Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57177
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry, Charles University

Summary

Çevresel kimyasallar ve ilaçlar enzimatik bioactivated kovalent DNA oluşturma ara ürün için adducts, olmak, potens değerlendirilmesi, kanser ve tedavisi geliştirilmesinde önemli bir alandır. Yöntemleri teknikleri onların algılama ve miktar yanı sıra DNA adducts forma bileşik harekete geçirmek için açıklanmıştır.

Abstract

Kovalent DNA adducts kimyasallar tarafından kurulan veya uyuşturucu kanserojen etki gücü ile kanserojen işlemleri başlatma aşamasında en önemli faktörlerden biri değerlendirilecektir. Tumorigenesis nedeni olarak kabul edilir, bu kovalent bağlama şimdi kimyasal karsinojenezis merkezi bir dogma olarak değerlendirilir. Burada, sitokrom P450 tarafından katalize reaksiyonlar istihdam yöntemleri açıklanmıştır ve ek Biyotransformasyon enzimler kimyasal madde veya ilaç metabolitleri bu DNA şekillendirme için onların harekete geçirmek için potens araştırmak için adducts. Hücresel kesirler Biyotransformasyon enzimler (mikrozomal ve sitozolik örnekleri ile cytochromes P450 ya da diğer Biyotransformasyon enzimler, Yani, peroxidases, NADPH: sitokrom P450 sahip yalıtım açıklayan yordamlar sunulmaktadır oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase veya ksantin oksidaz). Ayrıca, yöntem açıklanmıştır kullanılabilir analiz kimyasallar metabolik aktivasyonu için bu enzimler DNA izolasyonu için hem de. Ayrıca, algılama ve kimya/ilaç-elde edilen DNA miktarının yeteneğine uygun yöntemleri adducts, Yani, 32P postlabeling tekniğinin farklı değişiklikler ve radyoaktif etiketli istihdam kimyasal analiz, vardır ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

Introduction

Xenobiotics (çevresel kimyasallar veya ilaçlar) metabolizma iki aşama1' oluşur. Evre ı ve II amacı başlangıçta hidrofobik (suda çözünen) bileşikleri daha hidrofilik işlemek için (suda çözünen), böylece bunları kolayca yolu ile idrar, dışkı ya da ter excretable yapma. Aşama ı (functionalization) reaksiyonları içerir oksidasyon, Redüksiyon, ve prokollajen katalize enzimler tarafından sitokrom P450s gibi (P450s, CYPs), peroxidases (i.e., Siklooksijenaz, COX), aldo-keto redüktaz (AKRs) ve mikrozomal monooxygenases (FMOs) flavin içeren. Ayrıca çeşitli redüktaz Yani, mikrozomal NADPH: sitokrom P450 redüktaz (POR) ve sitozolik NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), ksantin oksidaz (XO) ve aldehit oksidaz (AO)1 tarafından aracılı indirgeme reaksiyonu içerir faz . İkinci aşama (fiil), aşamasında bağlanmıştır Fonksiyonel grupların ben polarizasyonu daha da artırmak için küçük polar moleküller eşlenik için kullanılır. Faz II dahil sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT), methyltransferases Katekol -O- Metiltransferaz (COMT), glutatyon Sgibi tepki katılmak için kabul enzim örnekleri- Transferazlar (GSTs) ve üridin nükleotittir glucuronosyltransferases (UGTs)1. Enzimler aşamasında sınıflandırılması ı ya da II olduğunu, ancak, değil katı ve bazı enzimler tartışmasız her iki kategoride gruplandırılabilir.

