Summary
El objetivo del protocolo es construir un modelo de inflamatoria gingival humano in vitro. Este modelo de tejido co cultiva tres tipos de células humanas, queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, en condiciones de tridimensionales. Este modelo puede aplicarse a la investigación de enfermedades periodontales como gingivitis y periodontitis.
Abstract
Enfermedades periodontales (como gingivitis y periodontitis) son las principales causas de pérdida de dientes en adultos. Inflamación en la encía es la fisiopatología fundamental de las enfermedades periodontales. Actuales modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos para enfermedades periodontales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para reconstruir equivalentes de humano tejido inflamatorio de la encía (iGTE) en vitro. Primero construimos equivalentes de tejido humano de la encía (GTE) utilizando dos tipos de células humanas, incluyendo fibroblastos gingivales humanos (HGF) y queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT), bajo condiciones tridimensionales. Creamos un modelo de la herida usando un golpeador de tejido para hacer un agujero en el GTE. Próxima, humanas THP-1 monocitos mezclados con gel de colágeno se inyectan en el orificio del GTE. Por adimistration de 10 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) por 72 h, distinguen células THP-1 en macrófagos a focos inflamatorios forma en GTE (iGTE) (IGTE también puede ser stumilated con 2 μg/mL de los lipopolisacáridos (LPS) por 48 h para iniciar la inflamación ). IGTE es el primer modelo en vitro de encía inflamatorio con células humanas de una arquitectura tridimensional. IGTE refleja importantes cambios patológicos (immunocytes hidrógeno, interacciones intracelulares entre fibryoblasts, las células epiteliales, monocitos y macrófagos) en enfermedades periodontales. GTE, GTE herido y iGTE pueden utilizarse como herramientas versátiles para el estudio de la cicatrización de heridas, regeneración tisular, inflamación, interacción célula-célula y medicamentos potenciales pantalla para enfermedades periodontales.
Introduction
Enfermedades periodontales son la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Gingivitis y la periodontitis son las enfermedades periodontales más comunes. Ambos presentan cambios inflamatorios agudos o crónicos mediada por biofilms en encía. Gingivitis se caracteriza por inflamación aguda, mientras que la periodontitis se presenta generalmente como una inflamación crónica. A nivel histológico, los componentes bacterianos desencadenan la activación de las células inmunes como macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y mastocitos1,2. Estas células inmunitarias, especialmente macrófagos, interactúan con las células locales (incluyendo las células epiteliales gingivales, fibroblastos, células endoteliales y osteoblastos) dando lugar a lesiones inflamatorias en el tejido periodontal3,4. Modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales, como ratas, hámsters, conejos, hurones, caninos y primates. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos de enfermedades periodontales5. Co cultivo de bacterias periodontales y células epiteliales orales humanos monocapa se ha utilizado para investigar el mecanismo de las infecciones periodontales6. Sin embargo, cultivos monocapa de células orales carecen de la arquitectura celular de tridimensional (3D) de tejido intacto; por lo tanto, no imitan la situación en vitro .
Aquí, equivalentes 3D tejido humano inflamatoria de la encía (iGTE) se establecen para representar enfermedades periodontales en vitro. Este modelo 3D de las enfermedades periodontales ocupa una posición intermedia entre los cultivos celulares monocapa y en modelos animales. Tres tipos de células humanas, incluyendo queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, se cultivan conjuntamente en gel de colágeno y estimulados por inflamatorias iniciadores para construir iGTE. IGTE simula de cerca las condiciones en vivo de diferenciación celular, interacción célula-célula y activación de los macrófagos en la encía. Este modelo tiene muchas aplicaciones posibles de drogas evaluación y análisis de nuevas aproximaciones farmacológicas en enfermedades periodontales, así como para analizar los mecanismos celulares y moleculares en la cicatrización de heridas, inflamación y regeneración de los tejidos.
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Protocol
Este protocolo está diseñado para crear equivalentes de tejido gingival humano, modelos de heridas gingivales y gingivitis modelos. Queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT) fueron amablemente proporcionados del Profesor Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemania)7. Los fibroblastos gingivales humanos (HGFs) fueron aislados de tejidos gingivales según los protocolos previamente publicados8. El consentimiento informado fue obtenido previamente y el estudio fue aprobado según los lineamientos establecidos por el Comité de ética, la Nippon Dental University Facultad de vida Odontología de Tokio (número de autorización: NDU-T2012-35). Pasos del protocolo 1 al 3 deben realizarse en una campana de cultivo celular.
