दैर्ध्य (YFP) उत्सर्जन और टमाटर उत्तेजना ओवरलैप) । अनुक्रमिक मोड "के बीच में ढेर चुनें" के रूप में यह सबसे तेज है और घड़ी ंयूरॉंस की आवाजाही एक Z-ढेर के अधिग्रहण के दौरान नगण्य है । माइक्रोस्कोप सेटिंग्स प्रत्येक प्रयोग के उद्देश्य के अनुरूप अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
3. लार्वा ब्रेन Explant कल्चर का सेटअप
नोट: विच्छेदन से मस्तिष्क explants की embedding के लिए पूरी प्रक्रिया ~ 30 मिनट लेता है ।
-
एक संस्कृति हूड के तहत रिएजेंट की तैयारी ।
- thrombin का एक aliquot गल और एंबेडिंग चरण (चरण ३.३) तक कमरे के तापमान पर रखें । एकल उपयोग ।
- गल जल्दी से ३७ डिग्री सेल्सियस पर सैम के एक aliquot और एक ही उपयोग के लिए बर्फ पर रखो ।
- एक 10 फाइब्रिनोजेन के मिलीग्राम aliquot करने के लिए सैम जोड़ें 10 मिलीग्राम/एमएल, धीरे और ३७ ° c पर कम 30 मिनट के लिए और (चरण ३.३) embedding चरण के दौरान मशीन । एकल उपयोग ।
नोट: यह polymerize करने के लिए शुरू होता है के रूप में 2 एच से अधिक फाइब्रिनोजेन समाधान मशीन नहीं है । - गल 100x स्टॉक पेनिसिलिन-Streptomycin की एक aliquot. तैयार २.५ एमएल के सैम युक्त 1x पेनिसिलिन-Streptomycin (सैम/ कमरे के तापमान पर रखें ।
नोट: शेष 100x स्टॉक पेनिसिलिन-Streptomycin 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक संग्रहीत करें । - शेष SAM से ५०० µ l का एक aliquot तैयार करें. बर्फ पर रखो ।
- लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए, ग्लास बॉटम डिश (figure 1a) के नीचे के प्लास्टिक भाग के लिए autoclaved वैक्यूम चर्बी लागू करें और यूवी के साथ लामिना फ्लो के नीचे निष्फल ।
-
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और ventral तंत्रिका कॉर्ड के विच्छेदन ।
- ७०% ेतोः के साथ संदंश और 2 एक्स तीन अच्छी तरह से गिलास विच्छेदन व्यंजन को साफ करें । DSS के 4 कुओं और ४०० µ में एक अच्छी तरह से सैम के एल में ४०० µ एल डालो । बर्फ पर रखो ।
- बाहर स्कूप मक्खी मध्यम लार्वा युक्त और संदंश के साथ गैर भटक 3 instar लार्वा (L3) उठाओ । उन्हें २ DSS-भरे कुएँ में क्रमिक कुल्ला. उंहें 3 DSS में रखें-बर्फ पर अच्छी तरह से भरा है कि लार्वा anesthetizes ।
नोट: L3 लगभग 2 दिनों में 25 ° c पर रहता है । शारीरिक रूप से प्रासंगिक समय सीमा में मस्तिष्क का निरीक्षण करने के लिए हम गैर-भटक L3 लार्वा का उपयोग करने के लिए चुना है । घड़ी न्यूरॉन्स के अन्य उपसमूह, जैसे l-LNvs और DN3s, घूमते हुए L3 चरण पर गठित होने के लिए शुरू लेकिन वे अभी तक जरूरी नहीं कि साइकिलिंग (डेटा नहीं दिखाया गया है). इसलिए, हालांकि यह संभव है इस स्तर पर छवि सायक्लिंग घड़ी ंयूरॉंस के लिए (डेटा नहीं दिखाया गया है), यह ध्यान से पहले कार्यात्मक लार्वा घड़ी ंयूरॉंस में डेटा विश्लेषण के लिए विकासशील लोगों से अलग महत्वपूर्ण है । नॉन-घूमते L3 25 डिग्री सेल्सियस पर अंडे बिछाने के बाद लगभग 4 से ४.५ दिनों में दिखाई देते हैं । circadian लय का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए, L3 लार्वा इकट्ठा करने से पहले 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 एच/12 एच एलडी चक्र में विकासशील लार्वा (चढ़ना) सिंक्रनाइज़ । - 4 DSS-भर में ठीक संदंश के साथ टुकड़े लार्वा दिमाग, जो लार्वा को धोने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है, अंदर-बाहर विधि का उपयोग कर27.