P450 enzimleri (AK 1.14.14.1) proteinler mevcut birçok kimyasallar, onların dönüşüm3,4katalizlerler Biyotransformasyon katılmak çeşitli organizmalarda içeren heme vardır. Oksijen ikinci atom formu su ile iki elektron [denklemi (1 gerektirir tepki azalır iken nerede dioxygen bir atom xenobiotics, molekül giriliyor bir tepki ile birçok yüzeylerde prokollajen P450 enzimleri katalizler )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

Memeli hücreleri (mikrozomal P450 sistemleri) endoplazmik retikulum membran lokalize P450 enzimleri daha fazla NADPH: sitokrom P450 redüktaz (POR) ve sitokrom b5 içeren multienzyme monooxygenase sistem üyesi olan , NADH: sitokrom b5 alfa redüktaz enzim substrat olarak adlandırdığı. Genel kabul gören bir teori çelişkisiz P450 için gerekli iki elektron verici NADPH/POR sistemidir. Yine de, sitokrom b5 elektron bir donör P450 için yani olarak ikinci azalma, tepki döngüsü sırasında P450 azaltarak elektron bir donör NADH: sitokrom b5 ile birlikte hareket nereye hareket redüktaz2,3,4.

Memeliler çeşitli P450 enzimleri kullanmak (Örneğin, aileler 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 ve 27 enzimler) gibi steroid, değerli endojen bileşiklerin sentezi için ve doğal ürünler2,3 katabolizma için kullanabilirsiniz . Diğer CYP memeli enzimler, gibi insan CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 ve 3A4, metabolize eksojen kimyasallar, ilaç olarak kullanılır. 5 , 6 ilaçların metabolizması katalizlerler en önemli 3A alt familya, özellikle CYP3A4 CYPs enzimlerdir. Xenobiotics pro-kanserojen ve pro-toxicants, gibi dönüşümleri insan CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 ve 3A42,5tarafından aracılık. Bu CYPs çoğu karaciğer (hariç, CYP1A1 ve 1B1) mevcut. Yine de, CYPs de birkaç extrahepatic organlarda ifade edilir. Böyle P450s büyük önemi, ağırlıklı olarak olabilir katıldığınız zaman onlar bioactivation kimyasallar (ilaçlar) metabolizmasında bu organları7reaktif ara ürün için. Bu durumda mutlaka olmamasına rağmen çeşitli P450s onların yüzeylerde vardır çeşitli bileşikler tarafından indüklenir.

Birçok P450 enzimleri kimyasal (ilaç) toksisite bir rol oynamaktadır. Onlar sadece onların detoksifikasyon metabolitleri xenobiotics dönüştürmek ama aynı zamanda onları Ayrıca genellikle onların toksisite neden farklı biyolojik özellikleri sergilemek endojen oluştururlar değiştirmek reaktif türler için harekete geçirmek. DNA, yağlar ve proteinler onların değişikliğe göre reaktif electrophiles ve aktif kimyasallardan üretilen radikaller için hedef olabilir. DNA söz konusu olduğunda, birkaç önemli gen yanıt ve mekanizmaları çözme zaten bilinen2,3,4,5.

Değişiklikler DNA hücre büyüme denetim azalmasına neden olabilir ve bu fenomen kanserojen süreçleri gelişimine lider baskın faktör olarak kabul edilir. Kimyasallar ile kovalent DNA nesil adducts kanserojen etki gücüne sahip kanserojen başlatma aşamasında en önemli adımlardan biri8,9,10,11işler gibi karar. Bu gösterilmiştir DNA oluşumu arasındaki ilişkileri adducts ve tumorigenesis oluşan, DNA miktarında azalma adducts ise chemoprevention8,9,10için, sorumludur 11 , 12 , 13 , 14. kanserojen/uyuşturucu-türetilmiş oluşumu DNA adducts DNA bireysel üsleri üzerinde bağlıdır ve bu üslerin DNA dizileri tarafından etkilenir. DNA onarım adducts kendi konumunda (kopya etmek veya sigara transkripsiyonu DNA dizisi) ve değiştirilmiş nükleotit dizileri8,11,12,15, türleri üzerinde bağlıdır 16.

