Summary
Ett protokoll för utvinning av en periplasmic övergång metall förkläde i samband med dess infödda bindande partner och biofysiska karakterisering av dess substrat tillfredsställer av X-ray fluorescens och radiometal upptag presenteras.
Abstract
Vi visar en skalbar metod för separation av den bakteriella periplasm från cytoplasman. Denna metod används för att rena periplasmic protein för biofysiska karakterisering, och åtgärden substrat överlämning mellan periplasmic och cytoplasmiska fack. Genom att noggrant begränsa den tid som periplasm avskiljs från cytoplasman, kan försöksledaren extrahera proteinet av intresse och assay varje fack individuellt för grundmaterial utan överföring kontaminering mellan fack. Extraherade proteinet från fraktionering kan sedan analyseras ytterligare för tredimensionella strukturbestämning eller substrat-bindande profiler. Denna metod kan alternativt utföras efter inkubation med en radiotracer att fastställa totala procent upptag, samt distribution av spårämne (och därmed metall transport) över olika bakteriella fack. Experiment med en radiotracer kan hjälpa till att skilja mellan ett fysiologiska substrat och tingsliga substrat, såsom de som orsakas av mismetallation.
X-ray fluorescens kan användas för att upptäcka närvaron eller frånvaron av metall inkorporering i ett prov, samt mäta förändringar som kan uppstå i metall inkorporeringen som en produkt av tillväxt villkorar, rening villkor eller kristallisering villkor. X-ray fluorescens ger också ett relativt mått av överflöd för varje metall, som kan användas för att bestämma den bästa metalliska energi absorption toppen att använda för avvikande X-ray scattering datainsamling. Radiometal upptag kan användas som en metod för att validera fysiologiska beskaffenhet ett substrat som upptäcks av X-ray fluorescens, samt stödja upptäckten av nya substrat.
Introduction
I gramnegativa bakterier, cytoplasmiska pooler av övergången belägger med metall atoms ökade och fylls på av inre membranet ABC (ATP-bindande kassett) importörer som mildra metall flyttning över det inre membranet. Periplasmic kluster A-1 substrat-bindande proteiner (SBPs) komponera en grupp av följeslagare som binder metallatomerna direkt och ferry dem genom periplasm att leverera dem till cognate ABC importörer1. Andra kluster av SBPs är avsedda för transport av substrat, såsom kelaterade metall (kluster a-2), kolhydrater (kluster B och d-1) och aminosyror (kluster B, C, f-2 och f-4); ändå, oavsett substrat, SBPs följa ett evolutionärt bevarade c-clamp fold2. Den generaliserade föreslagna mekanismen för SBP substrat överföring innehåller c-klämman som genomgår en rad krumbukter som liknar en Venus flugfälla3. I allmänhet renar kluster A-1 SBPs i holo (metall-bunden) form, men studien av dessa SBPs är begränsat av svårigheten att generera apo (metallfri) former av protein för experiment4. Hittills har strategier för att studera apo kluster A-1 SBPs begränsats till mutagenes, dialys och partiell denaturering med etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA) kelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. strukturella uppgifter som härrör från dessa experiment tyder på att klustret A-1 SBPs inte kanske exakt följer Venus flytrap mekanismen. För närvarande saknas i litteraturen är en metod för att producera apo kluster A-1 SBPs i vivo med fysiologiska bindande partner.
Vi visar för första gången använder cell fraktionering för att rena YfeA, en kluster A-1 SBP från Yersinia pestis, det etiologiska medlet av pesten, som omvandlades till formuläret apo genom samverkan med dess fysiologiska besläktat YfeBCDE ABC-importör i cellen. Vi visar YfeA i apo form av energi-dispersive X-ray spektroskopi (EDS), även känd som X-ray fluorescens. Vi visar också YfeBCDE funktionalitet genom att kombinera cell fraktionering med mycket känsliga radioaktiv metall upptag studier att skilja metall upptag över det yttre membranet och metall import över det inre membranet. Användning av ett radioaktivt spårämne tillåter för detektion av pg/L mängder metaller, mycket lägre än detektionsgränsen för tekniker sådan som induktivt kopplad plasma-masspektrometri (ICP-MS) eller atomabsorption spektroskopi (AAS). Detta möjliggör minimal störning av systemet som studeras. Dessutom kräver de traditionella metoderna ofta större provmängder, ytterligare efterbehandling och längre leveranstider, som inte är typiska för radiotracer analyser. Således, med hjälp av en radiotracer ger en bekväm och okomplicerad metod för övervakning av metall distribution och upptag inom en cell. Det återstår för att pröva om en apo kluster A-1 SBP som framställs med denna metod skulle echo strukturella observationerna från de aktuella metoder som används för att generera apo protein.