1. preparación de los equivalentes de tejido humano 3D de encía (GTE) (figura 1A)
- Mezclar colágeno tipo-un gel con 10% concentrado MEM-alfa y reconstrucción 10% buffer (2,2 g de NaHCO3 y 4,47 g HEPES en 100 mL 0.05 N NaOH) en un tubo de 15 mL estéril mediante pipeteo. Mantener la solución de colágeno mezclado en hielo hasta su uso.
- Colocar insertos de cultura 24-well (poro tamaño 3.0 μm) en una placa de 24 pocillos.
-
Quitar HGFs de la superficie de cultivo con solución al 0.25% tripsina-EDTA. Suspender las células en 10 mL de medio de cultivo A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Contar las células de un contador de células de Türk Bürker.
- Extraer la cantidad deseada de las células (1-5 x105 células/mL) y centrifugar durante 4 min a 190 x g.
- Suspender las células en la solución de colágeno mixta. Mantenga la mezcla en hielo hasta el siguiente paso.
- Agregar 0,5 mL de la mezcla de células de colágeno (0,5 – 2,5 x 105 células/pocillo) en el inserto de cultura sin producir burbujas. Incubar la mezcla por 10-30 min en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 º C para coagular la mezcla en un gel.
Nota: Agregar la mezcla de colágeno en el centro de la inserción de la cultura para evitar la formación desigual del gel de colágeno. - Añadir 1 mL de medio de cultivo en el pozo y 0,5 mL en el inserto. Incubar la placa de cultivo de 24 h o toda la noche en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C.
- Eliminar las células HaCaT desde la superficie de cultivo con solución al 0.25% tripsina-EDTA. Suspender las células en 10 mL de medio B (DMEM 10% FBS + 1% GlutaMAX) y contar las células. Extracto de la cantidad necesaria de células (1 – 5 x 105 células/mL) con una pipeta, centrifugar durante 4 min a x 190 g. suspender las células en medio B.
- Retire el medio de los insertos de la cultura, que contienen la mezcla de HGF-colágeno, por la aspiración. Agregar 0,5 mL de suspensión de células HaCaT (0,5 – 2,5 x 105 células/pocillo) en la parte superior de la mezcla de HGF-colágeno. Incubar los cultivos para 24 horas o durante la noche.
Nota: En este momento, el medio de la cultura bien debe ser A medias, mientras que el medio de la inserción de la cultura debe ser medio B. - Reemplazar el medio de cultivo con KSR medio (co-cultivo) (MEM-alfa + 15% nocaut suero recambio + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Añadir 1 mL de medio de cultivo en la cultura bien y 0,5 mL en el inserto de la cultura. Incubar los cultivos durante 24 – 48 h.
- Reemplazar el medio de cultivo con medio KSR + 1% FBS. Añadir 1 mL en la cultura bien y 0,5 mL en el inserto de la cultura. Incubar los cultivos para 24 horas o durante la noche.
- Reemplazar el medio de cultivo en la cultura con 0,7 – 1 mediano KSR de mL. Retire completamente el medio de la inserción de la cultura (la superficie de la cultura debe estar expuesta al aire). Incubar los cultivos durante 1 – 2 semanas. Cambiar el medio en la cultura bien dos veces por semana.
Nota: No deje que el aumento del nivel medio sobre la superficie de cultivo (la capa superior compuesta de queratinocitos). Mantenga la superficie de cultivo seco.
2. preparación de GTE herido (figura 1B)
- Preparar un golpeador de tejido de 1 – 3 mm de diámetro. Esterilizar con un autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
- Introduzca el punzón de tejido perpendicular GTE sobre 300 μm de profundidad y perforar un agujero en el tejido para simular una herida.
- En este paso, utilice el GTE de heridos para la investigación de regeneración de tejido y cicatrización de herida. Por otra parte, fijar GTE uso tampón neutro de formalina al 10% para realizar el análisis histológico.
3. preparación de GTE inflamatoria (iGTE) (figura 1B)
- Cultivar células THP-1 según el anterior informe9.
- Mezclar colágeno tipo-un gel con 10% concentrado RPMI 1640, almacenador intermediario de la reconstrucción de 10% (2,2 g de NaHCO3 y 4,47 g HEPES en 100 mL 0.05 N NaOH) y 10 ng/mL PMA. No la solución de colágeno mezclado en hielo hasta su uso.