Bu makalede, biz DNA değiştirilmiş metabolitleri aktif olması için onların potens araştırmak için (ilaçlar) kimyasal enzim katalize dönüştürme kullanan yordamlarda açıklanır (DNA üreten adducts). Kovalent DNA bağlama için genellikle test bileşik olmalıdır bağlı olarak bireysel uyuşturucu oksidatif veya indirgeyici reaksiyonlar tarafından aktive. Oksidatif veya indirgeyici harekete geçirmek test edilmiş kimyasal bir P450 bağımlı enzim sistemi mikrozomal hücre altı kesir mevcut tarafından aracılık ettiği ya da azaltma redüktaz ile tarafından microsomes (POR, NADH: sitokrom b5 hem de mevcut redüktaz, P450 enzimleri) ve hücresel sitozolik hücre altı fraksiyonları (NQO1, XO, AO, peroksidaz). Reaktif metabolitleri bundan sonra bağlamak DNA'yı oluşturan DNA adducts. İndirgeyici ve oksidatif reaksiyonlar Bu reaktif tür çeşitli ilaçlara etkinleştirmek önemli olduğundan, yükseltgeme-indirgeme enzimatik sistemi istihdam deneysel yordamlar açıklanmıştır. Ayrıca, adducts algılama ve bu DNA miktarının yeteneğine uygun yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Test kimyasal enzim sistemleri tarafından aktif olup olmadığını belirlemek için iki bağımsız yordam DNA'ya bağlı tavsiye edilir: 32P postlabeling tekniği ve radyoaktif etiketli kullanarak bileşik (e.g., 3H ya da 14 C). İlk pilot, 32P postlabeling tahlil eleme önerilir. DNA içeriği tam olarak değerlendirilir, çözümlerinde belirlenmesi her iki yöntem önce gelmesi gerekir.

Radyoaktif olmayan kimyasallar (kanserojen/ilaç) 3´-phosphodeoxynucleosides, 5´-radyoaktif fosfor (32P) ile ek fosforilasyon tarafından değiştirilmiş DNA'ın enzimatik hidroliz 32P postlabeling tekniği kullanır OH pozisyon ve kimyasal-deoxynucleotide ayrılması adducts normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides Kromatografi17 tarafından (şekil 1). Kimyasal bileşik tarafından değiştirilmiş DNA tarafından endonükleaz, micrococcal nükleaz ve dalak fosfodiesteraz bilinen eksonükleaz aktivitesi, hidrolize. Hem normal (değiştirilmemiş) içeren ve 3´-monophosphates [γ -32P] ATP pH 9,5 formu 5´- için taşıyıcı (radyoaktif olmayan) ATP ve T4-polinükleotit kinaz huzurunda ile tepki deoxyribonucleoside değiştiren hidrolize DNA karışımı 32P etiketli 3´, 5´-bisphosphates ( şekil 1' deki "Standart" bir prosedür). Kullanılan alkali pH deoxyribonucleoside 3´-monophosphates konumu 3´, dephosphorylate T4-polinükleotit kinaz enzim aktivitesinin en aza indirerek yeteneğine sahiptir. Ayrılık ve çözünürlük 32P olarak etiketlenmiş üzerinden adducts kimyasallar tarafından değiştirilmiyor etiketli deoxynucleotides gerçekleştirilir tarafından çok yönlü anyon-Satım ince tabaka Kromatografi (TLC) polyethyleneimine (PEI) Selüloz (Resim 2 ). (Yönde, D1 ve D2) birinci ve ikinci elüsyon adım etiketli normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides yanı sıra [32P] fosfat başlar, elektrolit kısa bir parçası üzerine su çözümleri kullanarak TLC-PEI-selüloz plaka eluted Kromatografik kağıt hidrofobik özellikleri (kanserojen/uyuşturucu-adducts) sergilenmesi ilişkili kimyasallar içeren deoxynucleotides Ayrıca çözülmesi için PEI-selüloz plaka başlangıcında korunur, ancak TLC plaka üstüne uygulanan birkaç farklı solvent sistemleri ile D3 ve D4 yönde (Şekil 2). Yerelleştirme adducts gelişmiş ekran autoradiography; kullanılarak yapılır ayrılmış adducts röntgen filmleri karanlık tanınabilir noktalar olarak algılanır. Noktalar alanlarında plaka eksize ve radyoaktivite ölçmek için sıvı mercek veya sayma Cerenkov tarafından kullanılır. Harita ve DNA ölçmek için adapte edilmiş yöntemi Imaging bir depolama fosfor tespit chromatograms adducts tarafından 32P postlabeling tahlil şimdi de kullanılır. 18 anlık görüntüleyici makine sık sık böyle algılaması için kullanılmaktadır ve miktar DNA'ın adducts. Bu yöntem daha autoradiography19ekran tekniği gelişmiş 32P algılamak için daha--dan 10 - kat daha yüksek hassasiyet sağlar.

