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Neuroscience

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Published: March 22, 2018 doi: 10.3791/57142
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, treinamos os ratos em uma tarefa de aprendizagem associativa para testar a discriminação do odor. Este protocolo permite também para estudos sobre aprendizagem-induzido mudanças estruturais no cérebro.

Abstract

A olfação é a modalidade sensorial predominante em camundongos e influencia muitos comportamentos importantes, incluindo forrageio, deteção de predador, acasalamento e parentalidade. Importante, os ratos podem ser treinados para associar odores romance com respostas comportamentais específicas para fornecer a introspecção do função olfativa do circuito. Este protocolo detalha o procedimento para os ratos de treinamento em uma tarefa de aprendizagem operante de avançar/não avançar. Nesta abordagem, os ratos são treinados diariamente em centenas de testes automatizados para 2 – 4 semanas em então podem ser testados na novela avançar/não avançar odor pares para avaliar a discriminação olfativa, ou ser usado para estudos sobre como a aprendizagem de odor altera a estrutura ou a função do olfativo circuito. Além disso, o bulbo olfativo do mouse (OB) apresenta integração contínua de neurônios adulto-nascido. Curiosamente, aprendizado olfativo aumenta a sobrevivência e conexões sinápticas destes neurônios adulto-nascido. Portanto, este protocolo pode ser combinado com outras técnicas bioquímicas, eletrofisiológicas e de imagem para estudar a aprendizagem e atividade-dependente fatores que medeiam a sobrevivência neuronal e plasticidade.

Introduction

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O mouse OB, onde informações de odor primeiro entra no sistema nervoso central (SNC), fornece um excelente modelo para estudar as mudanças estruturais de experiência-dependente. Os circuitos de OB integra continuamente neurônios adulto-nasceu em uma maneira dependente da atividade. Precursores de adulto-nascido neurônio dividam fora de progenitores que a linha da zona subventricular adjacente ao ventrículos laterais1. Após migrar para o OB, estes precursores neuronais sobrevivem, diferenciam e integram-se como células grânulo inibitório ou passam por apoptose2. Seleção para o destino da célula é influenciada pela atividade olfativa, incluindo aprendizagem olfactiva3,4,5,6. Após a integração, alterações sinápticas induzida por aprendizagem ocorrem em células grânulo durante uma duas semanas período crítico7,8. Assim, os ensaios para aprendizagem olfactiva são útil para examinar como experiência-dependente plasticidade influências reorganização estrutural e funcional de um circuito de cérebro maduro.

Este protocolo oferece uma abordagem para o treinamento olfativo, usando uma paradigma de condicionamento operante. Nesta tarefa, ratos privados de água são treinados para associar uma punição de tempo limite experimental cheiro (o cheiro de "Ir") com uma recompensa de água e outro odor (odor "Go"). Progresso de ratos através de uma série graduada de fases de treinamento ao longo de 2-4 semanas. Quando o treinamento está completo, ratos respondem ao odor Go ou abortar com comportamentos discretos e correspondentes (buscando uma recompensa de água em ensaios de Go e não buscando a recompensa de água em ensaios não-go) (Figura 1A). Após treinamento completo, ratos podem ser ainda mais desafiados com pares de odor quimicamente semelhantes testar a discriminação ou tornar-se uma transição para estudos de investiga aprendizagem como olfativa altera a estrutura ou a função da OB. Embora as tarefas de discriminação do odor têm sido descritas anteriormente, mais dependem de medições subjetivas, tais como número de farejadores entre dois odorantes9,10. Além disso, a necessidade humana de Pontuação de tais tarefas também é demorada. A tarefa de avançar/não avançar olfativo aprendizagem descrita neste protocolo oferece uma medição imparcial, direta da aprendizagem olfactiva e discriminação do odor.

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Protocol

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Todos os ratos foram utilizados no âmbito de um protocolo aprovado pelo Comitê de uso e Baylor College de medicina institucional Cuidado Animal, em conformidade com as normas do NIH. Ratos usados neste protocolo foram todos ratos adultos (> 6 semanas de idade) na C57BL6/j fundo e incluiu a ratos machos e fêmeas. Após a formação/preparação tarefas, ratos são retornados para sua gaiola em casa.