Cell fraktionering är en etablerad metod för att separera cellulära fack för det implicita syftet särskilt sondera deras innehåll i isolering12. Cell fraktionering används ofta för att bekräfta platsen för en molekyl under cellcykeln eller mäta aktiviteten av en särskild kupé13. Till exempel kan metall transportverksamhet analyseras genom sondering cellulära fack för metallsubstrat. Att integrera cell fraktionering gör åtskillnad och jämförelse mellan metall upptag över det yttre membranet och Metallöverföring över det inre membranet. Dessa processer kan sedan i sin tur mätas över tiden. När det gäller protein rening, de vanligaste metoderna för cell lysis och separation av lösliga komponenter från olösliga komponenter är mekaniska störningar (dvs, malning, blandning), högt tryck homogenisering (dvs franska tryck cell press, cell ämnen), och ultraljud frekvenser (dvs., ultraljudsbehandling)14. Användningen av ultraljud frekvenser att lysera celler passar generellt bäst för små volymer; ultraljudsbehandling är dock känt att generera hetta som kan denaturera proteiner. För att undvika genererar stark hetta, tillämpas normalt ultraljud frekvenser i sekventiella korta skurar, som kan vara tidskrävande och oavsiktligt försämra DNA-molekyler i mindre fragment. Dessutom kan flera dyra ultraljudsbehandling sonder krävas för preparativ och analytisk experiment, som varje sond har ett begränsat utbud för den provvolymen som kan bearbetas. Användning av högt tryck för att lysera celler undviker generera hetta under cellys genom kylning franska tryck cell press komponenter före Lys eller driver en cell disruptor i en kall miljö som ett kallt rum. Som ultraljudsbehandling sonder, kan flera uppsättningar av franska tryck cell press komponenter behöva köpas för att bearbeta ett brett utbud av provvolymer. Franska tryck cell press församlingar är lätt att ansluta men obekväma att använda och rengöra, kan vara tung att flytta och är benägna att igensättning från täta prover. Fördelar med att använda ultraljud frekvenser och högtrycks system för att lysera celler inkluderar höga samplingsfrekvenser återhämtning, förmåga att bearbeta flera prover med minimal korskontaminering, och justerbar klippning kraft, som kan anpassas för Lys optimering av ett brett utbud av provtyper. Optimering kan uppstå genom att justera ultraljud frekvensen, varaktigheten av skurar, kolv trycket pounds per kvadrattum (psi) och antalet passeringar genom pressen. Användning av mekaniska störningar att lysera celler kan vara den mest tekniskt trivialt och minst kostsamma strategin för cellys. Mekaniska störningar kan presentera utmaningar i provet återhämtning och är inte idealisk för bearbetning av flera prover. Mekaniska störningar är skonsammare att prover än högtryck eller ultraljud frekvenser, men är inte hög genomströmning och är benägna att ineffektiva lysis. En betydande experimentella begränsning av mekaniska störningar, högt tryck homogenisering och ultraljud frekvenser, är okontrollerbar störningar av hela cellulära arkitektur sådan att efter Lys, alla vattenhaltiga cell komponenterna blandas tillsammans. Dessutom stör alla cell fack inte på samma gång; innehållet i fack som lyse tidigt kan därför föremål för pågående störande krafter längre än innehållet i fack som lyse sent. Cell fraktionering möjliggör billiga, effektiva och tekniskt okomplicerad fack-baserade separation av cellinnehåll samtidigt undvika behovet av dyrbar utrustning och prov exponering för hårda, störande krafter.
När det gäller SBP, importerade substrat återinförs till potentiellt apo protein och regenererar holo protein under Lys, före nedströms kromatografi eller andra tekniker för rening. Införandet av EDTA kelator under Lys presenterar ytterligare hinder, där metall affinitet som ett första steg av protein rening inte är möjlig eftersom EDTA kommer remsor metall från kromatografi kådan och förhindra protein bindande15. En enkel och billig lösning är cell fraktionering av osmotiska chock, där differentiell centrifugering och gemensamma laboratoriereagenser aktivera utredaren att försiktigt extrahera tillräckligt protein för funktionell analys. Osmotiska chock fraktionering använder tredjeparts en två-stegs förändring i osmotiska trycket att separera cellulära fack. För det första en hyperton buffert gör cellerna till crenate när vattnet lämnar varje cell och för det andra en hypoton buffert orsakar celler att svälla som vatten in varje cell. Genom att noggrant kontrollera hur länge cellerna sväller, de yttersta membran kan vara selektivt lyserat (på grund av ackumulering av osmotiska trycket från inkommande vattnet), således tömma innehållet i bufferten. Bevarandet av de inre membran säkerställer att cytoplasmiska innehållet finns kvar i spheroplasts, och är lätt separeras från periplasmic innehåll genom centrifugering.
YfeA är en polyspecifikt SBP kan bindande järn, mangan och zink atomer16. De relativa proportionerna av bolagiserade metall kan ändras enligt metall tillskott under tillväxt och analyseras av X-ray fluorescens som finns vid Argonne National Laboratory's Advanced Photon Source16. X-ray fluorescens gör det möjligt för utredaren att snabbt profilera en bred sammansättning av metaller utan behov av stora eller diffraktion kvalitet kristaller, och kan även få fram data från protein fällning eller proteinhaltiga lösning.
X-ray fluorescens kan snabbt avslöja oväntade resultat såsom i detta fall den primära YfeA substrat som zink och inte dokumenterade fysiologiska substrat järn eller mangan16. Om används framför X-ray scattering datainsamling, kan X-ray fluorescens informera utredaren i experimentell design, till exempel vilka metall energi kanter om du vill använda för avvikande X-ray scattering datainsamling. Lika användbar som att bestämma det relativa överflödet av en metall, X-ray fluorescens kan också avgöra om en metall är frånvarande i ett prov, vilket är en snabb metod att separera kristaller innehållande apo protein från holo protein och uppskatta metall signalstyrka utan behov av tidskrävande databehandling. På att identifiera ett prov med en stark metall signal, kan exakta våglängden för avvikande X-ray scattering datainsamling bestämmas av multipel-våglängd avvikande dispersion (MAD) scan.
Detta detaljerade protokoll är avsett att hjälpa nya praktiker framgångsrikt utföra cell fraktionering och göra effektiva användningen av synkrotron beamline hårdvara att profilera totala metallinnehållet och främja studiet av metall-bindande proteiner.