DNA miktarda adducts göreli değerleri denklem (2) aşağıdaki gibi kullanarak hesaplanan (RAL), etiketleme adduct gibi belirlenir:

BGBM. Buna deoxynucleotides Sigara
RAL =---(2)
32P-ATP belirli aktivite (BGBM. / pmol) x pmol deoxynucleotides

RALs adducted deoxynucleotides sayısı oranları oranı toplam [adducted ve normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides] saymak oranları değerleri deoxynucleotides20,21. Ancak, bu hesaplama eşittir üzerinde temel verimliliği etiketleme adducts ve normal deoxynucleotides22. Çeşitli DNA adducts için klasik ("Standart") 32P postlabeling tekniği uygun bir uygulamadır (hantal ve/veya hantal adducts), ancak, hassasiyeti tatmin edici değil algılamak için düşük miktarlarda bulunan DNA adducts. Bu yordamı kullanarak, bir adduct 10 değiştirilmemiş7 deoxynucleotides DNA (0.3 fmol adduct/µg DNA) içinde tespit miktarıdır.

Bu klasik 32P postlabeling yordam değişiklikleri çeşitli teknik duyarlılığını yükseltmek için kullanılan. En çok 10-100 kat daha yüksek hassasiyet belirlenmesi, adducts 32P etiketleme elde etti [γ -32P] ATP (yoğunlaşması yordam) sınırlayıcı Düzeyler'i kullanarak. 23 , 24 32P postlabeling yöntemi duyarlılık artışı sindirilir DNA içeren bir kuluçka kullanır sağlayan başka bir yordam nükleaz P1 (dan Penicillium citrinum)21 (şekil 1) ile adducts. Deoxynucleotides ile ilişkili kimyasallar (adducted nukleotid) aslında değil yüzeylerde Bu enzim ise bu enzim değiştirilmemiş deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate tercih ediyor. Bu nedenle, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (örneğin, deoxyribonucleosides) T4-polinükleotit kinaz tarafından [32P] fosfat γ -32P tarafından fosforile değil] ATP. Ancak, bazı kimyasallar nerede nükleotit (adducted deoxynucleotides) bağlı, arylamine adducts gibi deoxyguanosine, can bedephosphorylated Bu enzim tarafından C8, yerine. Buna ek olarak, çoğu diğer adducts (örneğin, adducts N2 deoxyguanosine yerine) nükleaz P1 tarafından dephosphorylated değil. Bu değişiklik 32P postlabeling bu yöntem çok daha hassas, duyarlı üçten fazla büyüklük artan getirir. Ayrıca, 32P postlabeling bu sürümü için bir yöntem sağlar nerede daha yüksek miktarda DNA (5-10 µg) ve taşıyıcı-Alerjik bir fazlalığı [γ - 32P] ATP kullanılan.

Zenginleştirmek için başka bir yöntem adducts, Gupta25tarafından açıklanan, fizikokimyasal kullanır özelliklerinin hantal deoxynucleotide adducts, hangi-ebilmek var olmak hulâsa n-butanol faz transfer Ajan tetrabutylammonium varlığında değiştirilmemiş deoxynucleotides kötü bu organik çözücü tarafından ayıklanır ise [32P] fosfat, etiketleme önce klorür (TBA) (şekil 1). Ancak, daha az hidrofobik adducts, oluşan deoxynucleotides örneği ile aromatik olmayan hantal moieties ya da küçük alkil artıkları, değişiklik için değil etkili çıkarılan nile-butanol. Bu nedenle, onlar ne zaman 32P postlabeling yöntemi bu değişikliğe göre analiz edilir aslında belirlenemeyen vardır.