- संक्षेप में, दो में लार्वा कट, धीरे मुंह चुटकी संदंश की एक जोड़ी के साथ हुक और अंदर रोल-बाहर शरीर की दीवार संदंश के अंय जोड़ी का उपयोग कर, इस प्रकार मस्तिष्क को उजागर । सभी श्वासनली और नसों कि यह शरीर के आराम करने के लिए संलग्न बाहर काटने से मस्तिष्क मुक्त ।
- एक 20 µ एल पिपेट के साथ DSS के लगभग 3 µ एल में मस्तिष्क महाप्राण (DSS के साथ पूर्व कुल्ला) और सैम में बांटना-अच्छी तरह से भरा । अप करने के लिए 7 दिमाग के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ ।
नोट: विच्छेदन एक ठंडी सतह पर किया जाना चाहिए लार्वा anesthetized और मस्तिष्क ठंडा रखने के लिए । उदाहरण के लिए, बर्फ ठंडा पानी प्रसारित करने के लिए एक पंप से जुड़े एक ठंडा ब्लॉक पर विच्छेदन पकवान रखें । विच्छेदन प्रक्रिया लेता है ~ मस्तिष्क प्रति 30 एस । यह आंखों/antennal काल्पनिक डिस्क दिमाग और ventral तंत्रिका गर्भनाल से जुड़ी बरकरार रखने के लिए महत्वपूर्ण है । इन भागों को फाड़ने से मस्तिष्क को नुकसान होगा और संस्कृति की गुणवत्ता में कमी आएगी । साथ ही, दिमाग को हवा में उजागर करने से बचें । पहले मस्तिष्क को aspirating करने से पहले, पिपेट हुए लार्वा के DSS युक्त अंगों को ऊपर और नीचे करें, क्योंकि यह दिमाग को नोक की दीवार से चिपकने से रोकता है ।
-
एक 3 डी मैट्रिक्स में मस्तिष्क explants की embedding और बढ़ते (~ 20 मिनट) ।
- फाइब्रिनोजेन काम समाधान में एक विच्छेदित मस्तिष्क (फाइब्रिनोजेन अंतिम एकाग्रता ~ ३.३ मिलीग्राम/एमएल, १०.५ µ एल मस्तिष्क प्रति) इस प्रकार के रूप में जलमग्न:
- महाप्राण ३.५ सैम के µ एल/एंटीबायोटिक्स (एक ही टिप के साथ धारा 3.2.3 में इस्तेमाल किया) । महाप्राण विच्छेदन से एक विच्छेदित मस्तिष्क को अच्छी तरह से एक ही पिपेट टिप में सैम के वितरण के बिना/
- एक बाँझ पेट्री पकवान के ढक्कन पर मस्तिष्क और माध्यम तिरस्कृत । एक और ३.५ µ सैम के एल/जोड़ें गर्म फाइब्रिनोजेन के µ एल/सैम 10 मिलीग्राम/एमएल मस्तिष्क युक्त ड्रॉप पर समाधान । एक 20 µ एल पिपेट टिप के साथ pipetting द्वारा धीरे मस्तिष्क के आसपास समाधान मिश्रण ।
नोट: इस चरण में संदंश के बजाय एक पिपेट का प्रयोग मस्तिष्क पर जोर देने से बचता है. - छोड़ से समाधान काम फाइब्रिनोजेन के 2 µ एल लो और यह एक छोटे सर्कल के रूप में कांच के नीचे पकवान के coverslip पर लागू होते हैं । thrombin के ०.८ µ एल जोड़ें और एक पिपेट टिप के साथ बहुत जल्दी मिश्रण । फाइब्रिनोजेन को फाइब्रिन में परिवर्तित कर दिया जाता है और polymerize शुरू हो जाता है ।
- मस्तिष्क कि फाइब्रिनोजेन काम समाधान में बैठता है ले लो (चरण 3.3.1) संदंश की एक जोड़ी के बीच है और यह मैट्रिक्स पर स्थिति एक बार फाइब्रिन के एक सफेद मैट्रिक्स दिखाई है. ओरिएंट मस्तिष्क पूर्वकाल ओर नीचे (इमेजिंग घड़ी ंयूरॉंस के लिए) । कवर कांच के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में इसे नीचे पुश । फाइब्रिन थक्का फाइब्रिन की परतों से बना है. एक परत उठाओ और मैट्रिक्स अलग बिना छोटे और कोमल आंदोलनों के साथ मस्तिष्क के शीर्ष पर गुना ।
- मस्तिष्क को स्थिर करने के लिए थक्का के विभिन्न भागों से 2 से 3 बार दोहराएँ.
नोट: जब संदंश के साथ मस्तिष्क हैंडलिंग, यह सूखी या यह एक शारीरिक तनाव थोपने के लिए नहीं सावधान रहना ।
- मस्तिष्क को स्थिर करने के लिए थक्का के विभिन्न भागों से 2 से 3 बार दोहराएँ.