Protocol
1. bakteriell förrätt kultur (dag 1)
- I en avfasad 200 mL-mätkolv Inokulera 30 mL Luria Bertani buljong (LB) med Escherichia coli stam BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL celler innehållande pYFE3 plasmid16.
- Tillsätt 30 µL av 50 mg/mL ampicillin till kolven genom att aspirera med en pipett och 200 µL spets. Skaka över natten vid 225 rpm vid 37 ˚C.
2. kompletterade M9 Minimal Media förberedelse (dag 2)
Obs: Detta är anpassad från Amresco manual.
- Förbereda 6 L flytande medier genom följande procedur. I en 2 L avfasade mätkolv, tillsätt 10.5 g M9 minimal media till 1 L av ultrarena H2O. autoklav vid 121 ° c i 20 min och sedan svalna till rumstemperatur.
- Tillsätt aseptiskt följande sterila tillägg lösningar: 2 mL/L i 1 M MgSO4, 10 mL/L 20% w/v glukos, 0,1 mL/L av 1 M CaCl2och 1 mL/L av 50 mg/mL ampicillin. Utför det här steget om du i biologiska säkerhetsdragskåp upprätthålla en steril miljö. Varma media att 37 ˚C.
3. bakteriell subkultur
- Lägga till 5 mL/L av övernattning förrätt kultur i M9 minimal media genom aspirera med en automatiserad pipett och 5 mL spets. Skaka subkulturen kontinuerligt på 225 rpm vid 37 ° c för 9 h.
Obs: Detta steg YfeABCDE förekommer i ökad utsträckning av autoinduktion från dess infödda Y. pestis arrangören. - Återställa celler genom centrifugering vid 4500 x g under 30 minuter vid 4 ° c. Återsuspendera cellerna i 50 mL en iskall fosfatbuffertlösning (20 mM Na2HPO4 pH 7,6, 50 mM NaCl) av aspirera med en pipett och 1 mL spets och frysa över natten vid-80 ˚C.
4. cell fraktionering (dag 3)
- Tina resuspension på 4 ° C och pellet celler vid 4000 x g i 20 min vid 4 ˚C. Att resuspendera cellerna i 50 mL iskallt hög salt buffert (200 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM NaCl, och 2 mM EDTA) av aspirera med en automatiserad pipett och 25 mL spets. Inkubera suspensionen över isen för 20 min, med enstaka inversion för blandning.
- Pellet cellerna vid 4500 x g i 20 min vid 4 ˚C. Att resuspendera cellerna i 50 mL iskallt låg salt buffert (10 mM Tris-HCl pH 8,0) av aspirera med en automatiserad pipett och 25 mL spets. Inkubera suspensionen över isen för 20 min, med enstaka inversion för blandning.
- Pellets av spheroplasts vid 4 500 x g i 20 min vid 4 ˚C. Återställa supernatanten innehållande periplasm. Återsuspendera de pelleterat spheroplasts i fosfatbuffrad saltlösning (steg 3,2) av aspirera med en automatiserad pipett och 25 mL spets och lysera celler av tre cykler av franska tryck cell press på 1500 psi.
Obs: En fransk press cell press kan vara besvärligt att använda och använder en hydraulisk pump för att driva cellys. Var försiktig när engagerande hydraulpumpen, att garantera korrekt inriktning av pistongen med pressen, och hålla händerna fria till hydraulpumpens. - Pellet cellulära skräp på 50 000 x g i 20 min vid 4 ˚C. Återställa supernatanten innehållande cytoplasman. Om det behövs kan de yttre och inre membran finnas ytterligare fraktionerade16.
5. protein rening med FPLC
- Omedelbart efter fraktionering, filtrera den periplasmic fraktionen med en 0.45 µm membran enhet. Använda Luer lås spruta filter för enkel och snabb filtrering. Temperera en 5 mL Q anjon exchange kolumn med 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3 laddar buffert på ett flöde på 5 mL/min.
- Ladda periplasmic filtratet på förhand skakad 5 mL Q anjon Jonbytarkolonnen med 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3 laddar buffert på ett flöde av 2 mL/min. Fortsätt tvätta 5 mL Q anjon Jonbytarkolonnen med 20 mM Tris pH 7,6 , 0,05% w/v NaN3 lastning buffert tills en baslinje läsning av A280 uppnås vid ett flöde på 5 mL/min.
- Eluera bundna proteinet med 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3, 0 - 1 M NaCl av linjär gradient över 10 kolumn volymer på ett flöde på 5 mL/min. kombinera fraktioner som innehåller en280 -topp. APO YfeA eluerar mellan 200 mM NaCl och 300 mM NaCl.
- Koncentrera sig eluatet av centrifugal koncentrator tills volymen nått ~ 5 mL.
- Temperera en Superdex 200 pg gel filtrering kolumn med 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 50 mM NaCl, 0,05% w/v NaN3 gel filtrering buffert på ett flöde på 2,5 mL/min.
- Laddar den koncentrera anjonen utbyta eluatet på kolumnen pre skakade Superdex 200 pg gel filtrering och rena med gel filtrering buffert från steg 5,5 vid ett flöde på 2,5 mL/min. kombinera fraktioner som innehåller en280 -toppen som motsvarar en ~ 30 kilodalton (kDa) protein.
Obs: Följande referens är ett exempel FPLC experiment att demonstrera de protokoll17.
6. protein kristallisering
- Koncentrera sig gel filtrering eluatet av centrifugal koncentrator till en slutlig proteinkoncentration 22 mg/ml.