Hem daha önce bahsedilen sürümleri 32P postlabeling artış duyarlılık ve miktar DNA'ın adducts son derece (üç büyüklük kadar), 109,10 başına normal sigara bir tespit edememek nükleotit (0.3 - 3 Ekrem/µg DNA). Bu iki yöntem kimyasallar kovalent DNA'yı bağlamak onların verimlilik için test etmek için tavsiye edilir ve bu nedenle, bu iş ayrıntılarda açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri için bakım ve kullanım, laboratuvar Helsinki Bildirgesi ile uyumlu olan hayvanlar (311/1997, Tarım Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti), düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. yalıtım hepatik mikrozomal ve sitozolik kesirler

  1. Karaciğer hücre altı fraksiyonları (P450 enzimleri veya cytosols redüktaz veya çözünür peroxidases zengin zengin microsomes) sıçanlarından emir basit fark Santrifüjü (105.000 x g) hazırlayın.
    Not: Pelet ve süpernatant microsomes ve cytosols, anılan sıraya göre alınır.
    1. Karaciğer örnekleri (1-10 g) iki kez ile 50 mM Tris-HCl tampon, pH 7.4 150 mM KCl arabellek (tampon 1) içeren yıkama (ağırlık dokusunun, Yani 10 kat daha yüksek birimleri 10-100 mL) ve küçük parçalara dokular (, 2 x 2 mm boyut çevresinde).
    2. Bu arabellek huzurunda doku homojenize (> 3 birim/ağırlık mL/g) homogenizer 5 dk ve atma için 4 ° C'de içinde filtrasyon kullanarak doku sigara homojenize arta kalan parçaları kağıt filtre. Homogenate vasıl 600 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant başka bir Santrifüjü tüp için transfer.
    3. Pelet tampon 1 (1 g doku başına 1 mL) yeniden homojenize, tekrar adım 1.1.3. ve Pelet atın. 15.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de havuza alınan supernatants santrifüj kapasitesi Süpernatant başka bir Santrifüjü tüp aktarın.
    4. Süpernatant 105.000 x g 4 ° C'de 60 dk için de santrifüj kapasitesi Süpernatant (sitozol) toplamak ve aliquots (1-10 mL)-80 ° C'de depolayın Sitozol Bradford26tarafından açıklanan yöntemi kullanarak protein miktarı için karakterize.
    5. Pelet 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.4 yeniden askıya alma (> 2 birim/ağırlık mL/g), 4 ° C'de 60 dk için 105.000 x g , santrifüj Süpernatant atmak. Pelet (microsomes) 50 mM Tris-HCl tampon, pH 7.4 150 mM KCl ve % 20 gliserol içeren yeniden homojenize (< 5 birim/ağırlık mL/g) homogenizer 4 ° C'de içinde Microsomes 0.5 - 1 mL aliquots-80 ° C'de depolayın Microsomes proteinlerin Bradford26tarafından açıklanan yöntemi kullanarak içerik için karakterize.
    6. Sitokrom P450 microsomes konsantrasyonu belirlemek.
      Not: Karbon monoksit (CO) ile azaltılmış P450 kompleksinin emilimini belirleme Omura ve Sato27tarafından açıklandığı gibi P450 enzimleri microsomes içinde konsantrasyonu ölçülür. Karbon monoksit toksik bir bileşik ve özenle ve bir başlık içinde ele alınması gerekiyor.

2. incubations DNA huzurunda enzimatik sistemleri ile Test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar)