1. construção e regras gerais para a utilização operante, aprendizagem caixa (Figura 1B, C)

  1. Monte uma câmara de rato com piso da câmara. Manter a caixa de treinamento em um baixo tráfego, área mal iluminado para evitar distrações.
  2. Cada porta de água com um pequeno furo na parte superior para permitir que uma agulha de calibre 18 dispensar a água no interior do porto da broca.
  3. Encha o frasco de vidro com odorant dissolvido em óleo mineral (substituído semanalmente) e aperte firmemente a tampa.
  4. Conecte a agulha de calibre 18 do silicone. Perfure a tampa do frasco de vidro com agulha de calibre 18 e conecte a outra extremidade do tubo de silicone para a ingestão das portas do odor.
  5. Coloque cada tubo do silicone em uma válvula de odor.
  6. Conecte a linha de vácuo para os portos de odor.
  7. Fixar uma haste de metal segurando duas seringas de 10 mL e conecte o tubo para as seringas. Ligue a outra extremidade do tubo para uma agulha de 18 G. Encaixe a agulha do furo do Porto nariz puxão na câmara de rato. Conecte a outra extremidade do tubo para a válvula de água.
  8. Encha as duas seringas de 10 mL com roedor água potável.
  9. Conectar-se um medidor de fluxo de ar para a entrada de ar e manter o fluxo de ar de 3 – 5 L/min.
  10. Conectar-se a 2 válvulas de água, 2 válvulas de odor, 2 portas de água, Porto de odor e energia para o sistema de interface USB. Conecte todas as válvulas de portas 'Saída', todos os portos de odor e água a 'Entrada' portas. Todos os equipamentos para saídas de caixa de interface USB de energia e por último, conectar a caixa de interface USB para poder conectar-se.
  11. Ajuste a sucção do vácuo para evitar a contaminação cruzada de odores entre ensaios.
  12. Use tubos de odor específico para conectar odorant frascos para a câmara.

2. Mouse preparação: 1-3 dias

  1. Divida os ratos em 3 grupos: controle (sem treinamento olfativo necessária), pseudo treinados (ratos que recebem de recompensa ou punição ao acaso) e treinou grupos. Expor o pseudo treinados ratos para a entrega de caixa e odor de treinamento, mas não fornecem treinamento olfativo porque o resultado da recompensa e punição é aleatoriamente associado com o odor entregado.
    Nota: O grupo pseudo treinado atravessará o paradigma de treinamento sob as fases de "Pseudotraining". Os ratos treinados irão completar todas as fases de treinamento. Pseudotraining é opcional, se o objetivo do experimento é a ensaiar para diferenças comportamentais na discriminação de odor ou aprendizagem. O protocolo fornecido que aqui adiciona este grupo se o experimentador quer sondar para neuronais diferenças antes e depois do treino. O grupo pseudotrained controlaria então para exposição de odor passiva e não-olfactory treinamento relacionado.
  2. Começar a restrição de água em ratos para 40 mL/kg/dia. Evite a perda de peso corporal superior a 20% do peso de linha de base dos animais a fim de evitar a angústia(Figura 2).
  3. Pese os ratos diariamente para garantir que eles estão acima de 80% do peso inicial. Se um rato cair abaixo deste limiar, remover o mouse do estudo e fornecer o acesso livre à água.
  4. Manter todos os fatores ambientais constante em todo o protocolo, incluindo temperatura, ruídos e odores vadios (incluindo pessoal corpo e perfumes perfume/colônia/desodorante).
    Nota: Tal como acontece com todos os testes de comportamento animal, pequenas mudanças ambientais grandemente podem influenciar os resultados.

3. instruções para todas as fases

  1. Código de software de treinamento para cada etapa abaixo. Execute o software sobre o software comportamental.
    Nota: Para todas as etapas de codificação estão contidas em arquivos de codificação suplementares. Dados para 20 trilhas são agrupados como um único bloco e mouse desempenho é exibido através de blocos. Além disso, cada estágio pode ser repetido em um mouse para um número de dias até conclusão critérios forem atendidos.
  2. Não manter os ratos na caixa comportamento para mais de 60 min/dia.
  3. Rato limpa resíduos da gaiola antes de cada mouse é transferido para a gaiola. Spray e limpe a câmara com etanol a 70% para minimizar a distração de odor de rato.