- Beräkna protein koncentrationen genom att dividera den A280 läsning av 1.276 mg/mL. Denna teoretiska extinktionskoefficient förutsågs av ExPASY ProtParam18.
Obs: En A280 provläsning av 5.104 AU motsvarar en 4.000 mg/mL lösning. 5.104 AU ÷ 1.276 mg / mL = 4.00 mg / mL.
- Beräkna protein koncentrationen genom att dividera den A280 läsning av 1.276 mg/mL. Denna teoretiska extinktionskoefficient förutsågs av ExPASY ProtParam18.
- Blanda 1,5 µL av protein med 1,5 µL av 30% w/v PEG 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 0,05% w/v NaN3 i sittande droppe eller hängande droppe setup genom att aspirera med en pipett och 10 µL spets.
- Inkubera kristallisering droppar på 293 K för 2-4 veckor.
- Flash-frysa kristaller i flytande kväve för transport till synchrotron.
7. X-ray fluorescens (med GM/CA Beamline programvara)
- Navigera till fliken Hutch . användning av energi undernummer ställa energi till 10,0 keV.
- Navigera till fliken Skanna . Navigera till Interactive tab. Mount provet.
- Välj optimera fluorescens signal. Ingång 4,00 s under tiden underrubriken. Välj ta fluorescens spektrum. Visa spektrumet hjälp Rita fliken.
8. MAD Scan för metall energi Absorption Peak (med GM/CA Beamline programvara)
- Flytta provet av balken. Navigera till fliken Skanna . Navigera till fliken periodiska Välj K-kanten av element av intresse.
Obs: Energivärdet i energi undernummer är i eV. - Navigera till fliken Hutch . användning av energi undernummer till inställt värde i steg 8,1 i keV energi.
- Flytta provet in i strålen. Navigera till fliken Skanna . Navigera till fliken Auto Input 2,00 s under tiden underrubriken.
- Välj Start Scan. Visa MAD genomsökningen använder fliken Rita .
Obs: Energivärdet i Peak underrubriken är eV i stället för keV. - Välj klar med fluorescens.
- Flytta provet från strålen. Navigera till fliken Hutch . användning av energi undernummer till inställt värde i steg 8,4 energi avrundat upp till den nästa eV (dvs topp: 9658.3 eV, inställt 9659 eV energi ).
- Flytta provet in i strålen. Samla in uppgifter. Upprepa steg 8,1-8,6 för alla metaller av intresse.
9. analytiska protokoll för radioaktiv metall upptag Assay
- I en 14 mL kultur tube, Inokulera 5 mL LB med E. coli stam BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL celler innehållande pYFE3 plasmid16. Tillsätt 5 µL av 50 mg/mL ampicillin av aspirera med en pipett och 10 µL spets. Skaka på 225 rpm vid 37 ° c för 7 h.
- Pellet cellerna vid 15 000 x g för 1 min i rumstemperatur med en bordsskiva centrifug. Tvätta cellerna i 1 mL av kompletterade M9 minimal media genom att aspirera med en pipett och 1 mL spets. Upprepa en gång.
- I en 50 mL konisk tub kompletteras subkultur celler till 30 mL M9 minimal media aspirera med en pipett och 1 mL spets. Skaka på 225 rpm vid 37 ° c för 9 h.
- Bestämma mängden radioaktivitet som krävs för att uppnå cirka 100.000 räknas per minut (cpm).
Obs: Detta kommer att variera beroende på radioisotoper och instrument som används för identifiering. Exempelvis ger ett prov som innehåller 7,4 kilobecquerel (kBq) (0,2 microcurie (µCi)) 52Mn en läsning av 550.000 cpm på en automatiserad gamma detektor (NaI). Således, mängden radioaktivitet som behövs för att få en sammanräkning av 100.000 cpm kan bestämmas med hjälp av följande ekvation: (100.000 cpm/550.000 cpm) * 7,4 kBq (0,2 µCi) = 1,35 kBq (0,036 µCi).
Försiktighet: radioaktivt sönderfall resulterar i utsläpp av joniserande strålning, vilket är farligt. När du arbetar med radioaktivitet alltid använda de lämpliga skärmning och följa principerna för som låg som rimligtvis är möjligt (ALARA) genom att öka avståndet och avskärmning samtidigt minska exponeringstiden. Endast utbildad personal ska hantera radioaktivitet i särskilt utsedda laboratorierna, som är licensierade för användning av radioaktiva ämnen. - Multiplicera krävs radioaktiviteten beräknas i steg 9,4 av den totala volymen av subkultur, att bestämma den totala mängden radioaktivitet nödvändigt. Lägga till detta belopp (helst i en liten volym av 50-100 µL) i röret som innehåller subkultur så att det finns 100.000 cpm/mL och vortex väl för 30 s.
Obs: För 31 mL av subkultur, den totala mängden radioaktivitet som krävs är 1,35 kBq (0,036 µCi) x 31 mL = 41,3 kBq (1,12 µCi). - Delprov 1 mL av subkulturen (nu innehållande radioaktivt spårämne) i enskilda 1,5 mL centrifug rör genom att aspirera med en pipett och 1 mL spets och plats i en 37˚C thermomixer, med vortexa på 1 × g. inkludera nog rör så att det finns tre replikat för varje önskas mätning samt tre ytterligare replikerar att använda som standarder (upphäva standarderna, utför inte fraktionering analysen på standarder).