- thrombin की कार्रवाई को रोकने के लिए एम्बेडेड मस्तिष्क के शीर्ष पर सैम/एंटीबायोटिक्स के 20 µ एल जोड़ें ।
- प्रक्रिया को दोहराने शेष दिमाग माउंट । यह एक गिलास नीचे पकवान पर 5 से 6 के लिए दिमाग को एंबेड करने के लिए संभव है ।
- लंबे समय तक रहते इमेजिंग के लिए, सैम के ६०० µ एल जोड़ें/आंतरिक अच्छी तरह से (गिलास भाग) में एंटीबायोटिक दवाओं । मध्यम के शीर्ष पर एक पूर्व-कट PTFE झिल्ली की स्थिति और नीचे (3.1.5) (चित्र 1a) के प्लास्टिक के हिस्से पर लागू वैक्यूम तेल के लिए छड़ी ।
- औषधीय परख के लिए, के साथ डिश भरें सैम के 2 मिलीलीटर/एंटीबायोटिक्स (चित्र 1b) ।
नोट: यह मध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, के रूप में मध्यम के परासरणीयता न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, दीर्घकालिक इमेजिंग प्रयोगों के लिए, यह PTFE झिल्ली के साथ संस्कृति पकवान सील करने के लिए आवश्यक है । जबकि अल्पकालिक प्रयोगों के लिए, सील झिल्ली के रूप में लंबे समय के रूप में पकवान मध्यम के 2 मिलीलीटर से भरा है और एक humidified कक्ष में नजर रखी है की आवश्यकता नहीं है ।
4. समय चूक छवि अधिग्रहण
- स्टेज-टॉप आर्द्रता चैम्बर के अंदर पेट्री डिश होल्डर पर ग्लास बॉटम डिश लगाएं ।
- अधिग्रहण टैब में जेड-स्टैक पैनल में जाओ और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर से z-खंड कदम सेट (2 µm × ~ ४० चित्रा 2 और चित्रा 3में दिखाया प्रयोगों में, और फिल्म 1). coverslip और मस्तिष्क explant, coverslip के करीब की सतह पर अंत से दूर विमान में एक जेड-स्टैक की शुरुआत सेट करें । मस्तिष्क आंदोलनों नगण्य हैं हालांकि, जेड-स्टैक की शुरुआत और अंत में अतिरिक्त z-वर्गों जोड़ें.
- मार्क और पैनल और सेट-अप बहु स्थिति छवि अधिग्रहण खोजने के लिए जाओ । एक 40X उद्देश्य के साथ, 1 मस्तिष्क गोलार्द्ध को देखने के एक क्षेत्र के भीतर कब्जा कर लिया जा सकता है
- अधिग्रहण मोड पैनल के लिए जाओ और xyzt (जेड स्टैक समय चूक) का चयन करें । समय अधिग्रहण पैनल के लिए जाओ और पसंदीदा समय अंतराल और आवृत्ति मापदंडों निर्धारित किया है ।
नोट: वांछित आवृत्ति के साथ समय चूक छवियों का अधिग्रहण. ध्यान दें कि लंबी अवधि के लाइव इमेजिंग (24-72 ज) समय चूक अंतराल के साथ कम से 2 ज के परिणाम के लिए कुछ साइकिल न्यूरॉन्स में जाता है, शायद क्योंकि यह ंयूरॉंस की व्यवहार्यता कम कर देता है । डेटा की मात्रा छवि अधिग्रहण वृद्धि की दर के रूप में फैलता है, जो डेटा विश्लेषण और भंडारण को अधिक चुनौतीपूर्ण बना देता है ।
5. अल्पकालिक लाइव इमेजिंग के साथ मस्तिष्क Explants के औषधीय उपचार
नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया अनिवार्य रूप से एक ही है कि लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए, लेकिन एक PTFE झिल्ली की आवश्यकता नहीं है. दिमाग को नीली बत्ती को उजागर करने से बचने के लिए जब केमिकल को कल्चर से जोड़ा जाता है तो माइक्रोस्कोप को लाल बत्ती के साथ अंधेरे कमरे में रखा जाना चाहिए ।
- समय अधिग्रहण पैनल के लिए जाओ और वांछित समय अंतराल और दवा आवेदन से पहले आधारभूत डेटा प्राप्त करने के लिए स्कैन की संख्या निर्धारित किया है । स्कैन प्रारंभ करें ।
- आधारभूत स्कैन के पूरा होने के बाद, माइक्रोस्कोप सिस्टम के स्कैन सिर उठा. चरण-शीर्ष आर्द्रता नियंत्रक के ढक्कन निकालें और बहुत ध्यान से इसे ले जाने के बिना शीशे के नीचे पकवान के ढक्कन हटा दें ।
- यदि आवश्यक हो तो संस्कृति माध्यम की उचित मात्रा निकालें । माध्यम में प्रयोगात्मक समाधान जोड़ें और, ध्यान से और बहुत धीरे, मस्तिष्क explants छूने के बिना एक बाँझ पाश्चर पिपेट के साथ मिश्रण.