4. formação fase 1: Associando recompensa de água com um Poke de nariz de centro, 1 – 3 dias

  1. Nesta etapa, associe os ratos com uma recompensa de água em cima de exploração do porto de água.
  2. Instruções de programação de 1 estágio de formação
    1. Programa nesta fase, apenas use a porta de entrega de água. Deixe o mouse receber uma recompensa de água para cada saco de nariz.
      Nota: O programa imprimirá o tempo de duração do julgamento e o número total de água premia o mouse recebido.
  3. Defina o pseudotraining fase 1 programação igual a 1ª fase de treinamento.
  4. Caixa instalação e configuração do mouse
    1. Configure a caixa de comportamento com um porto de água no centro e com todas as portas de lado inacessíveis. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 1.
  5. Considerar nesta fase tão completo quando o mouse atinge 100 ensaios dentro de 60 min. remover o mouse da câmara após 60 min ou 100 testes terem sido concluídos (Figura 2B).
    Nota: Devido às diferenças individuais, alguns ratos naturalmente abster-me de explorar a caixa.
  6. Se houver necessidade de encorajamento, manualmente, fornecer água à porta de água. Repita esta etapa para até 3 dias.
    Nota: Os ratos que já são treinados podem ser repetidos mais para manter a paridade e mantê-los na restrição de fluidos. Também é possível promover um grupo inteiro de estágio 2, quando a média do grupo atinge 100 ensaios/60 min. Isto permitirá todos os mouses continuar o treinamento no mesmo dia.

5. formação fase 2: Associando uma recompensa de água lado Porto Porto centro nariz Poke, 1 – 5 dias

  1. Nesta fase, deixe os ratos cutucar o nariz na porta do centro e então imediatamente receber uma recompensa de água sobre as portas de lado.
  2. Caixa instalação e configuração do mouse
    1. Configure este e todos os estágios subsequentes com 2 portas de água nas laterais e o porto de odor no meio. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 2.
  3. Instruções de programação formação fase 2
    1. Fornece o mouse com uma recompensa imediata de água em ambos os lados após um puxão de nariz no centro de Porto de entrega de odor. Definir parâmetros de saída para este estágio, como o tempo de duração do julgamento, o número de ensaios iniciada e o número de recompensas de água recebida dentro de 5 s de um puxão de nariz.
  4. Defina o pseudotraining fase 2 programação igual formação fase 2.
  5. Considerar esta fase como completa um mínimo de 40 ensaios efectuados em 60 min, pelo menos 25% dos prêmios de água recebidos dentro de 5 s do poke de nariz Porto centro. Remova o mouse uma vez que essa etapa foi concluída (Figura 2C).
    Nota: O programa de treinamento calcula a porcentagem de água recompensas recebido em tempo hábil, a fim de determinar a conclusão desta etapa. Embora ratos variam em quão rápido completa nesta fase, a maioria dos ratos atingirá critérios de conclusão dentro de 5 dias. No entanto, se um rato não foi concluída nesta fase, no prazo de 5 dias, não avance o mouse para a próxima fase. Este rato será retirado da coorte.

6. treinamento estágio 3: Associando uma recompensa de água com um Odor específico e dentro de uma janela de tempo específico, 1 – 3 dias

  1. Nesta fase, deixe os ratos recebem um odor de ir s (+) em cima de um puxão de nariz no porto centro. Posteriormente, produzir uma recompensa de água em cima de um puxão de nariz para os portos de água do lado dentro de 5 s.
  2. Instruções de programação do treinamento estágio 3
    1. Entrega o odor s + no centro de Porto de odor.
    2. Entregar a recompensa de água se o mouse pokes das portas laterais, dentro de 5 s de uma entrega de odor.
      Nota: O programa começa, exigindo apenas um puxão de nariz de 100 ms no porto centro para produzir uma recompensa de água. Uma vez que o mouse pokes do porto do centro para a quantidade correta de tempo em 80% dos ensaios, o tempo de duração de um puxão de nariz exigida para uma recompensa de água aumentará por 50 ms até 400 ms.
    3. Defina os parâmetros de saída idêntica à fase 2.
  3. Defina as instruções de programação estágio 3 pseudotraining o mesmo como formação estágio 3. No entanto, não conecte o odor s + para o controlador de entrega de odor para garantir que o odor de s + não está associado com uma recompensa de água.
  4. Caixa instalação e configuração do mouse
    1. Defina a mesma configuração de fase 2.
    2. O odor de s + Conecte o controlador de entrega de odor. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 3. Remova o mouse uma vez que essa etapa foi concluída.
  5. Considere esta fase como completa quando há maior que 60 recompensas dentro 60 min (Figura 2D).