Obs: Testmetoder på 1, 2 och 4 h skulle kräva 12 rör totalt. - Efter inkubation, Centrifugera rören vid 15.000 × g i 30 s med en bänkmonterade centrifug (helst kylas till 4 ° c) och kassera supernatanterna.
- Slamma upp cellerna i 1 mL iskallt, hög salthalt buffert (steg 4.1) genom att aspirera med en pipett och 1 mL spets, och placera omedelbart på is i 20 min.
- Pellet cellerna igen vid 15 000 × g i 30 s med en bänkmonterade centrifug (helst kylas till 4 ° c) och kassera supernatanterna.
Obs: Supernatanten innehåller oassocierade gratis metall. - Slamma upp cellerna i iskall, låg salthalt buffert (steg 4,2) av aspirera med en pipett och 1 mL spets och inkubera på is i 20 min.
Obs: Det är viktigt att aspirera försiktigt via pipett för detta steg. - Pellet cellerna vid 15.000 × g i 30 s, och samla varje av supernatanterna in nya 1,5 mL Centrifugera rören. Det bör nu finnas sex tuber per tidpunkt.
Obs: Supernatanten innehåller den periplasmic fraktionen och pelleten innehåller den membranös och cytoplasmiska bråkdel. Vi hänvisar till pelleten som den cytoplasmiska fraktionen. - Mäta radioaktiviteten i respektive fraktion (sex tuber per tidpunkt), liksom i de standarder som avsatts i steg 9,6. Använda mängden radioaktivitet i standarder för att avgöra den totala mängden radioaktivitet ursprungligen till varje prov.
- För att bestämma procentandelen av radioaktivt upptag i periplasm, använda följande ekvation: (genomsnittliga cpm av periplasmic fraktion/genomsnittliga cpm standarder) x 100.
- För att bestämma procentandelen av radioaktivt upptag i cytoplasman, använda följande ekvation: (genomsnittliga cpm av cytoplasmisk bråkdel/Genomsnittligt cpm standarder) x 100.
- Använd följande formel för att fastställa % totalt upptag,: ((genomsnittliga cpm periplasmic bråkdel + genomsnittliga cpm för motsvarande cytoplasmiska fraktionen) / (genomsnittliga cpm standarder)) x 100.
Representative Results
SDS-PAGE gel och gel filtrering kromatogram samlades för att utvärdera kvaliteten på protein rening från förberedande periplasm fraktionering. Rening av holo YfeA har varit tidigare beskrivs16; rening av apo YfeA har dock inte rapporterats. Strategin att rena apo YfeA beskrivs av denna metod använder en rekombinant vildtyps-konstruktion som inte innehåller en affinitet tagg av något slag, särskilt en som kunde användas för protein immunoblot (dvs. hans-tag), och en monoklonal antikropp som känner igen YfeA inte har beskrivits. Masspektrometri analys var därför utnyttjas för att kontrollera rening av YfeA. För att rena YfeA genom fraktionering, är det rekommenderat att använda en linjär eluering övertoning för anjon exchange kromatografi (figur 1). Den linjära eluering lutningen förbättrar avsevärt YfeA berikning från utgör cirka 8% av den periplasm fraktionen till 49% av de anjon exchange-produkten som beräknas av densitometry (figur 1 c). Denna sammansättning är förbättrades till 61% av gelfiltrering och elutionsvolymen av proteinet apo är identisk med elutionsvolymen holo-protein (figur 2). Masspektrometri analys kontrollerar rening av YfeA genom påvisande av 92,5% av YfeA aminosyresekvensen, 246 totala YfeA polypeptid spectra, 24 unika peptider och 50 unika polypeptid spectra. Alternativt, för att kontrast linjär gradient produkten med produkten från ett steg gradient eluering, YfeA renades av anjon exchange med en TVÄTTNINGSSTEGET 50 mm NaCl följt av ett eluering steg 250 mm NaCl (figur 1 d). Steg övertoningen berikar marginellt YfeA från komponera 17% av den periplasm fraktionen till 18% av produktens anjon exchange, beräknad enligt densitometry. Den steg gradient elueringen berikar också ett protein främmande band att masspektrometri som identifieras som innehållande flera E. coli SBPs med liknande molekylvikt. På grund av upplösning satta till HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, likheten i molekylvikt och strukturer av de kontaminerande SBPs, förbättrat gelfiltrering marginellt YfeA anrikning till 20% av produktens gel filtrering. Bör en linjär eluering lutning vara ouppnåelig för anjon utbyte, rekommenderas det att utforska flera steg tvättar i steg om 25-50 mM NaCl att identifiera koncentrationen av NaCl som krävs för att avlägsna dessa föroreningar.