नोट: पीडीएफ के स्नान आवेदन के लिए, 2 µ एम पीडीएफ शेयर समाधान (10% DMSO में) का उपयोग करें । - कांच के नीचे पकवान और आर्द्र चैंबर, और स्कैन सिर के ढक्कन बदलें । यदि प्रयोग, माइक्रोस्कोप चैंबर के आसपास काले अपारदर्शी कपड़े की स्थिति ।
- अगर दिमाग लाइव स्कैन मोड में अपने मूल पदों पर हैं की जाँच करें । यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें ।
- समय अधिग्रहण पैनल के लिए जाओ और वांछित समय अंतराल और स्कैन की संख्या निर्धारित किया है । स्कैन प्रारंभ करें ।
नोट: यहां हम समय चूक छवियों का परीक्षण करने के लिए हर घंटे का अधिग्रहण 10 ज ।
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Representative Results
यहां, हम पूर्व vivo लार्वा मस्तिष्क संस्कृति में एक circadian फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि परिणाम दिखाने के लिए, और रिपोर्टर अभिव्यक्ति पर पीडीएफ स्नान आवेदन के लाइव इमेजिंग परिणाम ।
गैर-भटक L3 लार्वा आण्विक घड़ी रिपोर्टर प्रति-TDT और यूएएस-mCD8 व्यक्त:: YFP द्वारा संचालित एक घड़ी ंयूरॉन चालक Clk (856)-gal4 (चित्रा 1C) LD में entrained थे । दिमाग विच्छेदित और पिछले के दौरान दीर्घकालिक संस्कृति के लिए स्थापित किया गया एलडी चक्र के प्रकाश चरण सिर्फ अंधेरे चरण (चित्र 1a और बी1) से पहले । समय चूक इमेजिंग डीडी और मस्तिष्क explants में प्रदर्शन किया था ६४ एच के लिए हर 2 एच imaged थे । एक राशि-ब्याज के न्यूरॉन युक्त स्टैक बनाया गया था और इस क्षेत्र के ंयूरॉन के लिए इसी मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता पृष्ठभूमि घटाव के बाद मापा गया था8. रिपोर्टर व्यंजक के rhythmicity का निर्धारण करने के लिए, दोनों अधिकतम एन्ट्रापी वर्णक्रमीय विश्लेषण (MESA) और मैन्युअल निरीक्षण8का उपयोग किया गया था । प्रति-TDT स्तरों में ~ 26 h की अवधि के साथ circadian लय प्रदर्शित करने वाले दो DN2s यहां प्रस्तुत हैं (चित्र 2a, 2c और चलचित्र 1).
मूलतः एक ही संस्कृति सेटअप (चित्र 1b) का उपयोग करना, प्रति-TDT की अभिव्यक्ति पर neuropeptide PDF के प्रभाव का अध्ययन किया गया था । एक ही जीनोटाइप के रूप में ऊपर वर्णित की गैर भटक लार्वा के दिमाग ZT1 में या तो (Zeitgeiber समय 1, 1 एच पर रोशनी के बाद एलडी में) या ZT13 (1 एच के बाद रोशनी बंद) विदारक थे । लार्वा युक्त शीशियों तुरंत बर्फ पर ठंडा कर रहे थे के बाद मशीन से बाहर ले लिया । ZT13 पर, शीशियों भी नीले प्रकाश जोखिम से बचने के लिए एल्यूमीनियम पंनी में लिपटे थे । मस्तिष्क विच्छेदन बर्फ पर प्रदर्शन किया गया था और विच्छेदित दिमाग बर्फ पर रखा गया था । ZT13 में लिया दिमाग एल्यूमीनियम पंनी के साथ जब भी संभव कवर किया गया । इस प्रकार, हालांकि इस प्रक्रिया के प्राकृतिक प्रकाश के साथ जलाया प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया था, macromolecular संश्लेषण और चयापचय पर प्रकाश जोखिम का प्रभाव न्यूनतम था. दिमाग 1 घंटे के साथ दो बार स्कैन कर रहे थे आधारभूत डेटा प्राप्त करने के लिए अंतराल । pdf या वाहन (DMSO) संस्कृति के माध्यम से जोड़ा गया था और समय चूक छवियों को हर 1 घंटे के बाद 6 घंटे के लिए प्राप्त किया गया था-TDT अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में ZT13 पर PDF इसके अलावा पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक समय के दिन निर्भर वृद्धि दिखाया गया LNvs और DN1s, और एक DN2s (चित्रा 3)8पर कम हद तक ।
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इमेजिंग तकनीक और संस्कृति विधि यहां वर्णित phototoxicity, photobleaching या ध्यान बहाव के बिना एकल सेल संकल्प पर प्रति-TDT लय की रिकॉर्डिंग सक्षम होना चाहिए ।
नोट: छवियां विश्लेषण और फिजी28का उपयोग कर संसाधित किया गया था । 10x चलने deconvolution AutoQuant और Imaris के साथ प्रदर्शन किया था । समय में मामूली बहाव-चूक छवियों ImageJ के सही 3 डी बहाव प्लगइन के साथ सही थे ।