7. estágio 4A: associando tudo cancelado (S-) Odor e punição de tempo limite, 1 – 2 dias

  1. Nesta fase, apresente os ratos a um odor Go (S-). Fornece um tempo de castigo para os ratos que incorretamente ir para as portas de água depois de cheirar o odor de go.
  2. Instruções de programação formação estágio 4A
    1. Entrega apenas o odorant s + neste estágio no início, idêntico à fase 3. Depois de ratos completa 40 os ensaios, começam entrega aleatória dos odores para incluir tanto s + e S-odores. Programe um castigo 2-s expiram se o rato tenta procurar uma recompensa de água depois de ser apresentado o odor go.
      Nota: Para auxiliar na distinção entre Go vs inacessível, as luzes do lado de IR podem ser manipuladas tal que eles estão na durante Go odorantes e off durante go odorantes. As luzes funcionam como uma indicação secundária para ajudar os ratos na formação inicial. Uma vez que os ratos são treinados com as luzes, eles devem formação Under ir sem luzes para confirmar que eles aprenderam a tarefa com odores.
    2. Defina os parâmetros de saída como tempo de duração do julgamento, número de ensaios iniciada, número de ensaios concluída, % correto e número total de prêmios recebidos.
  3. Definir as pseudotraining instruções de programação estágio 4A o mesmo como fase de formação 4S exceto s + e S-odores são apresentados aleatoriamente desde o início. Dê água punições recompensa ou tempo limite ao acaso, independentemente do desempenho da tarefa.
  4. Caixa instalação e configuração do mouse
    1. Defina a configuração de caixa o mesmo como o estágio anterior 3.
    2. Conecte ambos s + e S-odor ao controlador de entrega de odor. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 4A. Após os julgamentos de ratos completa 40, mude o programa entregar aleatoriamente os odores. Remova o mouse uma vez que essa etapa foi concluída.
  5. Considera esta fase como completa quando há 40 ensaios com > 60% de respostas corretas.

8. estágio 4B: associando tudo cancelado (S-) Odor e punição de tempo, 5 – 11 dias

  1. Instruções de programação formação estágio 4B
    1. Fazer este estágio idêntico ao estágio 4A, no entanto, a punição de tempo limite para a tentativa de uma recompensa de água depois de um S-odor é 4 s.
  2. Definir a recompensa de água pseudotraining estágio 4B instruções idênticas ao estágio 4A, de programação, no entanto e punição de tempo são entregues aleatoriamente por julgamento.
  3. Caixa instalação e configuração do mouse
    1. Defina a configuração de caixa o mesmo como anterior etapa 4A.
    2. Conecte ambos s + e S-odor ao controlador de entrega de odor. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 4B. Considerar nesta fase completa quando há > 100 ensaios dentro 60 min com precisão > 85%(Figura 2)
  4. Monitore o percentual máximo e mínimo correto para cada sessão acompanhar o progresso de cada mouse neste estágio. Aproximadamente 85-90% dos ratos alcançar critérios de conclusão para esta fase. Exclua os ratos que não alcançar a conclusão desta fase para avançar/não avançar fase de testes.
  5. (Opcional) No final desta fase, aplica um treinamento de reversão, onde os odorantes avançar/não avançar estão ligadas a plataforma de frasco de odor. Certifique-se de que os ratos não são associando com outro estímulo, tais como o som das válvulas associados das portas laterais.