- Cuenta de 1-2 x 106 THP-1 células y centrifugar durante 4 min a x 190 g. suspender las células en 1 mL de la solución de colágeno mixta. Mantenga la mezcla en hielo hasta el siguiente paso.
- Añadir mezcla de 10-30 μL THP-1-colágeno en el área de heridos de GTE. Reemplazar el medio de cultivo a 0,7 – 1 medio KSR de mL que contiene 10 ng/mL de PMA.
- Incubar la mezcla en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C por 72 h.
- Utilizar el modelo para la investigación de gingivitis o enfermedad periodontal (por ejemplo, añadir potencial medicamento antinflamatorio a iGTE a ver sus efectos en el cytokine release10). Como alternativa, omite 72 h PMA-tratamiento, añadir 2 μg/mL de LPS en la cultura e incubar el tejido en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C por 48 h11,12.
4. la fijación y el Immunostaining de montar toda de GTE y iGTE culturas
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Fijación de las culturas.
- Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos. Lavar los tejidos 2 veces con tampón fosfato salino (PBS).
- Añadir 1 mL de formol al 10% buffer neutro solución el prospecto y 1 mL a la cultura también. Deje la placa de 24 pocillos en un refrigerador a 4 ° C durante la noche.
- Retire la solución de tampón neutro de formalina 10% al día siguiente.
- Por todo Monte immunostaining, lavar los tejidos 3 - 4 veces con PBS después de la fijación.
- De hematoxilina y eosina (H & E) coloración y immunostaining regular, proceder con la deshidratación, inclusión en parafina y seccionamiento.
Nota: Para todo immunostaining de Monte, puede omitirse este paso.
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Todo Monte inmunotinción
Nota: Este protocolo fue modificado de la referencia 13.- Lavar los tejidos 3 x en PBS 0.5 – 1% Triton, 10-30 min cada vez.
- Incubar los tejidos dos veces por 30 min en solución amortiguadora de bloqueo (PBS 1% Tritón + BSA de 10%), a temperatura ambiente.
- Lavar los tejidos 2 × en solución amortiguadora de bloqueo, 5 – 10 min cada vez.
- Añadir 50 μl de solución de anticuerpo primario en la dilución/concentración requerida a los insertos. Utilice una película delgada transparente plástico para envolver los insertos para evitar secar el tejido.
- Incubar el tejido durante 1 a 2 días a 4 ° C.
- Lavar los tejidos 3 veces, durante 30 minutos en PBS 1% Tritón + 10% de BSA. Lavar nuevamente 3 veces, durante 5 minutos en PBS 1% Triton.
- Añadir 50 μl de anticuerpo secundario en solución amortiguadora de bloqueo (PBS 1% Tritón + BSA de 10%) y 5 μl de solución de Hoechst 33342 (tinción de NucBlue en vivo de la célula) para cada insert. Utilice una película delgada transparente plástico para envolver los insertos para evitar secar el tejido.
- Incubar durante 1 a 2 días a 4 ° C. Envolver la placa de 24 pocillos en una toalla de papel húmeda y luego ponerlo en un envase plástico para ser utilizado a lo largo de la incubación.
- Lavar los tejidos 3 veces, durante 10 min en el Tritón de PBS 1%
- Utilice una aguja afilada para cortar la membrana de la inserción de la cultura para obtener el tejido. Colocar la membrana en un portaobjetos.
Nota: El tejido debe estar en la membrana. - Añadir 2-3 gotas de medio de montaje de fluorescencia. Cubrir el tejido con una cubierta de vidrio y conservar a 4 ° C en la oscuridad hasta su análisis.
- Ver los tejidos con un láser confocal de barrido microscopía (LSM).
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Representative Results
Las células HaCaT muestran morfología típica del keratinocyte bajo observación microscópica de contraste de fase (figura 2A). Scanner electrón microscópico (SEM) las imágenes demostraron que las superficies de células HaCaT estaban cubiertas por microvellosidades muchos. Conexiones intercelulares entre las células HaCaT fueron mediadas por procesos de membrana (figura 2B). Las células HaCaT expresaron epitelio gingival marcador K8/1814, indicando que las células HaCaT son adecuadas para la reconstrucción de la encía (figura 2).