Renat apo och holo YfeA kristallisera i samma kristallisering villkor, även om bilder av apo och holo YfeA crystal morfologier visar skillnader i crystal tillväxt mellan apo och holo YfeA stater (figur 3). Utöver masspektrometri verifiering bekräftade röntgendiffraktion insamlade (visas inte) från kristaller odlas från protein renas genom denna metod rening och kristallisation av YfeA. Omfattningen av fack nedsmittning (cytoplasmiska zink återgå apo till holo protein i den periplasm fraktionen) kan bedömas genom att fånga X-ray fluorescens spectra (figur 4). Zink är den primära substrat bunden till rekombinant YfeA16, kan X-ray fluorescens spectra snabbt skilja mellan ett YfeA prov som innehåller en stark zink signal motsvarar holo YfeA (figur 4A), vägledande av gränsöverskridande förorening eller en svag zink signal tyder på apo YfeA och minimal korskontaminering (figur 4B). ICP-MS analys av M9 minimal media bekräftat övergången metall nivåer är i intervallet sub-mikromolära (visas inte); Därför bör detektion av endast minimala mängder övergångsmetaller förväntas efter en framgångsrik fraktionering. Analytiska fraktionering (figur 5) kan användas för att mäta radiometal transportpriser och fånga funktionella data. En 60 minuters ögonblicksbild jämföra periplasmic och cytoplasmiska fraktioner av E. coli -celler som uttrycker YfeA bara, full YfeABCDE transportören och ingen av de YfeABCDE komponenterna avslöjar konsekvenserna av att uttrycka en enda rekombinant protein eller proteinkomplex på metall upptag (figur 6). E. coli -celler som uttrycker ingen rekombinant protein transporteras cirka hälften av 52Mn tillsätts media till cytoplasman med minimal lojalitet i periplasm. Denna negativa kontrollen representerar endogena mangan transport. E. coli -celler som uttrycker rekombinant YfeA transporteras cirka en fjärdedel av 52Mn läggas till media till cytoplasman med ytterligare en fjärdedel kvar i periplasm. Mangan retention i periplasm och begränsade transport in i cytoplasman visar den metaboliska efterfrågan och flaskhals som införts genom att producera YfeA i avsaknad av Yfe transportören. E. coli -celler som uttrycker rekombinant YfeABCDE transportör transporteras nästan 100% av 52Mn tillsätts media till cytoplasman med minimal lojalitet i periplasm. Förstärkt mangan transport in i cytoplasman illustrerar bidrag Yfe transportören i mangan transport.
Figur 1. Rening av YfeA av fraktionering. A. hypotetisk modell för Yfe transporter. B. SDS-PAGE gel av YfeA rening från periplasm fraktion, med hjälp av linjär gradient eluering från anjon exchange. SDS-PAGE gel visar anrikningen av YfeA (30 kDa) över reningssteg. Svart pil betecknar position elektroforesiska migrationen för YfeA. Molekylvikt standarder visas höger. (1) periplasm fraktion. (2) Q anjon exchange kolumn flödet genom. (3) Q anjon exchange kolumn peak eluering. (4) superdex 200 pg gel filtrering kolumn peak. C. YfeA anrikning – bra exempel. Bildbehandling av SDS-PAGE gel från B beräknar övergripande anrikningen av YfeA av densitometry öka från 8% av den periplasmic fraktionen till 61% av produktens gel filtrering. Blå rutor visar YfeA/total signal används för densitometry beräkningar. Masspektrometri analys av boxed bandet i lane 4 upptäckt 259/280 YfeA aminosyror, presenteras i gröna höjdpunkten. Amino syror som finns i den mogna polypeptiden representeras i balanserade svart fetstil och aminosyror som komponera klyvs signal peptiden representeras i kursiva gemener grå text. D. YfeA anrikning - dåligt exempel. SDS-PAGE gel YfeA rening från periplasm fraktion, med steg gradient eluering från anjon exchange. SDS-PAGE gel visar anrikningen av YfeA över reningssteg. Svart pil anger positionen för elektroforesisk migrering av stora protein föroreningars förbättrad under anjon exchange kromatografi. Molekylvikt standarder visas höger. (1) superdex 200 pg gel filtrering kolumn peak. (2) Q anjon exchange kolumn 250 mM NaCl steg gradient eluering. (3) periplasm fraktion. Bildbehandling av SDS-PAGE gel från D beräknar marginell övergripande anrikningen av YfeA av densitometry till högst 20% av produktens gel filtrering. Blå rutor visar YfeA/total signal används för densitometry beräkningar. Mass spectrometry analys av de av bandet betecknas med svart pil i lane 1 upptäcktes 26 unika peptider av LivJ (39 kDa), 25 unika peptider av EfeO (41 kDa), och 17 unika peptider av LivK (39 kDa). Alla tre föroreningar är periplasmic E. coli SBPs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. APO-YfeA och holo YfeA gel filtrering kromatogrammen. Svart pil betecknar position av ogiltiga volym. Gelfiltrering toppar för apo YfeA (svarta kurvan) och holo YfeA (blå kurva) Visa både protein påstår eluera på samma elutionsvolymen, vilket indikerar att apo YfeA renas från den periplasm fraktionen har en liknande hydrodynamiska radien som holo YfeA renas från totalt cellulära innehåll efter franska tryck.
Figur 3. APO-YfeA och holo YfeA crystal morfologier. Holo YfeA kristalliserar som en monolitisk kristall, medan apo YfeA ger generellt tvilling kristaller i samma kristallisering skick. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. APO-YfeA och holo YfeA X-ray fluorescens spektra. A. X-ray fluorescens spektra av holo YfeA som har renats från M9 minimal media med ingen ytterligare övergång metall tillskott, grön kurva. Karakteristiska toppar är märkta för mangan, järn och zink. B. X-ray fluorescens spectra från YfeA prov producerats inom ramen för YfeBCDE. Karakteristiska toppar är märkta för mangan, järn och zink. Blå kurva. X-ray fluorescens spektra av YfeA renas från ramen för YfeBCDE och framgångsrika fraktionering av den periplasm fraktionen med minimala föroreningar i cytoplasmiska övergångsmetaller eller holo YfeA protein. Röd kurva. X-ray fluorescens spektra av YfeA renas från ramen för YfeBCDE med misslyckade fraktionering från överdriven lysis och betydande förorening av cytoplasmisk övergångsmetaller eller holo YfeA protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Generaliserad arbetsflöde för fraktionering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. 60 min radioaktiv metall upptag fraktionering data. Varje experiment utfördes tre gånger och felstaplar visar standardavvikelsen. Röd stapel. E. coli -celler som inte innehåller Yfe transportören transporterar cirka ~ 50% av 52Mn i cytoplasman efter 60 minuter och bibehålla låga nivåer av periplasmic 52Mn. Blue bar. E. coli celler som innehåller Yfe transportör transport > 90% av 52Mn i cytoplasman efter 60 minuter och bibehålla låga nivåer av periplasmic 52Mn. grön stapel. E. coli -celler som innehåller endast YfeA transport ca ~ 25% av 52Mn i cytoplasman och behålla ~ 25% av 52Mn i periplasm efter 60 minuter.