9. avançar/não avançar do ensaio tarefa: 1 dia, 20 Min por Mouse por dia

  1. Considere isto como o estágio final para determinar a precisão de identificar associações de odor e aprender a discriminar pares de odor.
    Nota: O romance odorantes são utilizados para S + S-testar animais quanto tempo leva para aprender novas associações. Estruturalmente semelhantes odorant pares são usados para aumentar a dificuldade da tarefa. Exemplos incluem Butanol-1 vs 1-Pentanol, acetato Isoamyl vs Isoamyl butirato, e + carvona vs - carvona.
  2. Instruções de programação
    1. Deixe o software de treinamento detectar o comprimento do saco do nariz. Programe um puxão de nariz de 300 ms no porto centro odor para executar a tarefa.
    2. Definir os parâmetros de saída idêntica à fase 4B, exceto que não utilize qualquer luz guiado pistas.
  3. Caixa instalação e configuração do mouse
    1. Defina a configuração de caixa o mesmo como anterior estágio 4B.
    2. Conecte ambos s + e S-odor ao controlador de entrega de odor. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio avançar/não avançar. Expor os ratos que aprenderam a tarefa de aprendizagem olfactiva para novos pares de odores quimicamente semelhantes.
      Nota: Sua ratos com discriminação adequada odor chegar > 85% de precisão com odorantes romance após aproximadamente 10-20 blocos ou ensaios de 200-400(Figura 3).

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Representative Results

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Uma vez que os ratos aprendeu a tarefa de aprendizagem olfactiva, eles agora podem associar pares de odor romance com recompensa e punição. Estes ratos treinados normalmente começam com cerca de 50% precisão na tarefa avançar/não avançar. O percentual correto pode ser plotado pelo bloco experimental como uma curva de aprendizado para pares de odor romance(Figura 3). Dentro de 10 testes de bloco, o que leva a maioria dos ratos a menos de 30 min para realizar, os ratos são capazes de discriminar corretamente entre odores com mais de 85% de precisão (linha vermelha). Isto mostra que nosso protocolo treinou com sucesso sua ratos para associar um odor com uma recompensa de água e outro com uma tempo limite punição. Para avaliar as capacidades de discriminação entre duas coortes, estes dados podem ser analisados mais para comparar o número de ensaios necessários para alcançar a proficiência de 85% (Figura 3B) ou a média por cento correto depois de atingir a proficiência.

Uma vez que os ratos aprendem a tarefa, pares de odor podem ser modificados para aumentar ou diminuir a dificuldade da tarefa. Por exemplo, diminuindo a concentração de odor-par aumenta a dificuldade da tarefa (Figura 3C). Esta análise pode revelar o limiar de detecção para coortes de mouses diferentes. Além disso, pares de odor podem ser alterados para se tornar mais estruturalmente semelhante (ou seja, enantiômeros ou diferenças de carbono simples). Misturas de odor também podem ser usadas para aumentar a dificuldade da tarefa (ou seja, mistura de 40/60 vs mistura 30/70).

Ratos também são capazes de lembrar anteriores pares de odor aprendeu. Depois de 7 dias desde a tarefa de aprendizagem, um show de teste lembre-se que sua ratos rapidamente recorde anteriormente aprendido associações odor (Figura 3-D).