Figura 3A muestra un ejemplo exitoso de GTE, y la figura 3B muestra un ejemplo fallido de GTE. El ensayo fracasado (figura 3B) es causado por la mezcla de gel de colágeno no se agrega en el centro de la inserción de la cultura. Figura 3 demostró que se puede hacer un modelo de herida de GTE perforando un agujero en el tejido con un golpeador de tejido. H & E tinción (figura 3D) y las imágenes de SEM (figura 3E) demostraron que en 19 días de cultivo, sobre 10-20 capas de epitelio de forma células HaCaT y colágeno embebido en gel HGF células forma propria de la lámina. En la lámina propia de la GTE reconstruido, HGF células exhiben una morfología característica de los fibroblastos (figura 3F) y fueron rodeadas por conjuntos bien definidos de fibras de colágeno (figura 3). Tinción de inmunofluorescencia demostró que vimentin y TE-7 (ambos son marcadores de fibroblastos dérmicos15) están expresados en la lámina propia de la GTE (Figura 4A y 4B). K19, un marcador específico de epitelio junctional y bolsillo en periodontitis16, está débilmente expresado en el epitelio del GTE (figura 4) y se expresa fuertemente en el epitelio del iGTE (figura 4). Los datos sugieren que células HaCaT pueden diferenciarse en células epiteliales clave en periodontitis, especialmente después de la estimulación inflamatoria de la lámina propia.
Enfermedades inflamatorias de la encías, como gingivitis y periodontitis, se caracterizan histológicamente por la presencia de linfocitos y macrófagos y resultan en fibrosis y tejido necrosis17,18. En este protocolo, se utilizaron células THP-1 como las células inflamatorias para iGTE. Como se muestra en la figura 5, sin PMA-estimulación, las células THP-1 presentan una morfología monocítica y la mayoría de ellos flotando en el medio (figura 5A). En cambio, después de estar expuesto a PMA 10 ng/mL durante 72 h, más del 50% de las células THP-1 diferenciado en células similares a macrófagos y adherido a la superficie de cultivo (figura 5B). Similar a la de células HaCaT y HGF8, células THP-1 crecieron bien dentro el gel de colágeno en el cultura Co medio (KSR) y diferenciado en macrófago-como las células después de PMA-tratamiento (figura 5). Immunostaining demostró que las células THP-1 adheridas expresaron CD68 (un marcador de macrófagos19) (figura 5) y CD14 (otro marcador de macrófagos) (figura 6). Para formar el iGTE, monocitos THP-1 encajados en el gel de colágeno e inyectados en el orificio que simula una herida (figura 5E). A las 72 h después de PMA (10 ng/mL)-estímulo, células THP-1 diferenciadas en macrófagos (figura 5F) dentro del agujero simulando una herida y expresó CD68 (figura 5), indicando que son capaces de focos inflamatorios de forma en el GTE de heridos.
Todo Monte inmunohistoquímica (figura 6) mostró que las células THP-1 en el orificio que simula una herida no sólo expresan CD14 (otro marcador de macrófagos), pero también expresar vimentin, así como los fibroblastos en el borde del agujero. Vimentina se expresa por los macrófagos activos20. Los datos confirmaron que los macrófagos THP-1 son funcionales.
Figura 1: diseños experimentales. Disposición experimental de los equivalentes de tejido humano 3D de encía (GTE) (A) y GTE inflamatoria (iGTE) (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: caracterización de los queratinocitos HaCaT. (A) imagen microscópica de contraste de fase de células HaCaT en cultura. Barra de escala = 50 μm. (B) imagen SEM de células HaCaT. (C) inmunohistoquímica tinción de células HaCaT para marcador de células epiteliales gingivales K8/18. Verde, K8/18. Azul, DAPI. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: caracterización de los equivalentes de tejido humano 3D de encía (GTE). (A) ejemplo de un exitoso GTE en la cultura. El tejido es en medio de la inserción de la cultura. (B) ejemplo de un GTE fallido: parte del GTE se separa del tejido y sesgado hacia la pared (flecha roja). (C) heridos GTE: flecha amarilla indica un agujero perforado por el golpeador de tejido. (D) H & E tinción de GTE cultivado durante 19 días (14 días aire exposición). Barra de escala = 50 μm. (E) imagen SEM de una sección vertical de GTE cultivado durante 19 días. (F) imagen microscópica de HGF células en gel de colágeno que forma la lámina propia de la GTE de contraste de fase. Barra de escala = 25 μm. (G) SEM la imagen masiva de fibras de colágeno alrededor de las células HGF en el propria de la lámina de GTE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: expresión de vimentina, TE-7 y K19 en GTE. Inmunofluorescencia de tinción de GTE para lámina propia marcadores vimentina (A y B) y