Den radiometal som används i detta arbete, 52Mn (t1/2 = 5.59 d), producerades i UAB Cyclotron anläggningen (Birmingham, AL) av proton beskjutning på en naturlig Cr-målet, och renas som tidigare rapporterats19. Varning: 52Mn är en positron emitter (β+avg = 242 keV, 29,4%), och också avger flera hög energi gammastrålar med hög intensitet (Eγ = 744.2, 935.5, 1434.0 keV; Jag = 90,0%, 94,5%, 100%). Av dessa skäl måste experimentet utföras enligt principerna för skydd av strålning av ALARA, som beskrivs ovan. Alla poster med beteckningen som radioaktivt avfall bör vara lämpligt innehöll, tydligt märkta och kasseras enligt fastställda förfaranden.
Discussion
Cell fraktionering är ett användbart verktyg för specifikt avsökning av innehållet i ett mobilfack, och kan fungera som ett användbart verktyg för att extrahera små molekyler som metallatomerna, liksom makromolekyler som proteiner. Det är värt att notera att cellen fraktionering är inte en absolut teknik och kan vara felbenägen som utan noggrann uppmärksamhet på blandning/resuspension, inkubation temperatur och inkubationstiden. Ofullständig blandning kan resultera i minimal membranös lysis och därmed försumbar fraktionering, fraktionering vid rumstemperatur kan orsaka snabb lys av båda hinnor kontaminering av den periplasmic fraktionen med cytoplasmiska tillfredsställer, och utökade inkubationstider kan också leda till överdriven lysis och därmed bråkdel kontaminering. En rimlig kompromiss för att uppnå effektiv och relativt komplett yttre membran Lys (samtidigt som det inre membranet) är 20 minuters inkubering över is i hypoton fraktionering bufferten. Ett annat övervägande är metoden för utvinning, där hård extraktion genom skakning eller virvel kan äventyra kvaliteten på extraktet som orsakar protein aggregering. Det rekommenderas att blanda försiktigt såsom av spatel, inversion eller aspirering av pipetten att upprätthålla hög kvalitet material för efterföljande analys. Rening från preparativ cell fraktionering kan uppstå med varierande effektivitet vilket framgår av figur 1. I ett experiment, YfeA började som 8% av det extraherade periplasmic innehållet (figur 1 c), medan i ett annat experiment, YfeA började som 17% av halten periplasmic (figur 1 d). Dessa skillnader kan uppkomma flera skäl såsom variabel uttrycket villkor (lägga till EDTA till tillväxt medier kan öka uttrycket av gener som regleras av svält mekanismer såsom päls reglering av promotorn Yfe), upprepad användning av frysta permanenta bestånd och mänskliga fel. I stället för att justera inkubationstider, rekommenderas det att skala upp preparatet. Rening från den periplasm fraktionen rekommenderas att inkludera en linjär övertoning eluering från anjon exchange kromatografiska steg. Ett steg gradient eluering är en eluering strategi använder diskret och plötsliga förändringar i mobil fas sammansättning (dvs., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, etc.). En linjär övertoning eluering är en eluering strategi som använder gradvis förändring i mobil fas sammansättning (dvs. 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, etc.). En steg-gradient är användbart för att separera molekyler som har olika tillhörighet för den stationära fasen och en linjär övertoning eluering är användbart för att separera molekyler som har liknande tillhörigheter för den stationära fasen. När det gäller renande protein med ingen konstgjord rening tagg (att öka affinitet för den stationära fasen) från en cell kupé som är rik på unik protein arter, rekommenderas en linjär övertoning eluering att separera proteiner av kapitalandelar som kan har liknande tillhörighet till den stationära fasen som protein av intresse. Generellt, en avkastning på 1-2 mg renat apo YfeA förväntas från varje liter kultur uttrycker YfeA från dess endogena Y. pestis arrangören.
X-ray fluorescens är en teknik som gör att utredaren att snabbt avgöra metallinnehållet i ett prov, och informera utredaren om oväntade metall inkorporering som annars skulle vara okänd. Även om EDTA ingår i hyperton fraktionering bufferten att ta bort löst-associerade eller gratis metall, kan YfeA härstammar från den periplasm fraktionen innehålla vissa holo-protein. Med tanke på att metall transport är en dynamisk process, kanske härstammar holo proteinhalten från YfeA som fortfarande inte har donerat sin last till YfeBCDE. Det är värt att notera att X-ray fluorescens endast mäter totala metallinnehållet och anger inte om metall är beställt i ett kristallgitter, eller specifikt bundet till ett protein. För att avgöra om metall är beställt i ett kristallgitter och/eller specifikt bundet till en proteinmolekyl, krävs X-ray scattering datainsamling och bearbetning. Dock möjliggör X-ray fluorescens snabb prov bedömningen av metall förorening eller kvarstående holo protein integration. Synkrotronstrålning tid är begränsad och det finns inte alltid tid att utforma en strategi för X-ray scattering datainsamling på varje prov, således X-ray fluorescens är en värdefull teknik för screening många kristaller och prioritera för vilka prover röntgen scattering data bör samlas in. Dessutom möjliggör X-ray fluorescens datainsamling från prover som inte kan bryta röntgenstrålar. Samtidigt samla X-ray fluorescens data, ibland signalen kan vara mycket svag och de resulterande spektra intetsägande. För att förbättra styrkan på signalen, antingen för X-ray fluorescens eller galna skanning, överväga att öka exponeringstiden och/eller minskar X-ray balk dämpning. När ett prov identifieras för insamling av X-ray scattering data, rekommenderas det att samla X-ray scattering data på en annan del av provet än vad användes för X-ray fluorescens och MAD skanning att minimera strålskador, förbättra kvaliteten på uppgifterna samling, och minimera eventuella minskning av avvikande signal.