चित्रा 1:, L3 लार्वा मस्तिष्क और मस्तिष्क explant संस्कृति सेटअप में घड़ी ंयूरॉंस के एनाटॉमी । (A और B) लंबी अवधि के इमेजिंग (ए) के लिए मस्तिष्क संस्कृति सेटअप के योजनाबद्ध और अल्पकालिक इमेजिंग (बी) के साथ औषधीय परख के लिए । में (क), वैक्यूम तेल (पीला) ग्लास नीचे पकवान के प्लास्टिक के हिस्से पर लागू किया गया PTFE झिल्ली संलग्न । (ग) ZT2 पर एक LD-entrained L3 लार्वा मस्तिष्क की एक प्रतिनिधि छवि । आणविक घड़ी रिपोर्टर प्रति-TDT (रानी) की अभिव्यक्ति घड़ी न्यूरॉन्स, जो यूएएस द्वारा लेबल कर रहे हैं में दिखाई दे रहा है-mCD8:: YFP (ग्रीन) द्वारा संचालित Clk (856)-gal4. L3 में विभेदित घड़ी ंयूरॉंस के 3 समूहों रहे हैं: 5 LNvs (5 LNv, जो पीडीएफ व्यक्त नहीं करता है सहित), 2 DN1s और 2 DN2s, सफेद ऐरोहेड द्वारा संकेत दिया । घड़ी न्यूरॉन्स के नाभिक में प्रति-TDT की अभिव्यक्ति नोट करें. YFP-नकारात्मक प्रति-TDT-सकारात्मक कोशिकाओं glia और घड़ी ंयूरॉंस के अंय उपसमूह है कि अभी भी विकसित कर रहे हैं । स्केल बार = 25 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2: लार्वा घड़ी न्यूरॉन्स की लंबी अवधि के लाइव इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम. (क) लंबी अवधि के एक संस्कृतिपूर्ण मस्तिष्क के समय चूक इमेजिंग से DN2s का बढ़ाया देखें । ब्रेन explants से तैयार किए गए एलडी-entrained L3 लार्वा ZT11 पर विदारक है । छवियां हर 2 bdct से एच लिया गया था (Circadian समय 17, डीडी में ६४ h के लिए डीडी में बंद व्यक्तिपरक रोशनी के बाद 5 ज) । प्रति-TDT (रानी) की मर्ज की गई छवियां और यूएएस-mCD8:: YFP द्वारा संचालित Clk (856)-gal4 (हरा) प्रत्येक पैनल के बाईं ओर है और प्रति-TDT स्तर के रूप में प्रतिनिधित्व नीले ढाल के साथ heatmap सही पर हैं । स्केल बार = 10 µm । केवल प्रतिनिधित्व के लिए, छवियों 3 डी सुधार बहाव और एक 10x चलने deconvolution के साथ संसाधित किया गया । (B) प्रयोग का समय । (ग) ग्राफ रिश्तेदार प्रतिदीप्ति की तीव्रता का प्रतिनिधित्व टी = 0 दो DN2s (नीले और लाल) के पर सामान्यीकृत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: औषधीय प्रयोगों के लिए लाइव इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम. LD-entrained लार्वा दिमाग और विच्छेदित ZT1 या ZT13 पर घुड़सवार थे, और पीडीएफ (2 µ m) या DMSO ZT2 या ZT14 पर लागू किया गया था । प्रति-मस्तिष्क explants में TDT अभिव्यक्ति हर घंटे समय चूक माइक्रोस्कोपी से नजर रखी थी. मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता ± SEM इमेजिंग के शुरू में मूल्य को सामान्यीकृत (ZT1 या ZT13 के लिए इसी) दिखाया गया है । लाल तीर पीडीएफ या वाहन आवेदन (ZT2 या ZT14) के समय का संकेत है । * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 और * * * * p < 0.0001 के साथ दो-तरफा ANOVA से कई तुलना के लिए Sidak का सुधार है । प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए ंयूनतम ३२ LNvs, 18 DN1s और 16 DN2s का विश्लेषण किया गया । यह आंकड़ा संदर्भ8से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Movie 1: लार्वा DN2 घड़ी न्यूरॉन्स की लंबी अवधि के लाइव इमेजिंग । कल्चरल लार्वा मस्तिष्क की समय-चूक फिल्म ZT11 में विच्छेदित और डीडी में imaged. एक एकल गोलार्द्ध में DN2s के बढ़ाया विचारों प्रति-TDT और यूएएस-mCD8:: YFP द्वारा संचालित (856)- Clk दिखाया जाता है । छवियों ६४ घंटे प्रति TDT (रानी) और YFP (हरा) के लिए हर 2 घंटे का अधिग्रहण कर रहे थे और बाईं ओर TDT एक heatmap (नीला ढाल) के रूप में प्रतिनिधित्व के स्तर पर सही हैं । स्केल बार = 10 µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
| चरणों | अभिकर्मकों | एकाग्रता |