Figure 1
Figura 1 : Avançar/não avançar formação paradigma e equipamento configuração. (A) ratos respondem corretamente ou obtenção água durante apresentação de Odor ir ou abster-se durante a apresentação de Odor go. Caixa (B) o comportamento é configurada tal que apenas uma porta única de água é acessível durante a fase 1 e todas as fases subsequentes contêm tanto um porto de entrega de odor central e duas portas de água. Círculo azul: porta de água. Círculo verde: porta de odor. (C) Odor entrega está fechada por válvula de um odor de cada odor. Entrada de ar de pressão positiva leva a um distribuidor. Setas vermelhas indicam a linha de pressão de ar positiva vai para o frasco de odor preparado (círculo vermelho). Seta azul indica a mistura de ar/odor, deixando o frasco de odor e passando por uma válvula de odor (círculo de luz azul) e entrar um ar branco, integrando o caixa. Seta laranja indica o ar de pressão positiva para uma válvula do regulador central (círculo laranja) para a caixa de integração para permitir a pressão de ar positiva empurrar mistura ar/odor de caixa integrador para a porta de entrega de odor (seta de fundo preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Dados de treinamento. Peso corporal de ratos (A) percentagem não cair abaixo de 80%, enquanto na restrição de fluidos. Linha vermelha = limite de 80%. N = 8 ratos. (B) fase 1 treinamento resultados mostram o número de centro Porto pokes em 60 min para receber a recompensa de água. N = 8 ratos. Barras de erro são erro padrão da média. (C) fase 2 treinamento resultados mostram a percentagem de água recompensas recebidas dentro de 5 s de puxão de nariz de centro. Linha vermelha é o limite de 25%. Quer dizer a porcentagem com realce cinza como o erro padrão da média. N = 8 ratos. (D) estágio 3 cumulativa premia mostram o número de recompensas recebidas por 8 ratos no dia 1 e dia 2 de treinamento. Linha vermelha é 60 limiares de recompensa. Barras de erro são o desvio-padrão. (E) resultados de precisão estágio 4B exibem a porcentagem de respostas corretas para estágio 4B. Linha vermelha é de 85% do limiar. Linha preta sólida é mau e realce cinza é o erro padrão da média. N = 4 ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Representante resultados para avançar/não avançar tarefa. (A) avançar/não avançar tarefa para 2 odorantes romance (s + = acetato de isoamila/S-= acetato de amila) depois que os ratos foram treinados no eugenol (s +) e eucaliptol (S-). N = 5 ratos, com erro padrão da média em cinza. Linha verde é 50% de precisão, a linha vermelha é limite 85% de precisão. (B) exemplo de tarefa de avançar/não avançar para um mouse que seria aprende rápido contra um rato aprendiz lento para hexanol s (+) e o ácido butírico (S-). (C) avançar/não avançar tarefa para diferentes pressões parciais de hexanol (s +) e o ácido butírico (S-). (D) capacidade de ratos de recordar o par de odor 7 dias após o treino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O sistema olfativo roedor fornece um modelo exclusivo para estudar sensorial plasticidade dependente. Aqui nós apresentamos uma paradigma de aprendizagem olfactiva para treinar ratos associar pares de odorante com uma recompensa ou punição. Através desta tarefa de aprendizagem, alterações de circuito a jusante podem ser estudadas em experimentos subsequentes (eletrofisiologia, imagem latente na vivo neuronal, etc.). Após a conclusão, ratos vão aprender a executar uma tarefa de simples odor marcado para associar uma recompensa de água com um odor e um castigo de timeout com outro odor.

Desde que isto é um ensaio comportamental, recomendamos utilizando uma distribuição igual de idade e sexo entre experimental e controlar grupos de animais. É imperativo que sejam mantidas as condições entre ratos tão constante quanto possível. Por exemplo, certifique-se de que o manipulador de ratos e as condições de iluminação permanecem constantes durante todo o treinamento. Se muitos ratos não executar a tarefa, como esperado, verifique as seguintes condições: (1) Mantenha a configuração de comportamento mais silencioso possível. (2) água suficientemente privar os ratos. Nós achamos que mesmo depois de um dia inteiro de privação de água, muitos ratos não vão suficientemente beber suficiente do Porto centro da caixa para alcançar os critérios de conclusão de estágio 1. (3) no início de cada novo mouse, verificar o odor/água válvulas e tubos para garantir o posicionamento adequado. (4) odorantes variam em sua volatilidade e, portanto, algumas evaporam mais rapidamente do que outros. Substitua odorantes mais voláteis com altas pressões de vapor diariamente em vez de semanal, especialmente se são utilizadas concentrações inferiores.

Este protocolo pode ser modificado de acordo com a finalidade de experimental. Se o tempo de aprendizagem no estágio 4B é importante, então, pode ser aconselhável remover quaisquer odores até esta fase. Isso garante que qualquer aprendizagem olfactiva começa no estágio 4B. Para fazer isso, que temos realizado este protocolo, removendo o odor da fase 3 e, ignorando a etapa 4A inteiramente. Os ratos terá mais dificuldade em alcançar os critérios de conclusão usando esse método, mas isso também dá informações valiosas para como ratos aprendem rapidamente esta tarefa pela primeira vez.