TE-7 (B) en el GTE y epidermis marcador K19 en GTE (C) y (D) del iGTE. Rojo, vimentin y K19. Verde, TE-7. Azul, DAPI. E, epidermis; LP, propria de la lámina. Barra de escala = 50 μm (A, C y D), 20 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: caracterización de células THP-1. (A) no diferenciadas THP-1 células en cultura. Barra de escala = 15 μm. (B) de macrófagos THP-1 distinguido. Barra de escala = 15 μm. (C) células THP-1 fueron incrustadas en gel de colágeno en medio KSR y tratadas con PMA para 24 h. escala de la barra = 50 μm. (D) la coloración de Immunohistochemical de macrófagos THP-1 en marcador macrófago CD68. Rojo, CD68. Azul, DAPI. Barra de escala = 5 μm. (E) THP-1-colágeno mezcla en el agujero herido de HGE al principio del tratamiento del PMA. Barra de escala = 25 μm. (F) células THP-1 diferenciadas en macrófagos (flechas rojas) a las 72 h después del tratamiento de PMA. Barra de escala = 25 μm. (G) THP-1 células macrófagos expresa marcador CD68. Línea amarilla discontinua indica el área del orificio herido en bar H & E. escala = 100 μm. rojo, CD68. Azul, hoechst 33342. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: caracterización del iGTE. Todo Monte immunohistochemistry para CD14 (verde) y el vimentin (rojo) fue realizado en iGTE. Imágenes de la serie Z (C) capturadas con los iGTE (416 μm en total. Panel 1 es la primera sección que LSM escaneado y panel 25 es el último. El intervalo es de 16.64 μm entre secciones). Sección representativa (A) (no. 17 de las imágenes de la serie Z), ortofoto e imagen 3D de Z-pila (B) presentan la distribución 3D de macrófagos THP-1 CD14 y vimentina positiva en el orificio simulando una herida en el iGTE. La posición análisis de LSM en iGTE está indicada en (D) y la esquina superior izquierda en (A). Barra de escala = 50 μm. amarillo las líneas punteadas indican el área del orificio herido en iGTE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo se basa en métodos de creación de tejido gingival equivalentes y equivalentes de tejido adiposo subcutáneos, según anteriores informes8,21,22. Aunque este es un método simple y fácil, algunos pasos requieren especial atención. Por ejemplo, la mezcla de colágeno debe conservarse en hielo hasta su uso para evitar la formación de gel en la solución. Cuando se agrega la mezcla de colágeno en el inserto de la cultura, asegúrese de que la solución se inyectó en el centro del relleno para evitar la formación de un gel sesgado (como en la figura 3B). Perforar un agujero en GTE también necesita habilidad. El golpeador de tejido a veces no puede recoger el tejido si el tejido está demasiado húmedo. Un sistema de biopsia de tejido o un par de fórceps sería útil; sin embargo, las dimensiones de la ubicación del herido mucho cambiará. También es posible utilizar una jeringa con aguja para inyectar la mezcla de colágeno de células THP-1 sin un agujero de perforación (Asegúrese de que el gel no obstruir la aguja).
La limitación de este método es que es capaz de representar perfectamente los fenómenos biológicos complejos de gingivitis y periodontitis, porque iGTE carece de vasos sanguíneos, células neuronales y otras células inmunes y la inflamación no es causada por la interacciones huésped-biofilm. Sin embargo, es el único en vitro gingivitis tejido modelo hecho por las células humanas que en parte presenta la patología de la inflamación gingival. El modelo puede ser modificado para ser más similar a la verdadera gingivitis y enfermedad periodontal 1) cultivar Co GTE con biofilm crear interacciones host-biofilm o estimular las respuestas inflamatorias en iGTE utilizando LPS (los compuestos en la membrana externa de Bacterias Gram-negativas y un fuerte promotor inflamatorio como hemos sugerido en el protocolo), 2) siembra la solución HGF de colágeno en dientes extraídos para formar complejos de diente encía y observando cómo influye en la inflamación en la encía tejido duro y 3) con células epiteliales gingivales humanas para formar la epidermis de GTE y iGTE.
Con los métodos presentados aquí, GTE y iGTE culturas pueden utilizarse como herramientas versátiles para el estudio de la cicatrización de heridas, regeneración tisular, inflamación, interacción célula-célula y a los medicamentos potenciales pantalla para gingivitis y enfermedad periodontal.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) subvenciones para la investigación científica (26861689 y 17 K 11813). Los autores desean agradecer al Sr. Nathaniel Green por corrección.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
References
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