| 1. मिक्स रिएजेंट । | KH2पो4 | ४.१८ एमएम |
| CaCl2 | १.०५ एमएम | |
| MgSO४. 7H२O | ०.७ एमएम | |
| nacl | ११६ एमएम | |
| NaHCO3 | ०.७ मिलीग्राम/एमएल | |
| ग्लूकोज | 2 मिलीग्राम/एमएल | |
| Trehalose | 2 मिलीग्राम/एमएल | |
| α-Ketoglutaric अम्ल | ०.३५ मिलीग्राम/एमएल | |
| Fumaric अम्ल | ६० μg/एमएल | |
| मैलिक अम्ल | ०.६ मिलीग्राम/एमएल | |
| Succinic अम्ल | ६० μg/एमएल | |
| खमीर निकालें | 2 मिलीग्राम/एमएल | |
| गैर गर्मी-निष्क्रिय FCS | 20% | |
| डीएच2ओ, autoclaved | ||
| 2. ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के साथ निष्फल । | ||
| 3. ७२ h. मशीन के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति के लिए एक मशीन में मशीन बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण से रहित हो गया है । | ||
| 4. रिएजेंट जोड़ें । | इंसुलिन | 2 μg/एमएल |
| बीआईएस-Tris पीएच ६.८, ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के साथ बंध्याकरण | 5 मिमी | |
| 5.6.8-6.9 के लिए पीएच समायोजित करें । | NaOH (10 एन) | ~ 8 बूंदें |
| 6. ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के साथ निष्फल । | ||
| 7. Aliquot-८० डिग्री सेल्सियस पर LN2 स्टोर में 5 मिलीलीटर फ्लैश फ्रीज करने के लिए । whithin ६० दिनों का उपयोग करें । | ||
| नोट: बड़ी मात्रा के लिए, निर्वात द्वारा फिल्टर शीर्ष बोतल के साथ निष्फल, अंयथा एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग करें । एक संस्कृति हूड में खुला aliquots । एकल उपयोग । | ||
तालिका 1: Drosophila मस्तिष्क संस्कृति के लिए सैम मध्यम (1x) की तैयारी । मध्यम ते संस्कृतीचा मेंदू explant. सभी कदम एक संस्कृति हुड में माध्यम की मशीन के लिए छोड़कर प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
| चरणों | अभिकर्मकों | एकाग्रता |
| 1. मिक्स रिएजेंट । | HEPES-कोह, पीएच ७.४ | ९९ एमएम |
| nacl | १.३७ मीटर | |
| kcl | ५४ एमएम | |
| णः2पो4 | १.७ एमएम | |
| KH2पो4 | २.२ एमएम | |
| ग्लूकोज | ३३ एमएम | |
| सुक्रोज | ४३८ एमएम | |
| autoclaved डीएच२हे | ||
| 2. ०.४५ माइक्रोन फिल्टर के साथ निष्फल । | ||
| 3.6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । | ||
| नोट: प्रायोगिक उपयोग के लिए: autoclaved डीएच2हे और वैक्यूम द्वारा या फिल्टर सिरिंज के साथ ०.४५ माइक्रोन फ़िल्टर शीर्ष बोतल के साथ बंध्याकरण के साथ 1x को पतला । 4 ° c पर रखें । एक संस्कृति हूड, एकाधिक उपयोग में खोलें । | ||
तालिका 2: DSS (10x) की तैयारी । टुकड़े Drosophila दिमाग का खारा समाधान । एक संस्कृति हुड में तैयार करते हैं ।
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Discussion
यहां हम लंबी अवधि के प्रतिदीप्ति समय के लिए विधि वर्णित है, संस्कृति लार्वा दिमाग की चूक माइक्रोस्कोपी । इस प्रकार के प्रयोगों की सफलता कई कारकों पर निर्भर करती है, जैसे संस्कृति के स्वास्थ्य, मस्तिष्क explant के स्थिरीकरण के लिए विधि, रिपोर्टर, लौकिक और स्थानिक संकल्प के प्रतिदीप्ति तीव्रता और सिग्नल-टू-शोर अनुपात, और explant के लिए पहुंच । इन कारकों पारस्परिक रूप से अनंय हो सकता है । उदाहरण के लिए, बढ़ती समय चूक आवृत्ति संस्कृति के स्वास्थ्य को प्रभावित करता है, और मस्तिष्क explant के स्थिरीकरण गैस विनिमय में बाधा हो सकती है । इस प्रकार, एक खुश माध्यम खोज (कोई यमक इरादा) अध्ययन के तहत घटना के लिए एक सफल प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है । विधि यहां वर्णित घंटे के पैमाने में दिन के लिए फ्लोरोसेंट circadian पत्रकारों की अभिव्यक्ति पर नजर रखने के लिए अनुकूलित है । यह भी जब तक महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं अनछुए और देखभाल के साथ निष्पादित कर रहे हैं के रूप में Drosophila तंत्रिका में अन्य विषयों का अध्ययन करने के लिए लागू है.