  1. Kuluçka cytochromes P450 içeren oksidatif enzimatik sistemleri varlığında test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar) DNA
    1. Kuluçka karışımlar içeren, son hacmi 4 ° C'de 0.75 mL, aşağıdaki bileşikler ve enzimatik sistemleri hazırlayın.
      1. Mix 100 mM fosfat tampon, pH 7.4, (0.375 mL) 10 mM NADPH veya NADPH üretme sistemi (10 mM MgCl2, 10 mM D-glukoz 6-fosfat, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glikoz 6 fosfat dehidrogenaz) ile (75 µL).
      2. Bu karışımı microsomes ekleme veya böcek hücreleri izole microsomes olan Supersomes, saf rekombinant P450 cDNA rekombinant P450 enzimleri, 50 pmol P450 enzimleri 50 µL mikrozomal veya supersomal içeren bir baculovirus yapısı ile transfected hazırlıklar - hepatik mikrozomal kesirler Laboratuvarı veya ticari bir kaynaktan gelen izole.
      3. 1 mg buzağı timus DNA (0.3 mL stok çözeltisi - 3.3 mg/mL distile su içinde) ekleyin ve 5 için bir girdap shaker sallamayın s.
      4. Son olarak, 7.5 ekleyin µL 0,1 mM test ellipticine uyuşturucu çözünmüş DMSO ve 42,5 µL distile su 0.75 mL karışımı kuluçka hacmi ulaşmak için. Kullanım kimyasallar 3ile H etiketli veya 14C ya da etiketsiz kimyasallar, DNA tespiti için prosedür bağlı olarak adducts.
      5. Bir girdap üzerinde açılmış tüpler için 30-60 dk 37 ° C'de 5 s. Incubate için sallayıcı.
      6. Ayrıca iki denetim incubations benzer şekilde, (i) ama aktive sistemi (mikrozomal örnekleri) bulunmayan veya (ii) ile bu ama bileşik testi yapmadan hazırlayın.
  2. İncubations huzurunda indirgeyici enzimatik sistemleri test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar) DNA
    1. Kuluçka karışımlar içeren, son hacmi 4 ° C'de 0.75 mL, aşağıdaki bileşikler ve enzimatik sistemleri hazırlayın.
      1. 4 ° C'de 100 mM Tris-HCl mix tampon, %0,2 içeren pH 7.4, ara 20, (0.375 mL), kofaktör NQO1 indirgeyici enzim (NADPH) 10 mM çözümü (75 µL), sitozolik kesir (laboratuar veya sitozolik kullanarak söz konusu olduğunda izole hepatik sitozolik kesirler - kesirler) 1 mg protein (50 µL) içeren ticari kaynağından elde bireysel insan bağışçılardan izole.
      2. 1 mg buzağı timus DNA (0.2 mL stok çözeltisi - 3.3 mg/mL distile su) ekleyin ve 5 için bir shaker sallamayın s.
      3. Son olarak, 7.5 (distile su, metanol, etanol veya DMSO, bahçedeki çözünürlük bağlı olarak çözünmüş) µL 0,1 mM test kimyasal ve kuluçka karışımı için 0.75 mL hacmi ulaşmak için 42,5 µL distile su ekleyin. Kullanım kimyasallar 3ile H etiketli veya 14C ya da etiketsiz kimyasallar, DNA tespiti için prosedür bağlı olarak adducts (aşağıya bakın).
      4. 1 dk. kapalı tüpler için 30-60 dk 37 ° C'de 5 s. Incubate için bir shaker üzerinde Shake argonla tepki karışımı temizle.
      5. Ayrıca iki denetim incubations benzer şekilde, (i) ama aktive sistemi (sitozolik kesirler) bulunmayan veya (ii) ile bu ama test kimyasallar olmadan hazırlayın.
  3. Kuluçka karışımları ile test Kimyasalları fazlalığı kaldırmak için organik çözücüler çıkarımı
    1. Tüp Bebek kuluçka karışımı bir kap ile aynı miktarda Etil asetat (veya Dietil eter veya hekzan) bu maddeleri ekleyerek karıştırın. Tüp içeriğini bir emülsiyon formları kadar üzerinde bir sallayıcı.
    2. (3 dk), ortam sıcaklığında bir santrifüj 1.600 x g de spin. Organik ve sulu aşamaları düzgün ayrılmış değilseniz, bir kez daha fazla bir uzun dönem veya daha yüksek bir Santrifüjü hız spin.