Uma limitação do presente protocolo é que os ratos têm que completar os diferentes estágios até testes olfativos podem ser realizados. Portanto, embora não visto pelo nosso laboratório, uma manipulação possa impedir cognição tal que estágio 4B consistentemente não é alcançado. Tentamos negar este problema, garantindo que cada estágio é suficientemente o bastante para permitir que a maioria dos ratos se formar para a próxima etapa de formação. No entanto, se um rato não alcançar os critérios de conclusão para uma fase mesmo após o período de formação completa, removemos esse rato de coorte. Isso nos permite continuar o estudo sem esperar qualquer mouse individuais. Outra limitação é que ainda temos que estender este protocolo para outros modelos animais importantes para o campo da olfação. Ratos, por exemplo, têm sido fundamentais para revelar a função neuronal dentro o OB11,12. Devido a sua inteligência, ratos também têm mais rápido aprendizado vezes que ratos13,14. Apesar dessas limitações, optamos por ratos para este protocolo por causa da sua rastreabilidade genética para a realização de manipulações específicas do tipo de célula e gravações15.

A maioria dos protocolos existentes usam diferenças de odor farejadores ou tempo gasto próximo a odores para aproximar a discriminação ou aprender4,6,9,10,16. Este protocolo diretamente pode medir discriminação em uma base de julgamento por julgamento. Além disso, este pode medir o número exato de ensaios que cada rato precisa aprender uma associação. Esta abordagem totalmente automatizada remove quaisquer preconceitos humanos a partir da análise de dados. Animais privados de alimentos também têm sido utilizados com sucesso para o aprendizado olfativo. Ratos privado de água foram escolhidos devido ao aumento do número de ensaios que um rato pode realizar com água sobre alimentos16.

Como monitores de atividade implantável, tais como lentes de Graded-Index (sorriso) e multi-unidade eletrodos, continuam a melhorar, em breve poderemos combinar essas tecnologias com este protocolo17,18. Gravando-se áreas do cérebro relevantes de forma durante a aprendizagem olfativa, é possível a sonda neuronal como mudança de atividades durante a aprendizagem associativa. Isto pode ajudar a revelar questões fundamentais da neurociência, tais como como neurônios codificam informações de forma diferente durante a aprendizagem.

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Disclosures

Os autores declaram não há conflitos de interesses e não interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este protocolo é adaptado do trabalho anterior no nosso laboratório (Huang et al. 8). todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) do Baylor College of Medicine e cuidado Animal. É suportado pelo McNair Medical Institute, NINDS grant R01NS078294 para B.R.A., concessão de NIH IDDRC U54HD083092, concessão NIDDK F30DK112571 a JMP e concessão NINDS F31NS092435 de CKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass vial Qorpak GLC-01016
Silicon Tubing Thermo Scientific 86000030
18 gauge needles BD 305196
1-Butanol Sigma Aldrich 437603
Propionic Acid Sigma Aldrich 402907
Mouse Chamber Med Associates ENV-307W
Chamber Floor Med Associates ENV-307W-GFW
Water Port Med Associates ENV-313W Need two
Odor stimulus Med Associates ENV-275 Contain 2 valves to gate odor delivery 
Odor Port Med Associates ENV-375W-NPP
USB Interface Med Associates DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter VWR 97004-952
Behavioral software Med Associates SOF-735 This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software Med Associates SOF-731 This software formats the data to Excel
Training Software Med Associates DIG-703A-USB This software is used to program each training stage
Water Valve Neptune Research 225P012-11 This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve Neptune Research 360P012-42 This valve is used to gate the odor delivery. Need Two

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6, (5), 507-518 (2003).
  2. Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22, (14), 6106-6113 (2002).
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Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos
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Liu, G., Patel, J. M., Tepe, B., McClard, C. K., Swanson, J., Quast, K. B., Arenkiel, B. R. An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice. J. Vis. Exp. (133), e57142, doi:10.3791/57142 (2018).More

Liu, G., Patel, J. M., Tepe, B., McClard, C. K., Swanson, J., Quast, K. B., Arenkiel, B. R. An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice. J. Vis. Exp. (133), e57142, doi:10.3791/57142 (2018).

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