इस प्रोटोकॉल में ब्रेन explants एक फाइब्रिन थक्का में मैटीरियल होता है, जो 3डी मैट्रिक्स को बनाता है । हालांकि स्थिरीकरण के लिए अंय तरीके मौजूद हैं, जैसे पाली-lysine या कवर कांच की laminin कोटिंग, इन नीचे लार्वा दिमाग के विकास को धीमा29 और इस प्रकार उनके शारीरिक मजबूती से समझौता कर सकते हैं । अपने स्वभाव से, फाइब्रिन एक उत्कृष्ट मैट्रिक्स है कि काफी ढीला करने के लिए पोषक तत्वों मस्तिष्क explant और मस्तिष्क के लिए पर्याप्त चिपचिपा तक पहुंचने के लिए यह16स्क्वैश बिना कवर ग्लास के करीब होने की अनुमति प्रदान करता है । इन फायदों के कारण, फाइब्रिन थक्का विधि सेल संस्कृति और मस्तिष्क explant संस्कृति के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल में नियोजित किया गया है14,17,29,30,31,३२ ,३३,३४. हम लार्वा मस्तिष्क संस्कृति के लिए भी अपेक्षाकृत अल्पकालिक प्रयोगों है कि पिछले कुछ घंटों से अधिक के लिए एक फाइब्रिन 3 डी मैट्रिक्स का उपयोग करने की सलाह देते हैं । लार्वा 3 डी मैट्रिक्स के बिना मस्तिष्क संस्कृति अनिश्चित परिणाम देता है (डेटा नहीं दिखाया गया है), शायद शारीरिक समर्थन दिमाग के विकास के लिए आवश्यक की कमी के कारण ।
यह ध्यान से महत्वपूर्ण है explant की आकृति विज्ञान और ऊतक में कोशिकाओं से पहले और समय के दौरान चूक इमेजिंग का निरीक्षण करने के लिए संकट के किसी भी संकेत का पता लगाने । यहां प्रस्तुत प्रयोगों में, झिल्ली की अभिव्यक्ति-बाध्य mCD8:: YFP ंयूरॉंस की बरकरार आकृति विज्ञान दिखाया और प्रति TDT कोशिका में पाया गया और नाभिक के रूप में की उंमीद है, यह दर्शाता है कि मस्तिष्क explant रहे व्यवहार्य और स्वस्थ भर में इमेजिंग की अवधि । Circadian rhythmicity ७२ ज तक के लिए अध्ययन किया गया था लेकिन हमने देखा है कि मस्तिष्क explants न्यूरॉन्स और मस्तिष्क की अखंडता बिगड़ती बिना 5 दिनों तक के लिए प्रसंस्कृत किया जा सकता है (दिखाया नहीं डेटा). यदि neurites या न्यूरॉन्स फट के कोशिका शरीर बिंदीदार बन जाते हैं, ये आम तौर पर phototoxicity के लक्षण हैं और आसानी से तदनुसार माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को ढालने से रोका. उदाहरण के लिए, pinhole आकार, स्मार्ट लाभ और पता लगाने की विंडो को बढ़ाते हुए लेज़र पावर को कम करने का प्रयास करें । हालांकि, आम तौर पर, रिपोर्टर के प्रतिदीप्ति तीव्रता उच्च तीव्रता लेजर रोशनी के बिना अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात की छवियों को प्राप्त करने के लिए सीमित कारक है । इसलिए, रिपोर्टर, fluorophore के विकल्प के डिजाइन, और रिपोर्टर की प्रतिलिपि संख्या पहली बातें जब व्यवहार्यता मुद्दों समस्या निवारण पर विचार कर रहे हैं । (यहां प्रस्तुत प्रयोग में, प्रति-tdt रिपोर्टर की 4 प्रतियां इस्तेमाल की गईं.)