    3. Bir pipet ile toplama üst, organik faz kaldırın. Eğer küçük birimler (< 400 µL) olan kullanıldığında, uygun bir ucu ile donatılmış bir otomatik pipet kullanmaktadır. Bu organik faz kenara atıldı.
    4. Adımları 2.3.1 yineleyin., 2.3.2. ve 2.3.3. Azot gazı akışı tarafından kalan organik çözücüler kaldırmak (en az 5-10 dk kaldırma ihtiyaç vardır).
  4. DNA izolasyonu incubations
    1. Fenol/kloroform ile çözümleri ve onun yağış etanol ile DNA'ın çıkarılması
      1. Proteinler DNA kuluçka karışımları ile fenol, fenol/kloroform (1:1), DNA'ın çözümlerinden proteinler ayıklayarak yalıtmak ve aşağıda gösterilen yordam tarafından kloroform için ortadan kaldırmak.
      2. Kuluçka karışımı fenol veya fenol/kloroform (1: bir Şahin 1) veya Eppendorf tüp bir kap ile aynı miktarda ile birleştirir. Karışımı bir emülsiyon formları kadar ilave edin.
      3. (3 dk), ortam sıcaklığında bir santrifüj 1.600 x g de spin. Organik ve sulu aşamaları düzgün ayrılmış değil, bir kez daha daha uzun bir süre ya da daha yüksek bir Santrifüjü hız spin.
      4. Bir pipet ile üst su faz için yeni bir polipropilen boru aktarın. Eğer küçük birimler (< 400 µL) olan kullanıldığında, uygun bir ucu ile donatılmış bir otomatik damlalıklı kullanmaktadır. Protein arabirimi ile birlikte organik faz kaldırın.
      5. Üst su faz fenol ve kloroform (1:1) karışımı aynı miktarı ile birleştirin. Adımlar 2.4.1.2 yeniden. -2.4.1.4.
      6. Üst su faz kloroform ve 2.4.1.2 arasındaki adımları yineleyin aynı miktarı ile birleştirin. -2.4.1.4. 2 cilt soğuk (-20 ° C) etanol ile yağış tarafından DNA'yı kurtarmak. DNA çözüm hacmi belirlemek.
      7. 5 M Sodyum Klorür final ilavesi ile monovalent katyon konsantrasyonu uyum 0.1 M. konsantrasyonları Stir şiddetle. Soğuk (-20 ° C) etanol 2 cilt ile birleştirmek ve düzgün karıştırın. -20° c ila serin
      8. DNA çöktürülmüş kadar-20 ° C'de depolayın. Ne zaman DNA incubations sırasında parçalanmış (örneğin., oksijen radikallerin oluşumunu enzimatik harekete geçirmek reaksiyon sırasında tarafından) veya küçük DNA boyutunu yalıtım yordamına sırasında (< 1 kb) veya DNA ne zaman küçük miktarlarda mevcut (< 0.1 mg / mL), soğutma zaman var olmak artmak zorunda ve sıcaklığı-70 ° C'ye düşmüştür
      9. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Bir kez daha fazla DNA düşük konsantrasyonlarda ya da küçük parçalar şeklinde varsa, daha uzun süre (30 dk) spin. Süpernatant atmak.
      10. Hangi zarlarını DNA'mevcut olabilecek herhangi bir solutes (veya kimyasal test kalıntı izleri) kaldırmak için DNA'sı % 70 etanol ve Dietil eter ile yıkayın. Yıkama çöktürülmüş DNA soğuk (-20 ° C) ile % 70 etanol. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.
      11. 2.4.1.10 adımı yineleyin. Yıkama çöktürülmüş DNA soğuk (-20 ° C) ile % 70 etanol. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.
      12. 2.4.1.10 adımı yineleyin. Tüp emici kağıt üzerine kalan süpernatant kaldırmak için bir dikey durumuna geçirin. DNA Pelet 1 mL Dietil eter izole DNA kimyasal testi potansiyel artıkları atmak için ekleyerek yıkayın. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.
      13. DNA Pelet uygun birimindeki dağıtılması (0,5 - bir DNA konsantrasyon elde etmek için genellikle 100-400 µL içinde 1 µg/µL) distile su (veya 0.15 mM sodyum sitrat ve 1.5 mM Sodyum Klorür). DNA çözüm 4 ° C'de gecede durabilir veya 37 ° c DNA eriterek artırmak 10-30 dakika ısıtılır.