Identifiering av radioaktiva spårämnen kräver nanomolar kvantiteter av material eller mindre, och användningen av dessa spårämnen som molekylär spårning agenter ger en enkel och mycket känslig metod för att sondera cellulära processer. Radiometal analysen ovan kan användas för att fastställa totala metall upptag, distribution över cellulära fack, liksom andelen upptag. Faktiskt, varje datapunkt tid kräver en 40 minuters fraktionering; men som varje tidpunkt nås, är celler omedelbart pelleterat och inkuberas i hög salt buffert (figur 5steg 1). Radiometal mätningar av media, kasserade hög salt buffert (figur 5steg 1) och periplasmic och cytoplasmiska fraktioner efter (figur 5steg 3) indikerar hög salt buffert ruvning framgångsrikt tar bort alla återstående oassocierade gratis metall som dröjde kvar efter den inledande centrifugeringen efter att ha nått tidpunkten. Den inledande centrifugeringen tar bort de flesta (upp till 80%) av oassocierade gratis metallen och centrifugeringen efter inkubation i hög salt bufferten tar också bort ytterligare återstående oassocierade gratis metall. Någon kvardröjande oassocierade gratis metall förväntas inte påverka metall transport under den 40 minuter fraktioneringen. Påverkan av 40 minuters fraktionering på intracellulära metall transport är en annan faktor för rationell data tolkning. Praktiskt taget uppstår hela fraktionering protokollet över is, förutom de 30 andra centrifugeringen mellan stegen. Metall transporttiden kurs experiment har visat att upprätthålla celler vid 4 ° C upphäver metall transport20,21,22. Därför, eftersom experimenten sker över is, 40 minuters fraktionering förväntas inte avsevärt öka metall nivåer i periplasm av cytoplasman och metall nivåer förväntas vara representativa tidpunkter där cellerna var initialt centrifugalized.
Bestämning av relativa upptag i olika cellulära fack kan hjälpa informera XFS data, bekräfta fysiologiska beskaffenhet ett substrat samt aktivera utredaren att ytterligare undersöka de molekylära detaljerna för en mekanism. Till exempel tillägg av genetiska mutagenes radiometal upptag experiment ger en direkt metod för att förstärka viktiga funktionella rester eller molekyler inblandade i substrat transport. Fördelarna med radiometal upptag experiment och analyser är snabb vändning, hög genomströmning, hög reproducerbarhet och parallelization experiment jämföra tillväxt villkorar och genetiska konstruktioner.
Disclosures
Författarna förklarar de har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Data samlades också in på GM/CA@APS, som har finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute (ACB-12002) och National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). Denna forskning används resurser av Advanced Photon Source (APS), en US Department of Energy (DOE) Office av vetenskap användaren anläggning drivs för i DOE Office of Science från Argonne National Laboratory under Kontraktsnr DE-AC02-06CH11357. Användningen av Advanced Photon källan stöddes av U. S. Department of Energy, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper, under Kontraktsnr W-31-109-Eng-38.
Vi skulle vilja erkänna den UAB omfattande Cancer Center - Mass Spectrometry/proteomik delade anläggning (P30CA13148-38) för deras hjälp i masspektrometri analys.
C.D.R. stöddes av ett bidrag från University of Alabama Birmingham Office om mångfald, eget kapital och inkludering. L.L.R. stöddes av röntgenavdelningen av University of Alabama i Birmingham. Department of Energy, Office of Science, isotop programmet stöds 52Mn produktion och A.V.F.M. under bevilja DESC0015773.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
| Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
| AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
| Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
| Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
| Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
| GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
| GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |
References
- ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. Structural diversity of ABC transporters. J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).
- Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. A structural classification of substrate-binding proteins. FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).
- Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
- Hoeppner, A., et al. Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them. Advanced Topics on Crystal Growth. , InTech. Rijeka, Croatia. (2013).
- Lee, Y. H., et al. The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation. J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).
- Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA. Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).
- Yatsunyk, L. A., et al. Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli. J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).
- McDevitt, C. A., et al. A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc. PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).
- Couñago, R. M., et al. Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease. Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).
- Abate, F., et al. Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius. Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).
- Ahuja, S., et al. Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment. Structure. 23 (4), 713-723 (2015).
- Alberts, B., et al. Fractionation of Cells. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York, NY. (2002).
- Zhao, H., Martinis, S. A. Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors. Methods. 113, 120-126 (2017).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Radka, C. D., et al. Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).
- Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J Vis Exp. (119), e55153 (2017).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. N. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52. PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).
- Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake. J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).
- Makui, H., et al. Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter. Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).
- Forbes, J. R., Gros, P. Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane. Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).