एक समझौता मस्तिष्क संस्कृति के अन्य लक्षण समय चूक इमेजिंग और मस्तिष्क explant के बाहर तरल पदार्थ के आंदोलन के दौरान एक गोलार्द्ध के फट शामिल हैं । यह मस्तिष्क के विच्छेदन के दौरान हुई सूक्ष्म-पंचर की वजह से होने की संभावना है । लार्वा मस्तिष्क से जुड़ी काल्पनिक डिस्क को हटाना पंचर का मुख्य स्रोत है, इस प्रकार हम इसके खिलाफ सलाह देते हैं ।
bioluminescence इमेजिंग पर प्रतिदीप्ति circadian लाइव इमेजिंग का लाभ अपने उच्च स्थानिक संकल्प है । इसके अलावा, लय रिपोर्टर के साथ सेलुलर मार्कर का उपयोग करने की आसानी सेल प्रकार विशिष्टता के विश्लेषण की सुविधा । इसके विपरीत, bioluminescence सुपीरियर लौकिक संकल्प और उत्कृष्ट संकेत करने वाली शोर अनुपात19,20,21है । फिर भी, bioluminescence द्वारा imaged मस्तिष्क प्रति साइकिल न्यूरॉन्स की कुल संख्या हमारे विधि8,19,21के साथ प्राप्त संख्या की तुलना में बेहतर नहीं है. ज्यादातर मामलों में, हमारे विधि के साथ पता चला फ्लोरोसेंट पत्रकारों की लय घड़ी न्यूरॉन्स के एक ही क्लस्टर के भीतर सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं ( चित्र 2cदेखें), के रूप में bioluminescence19के साथ दिखाया गया है । प्रतिदीप्ति और bioluminescence circadian इमेजिंग8,19,21में घड़ी ंयूरॉन समूहों के बीच चरण अंतर देखा गया । इसलिए, दोनों के तरीके में समान रूप से संस्कृतिपूर्ण दिमाग में circadian लय देख में मांय हैं, और florescence और bioluminescence के बीच चुनाव अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार किया जाना चाहिए ।
इस विधि की मुख्य तकनीकी कठिनाई एम्बेडिंग चरण में है । क्योंकि प्रोटोकॉल एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ तेजी से स्कैनिंग फोकल इमेजिंग के लिए कॉल, और मस्तिष्क ऊतक में प्रकाश बिखरने प्रतिदीप्ति का पता लगाने को कम कर देता है विशेष रूप से जब ऊतक में गहरी इमेजिंग, मस्तिष्क explants के रूप में बंद के रूप में रखा जाना चाहिए कवर ग्लास के लिए संभव है । इसके अलावा, इमेजिंग परिणाम के reproducibility हितों के न्यूरॉन्स की जेड पदों की निरंतरता पर निर्भर करता है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है ओरिएंट और माउंट दिमाग हमेशा उसी तरह, जो अभ्यास की आवश्यकता है । छवि के लिए ंयूरॉंस शारीरिक विशिष्ट स्थितियों में स्थित समूहों, यह अलग मस्तिष्क explant उंमुखीकरण के साथ अलग प्रयोग चलाने की आवश्यकता हो सकती है । ऐसे दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के रूप में ऊतक, संवर्धन की आवश्यकता नहीं है कि गहरी ऊतक लाइव इमेजिंग के लिए वैकल्पिक तरीके हैं. उत्तरार्द्ध सफलतापूर्वक लाइव Drosophila दिमाग में छवि circadian कैल्शियम गतिशीलता के लिए इस्तेमाल किया गया है22,23. हालांकि, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी फोकल माइक्रोस्कोपी से कम स्थानिक संकल्प है और इस प्रकार एकल सेल संकल्प पर इमेजिंग करने के लिए अपने आवेदन एक चुनौती बनी हुई है ।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल लार्वा मस्तिष्क explants की शर्तों के तहत एक सरल संस्कृति प्रणाली को जोड़ती है कि समर्थन समय-चूक दिन और जैविक लय के मात्रात्मक विश्लेषण पर फ्लोरोसेंट पत्रकारों के छवि अधिग्रहण । हालांकि वहां कुछ सीमाएं है के रूप में ऊपर चर्चा की, पद्धति छवि लार्वा और वयस्क Drosophila दिमाग में विभिंन पत्रकारों को अनुकूलित किया जा सकता है और आगे संवेदनशीलता और स्थानिक संकल्प को बढ़ाने के लिए संशोधित । उदाहरण के लिए, मस्तिष्क या vesicular परिवहन में गहरी स्थित axonal अनुमानों दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी३५के साथ हमारे मस्तिष्क explant संस्कृति तकनीक के संयोजन से detectable हो सकता है । यह कहा जा रहा है, यह अभी भी वयस्क मस्तिष्क में mitochondria जैसे organelles के लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए संभव है explants इस प्रोटोकॉल का उपयोग (डेटा नहीं दिखाया गया है) । हम भी औषधीय परख में प्रयोगात्मक समाधान के स्नान आवेदन के लिए इस प्रोटोकॉल की भिंनता प्रस्तुत किया । एक इस प्रोटोकॉल का विस्तार करने के लिए "पल्स-चेस प्रयोगों" मैंयुअल रूप से संस्कृति माध्यम की जगह से बाहर दवा धोने या एक छिड़काव चैंबर18का उपयोग कर सकता है,३६।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम अपनी सदस्यता और समर्थन के लिए इस विधि के विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान माइकल Rosbash धंयवाद । यह काम JST सफ़ाई प्रोग्राम, स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (31003A_149893 और 31003A_169548), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी-StG-३१११९४), नोवार्टिस फाउंडेशन फॉर मेडिकल-बायोमेडिकल रिसर्च (13A39) और जिनेवा विश्वविद्यालय द्वारा वित्तपोषित किया गया था .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
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