      14. Önce Muhafazası, buz gibi ve bir düşüş sonucu konsantrasyonları adduct DNA çözümleri çözme tekrarlanan çünkü küçük aliquots (10-20 µL), DNA ayırın. -80 ° C'de veya soğuk depolar.
        Not: DNA spektrofotometrik tayini: örnek saf ise bir hazırlık DNA miktarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan basit ve doğru yöntemi (Yani, kirletici protein, fenol veya başka önemli miktarda olmadan nükleik asitler), UV DNA radyoterapi miktarın spektrofotometrik ölçüm (bkz: daha önce açıklanan yordamları) bazlar tarafından emilir28.
  5. DNA tespiti için yordamlar oluşumu adduct
    1. 32 P postlabeling tahlil
      Not: DNA hidroliz analizi (2.5.1.) adducts için yanı sıra normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides (2.5.7.) bu aşamada hazırlanan hidrolizat kullanır.
      1. Micrococcal nükleaz (MN) ~ 450 adet (U) bir konsantrasyon, suda çözülür / mL. Karşı distile su diyaliz ve 300 U/mL için ayarlayın. Dalak fosfodiesteraz (SPD) çözüm diyaliz ve 4 U/mL için ayarlayın.
      2. MN ve SPD son konsantrasyonları 150 mU/µL MN ve 2.5 mU/µL SPD (MN/SPD çözüm) karıştırın. 12.5 µg içeren DNA çözüm alın ve bir Buharlaştırıcı kuruluk için buharlaşır. 6.5 µL distile suda çözülür.
      3. 5.0 µL MN/SPD çözüm ekleyin (MN son konsantrasyonu 60 mU/µL, SPD son konsantrasyonu 1 mU/µL) ve 1.0 µL sindirim tampon (sodyum süksinat son konsantrasyonu 20 mM, CaCl2 final konsantrasyon 8 mM). Son birimin karışımı 12.5 µL. olduğunu Mix ve 37 ° C'de reaksiyonlar 3 h için izin
      4. 2.5 µL (başka bir tüp için transfer) daha fazla seyreltme ve değiştirilmemiş deoxynucleotides (2.5.7.) analizi için Kaldır
    2. Nükleaz P1 zenginleştirme yordamı
      1. Hidrolizat için kalan 10.0 µL eklemek 0.65 µL sodyum asetat tampon (son konsantrasyonu, 40 mM), 0.65 µL ZnCl2 çözüm (son konsantrasyonu 0,1 mM), 1,25 µL NP1 çözüm (son konsantrasyonu, 0.385 µg/µL) ve 0,45 µL distile su. Son karışım 13 µL birimdir.
      2. 37 ° C'de 30 dk için tepki karışım izin verin ve Tris çözüm 3 µL eklenmesi ile reaksiyon sonunda.
    3. n-Butanol zenginleştirme yordamı
      1. DNA hidrolizat için kalan 10.0 µL 215 µL 11,6 mM amonyum formiat çözüm, pH 3.5 ve 25 µL 10 mM TBA klorür çözüm ekleyin. 250 µL nile özü-dinç karıştırma tarafından butanol (su ile doymuş). Ayrı katmanlara ve üst nalmak 1.600 x g de (3 dk) spin-butanol katmanı. Bir kez daha 250 µL nile özü-butanol (su ile doymuş), spin, üst nal-butanol katman ve eski özü ile birleştirmek.
      2. 400 µL su ekleyin ( nile doymuş-butanol) bu ayıklamak ve kuvvetle karıştırın. Ayrı katmanlara ve alt sulu katman silmek için spin. 400 µL su kullanarak bu çamaşır yordamı yineleyin ( nile doymuş-butanol). 250 mm Tris-HCl bir çözüm, pH 9,5, 3 µL eklemek için n-butanol katmanı. Nbuharlaşır-butanol bir Evaporatör, ortam sıcaklığında kuruluk için.
      3. Kalıntı 100 µL nçözülür-butanol, kuruluk için yeniden buharlaşır ve kalıntı 16.0 µL suda çözülür.
    4. Etiketlerine göre adducts
      1. (Arabellek etiketleme) bicine tampon çözeltinin 1 µL ve 4,5 µL 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol soğuk ATP ve 10.0 içeren bir karışımı ekleyin U, T4-PNK (T4-phosphonucleotide kinaz) 16.0 µL çözüm için NP1 veya butanol zenginleştirme mix üzerinden. Reaktifleri son konsantrasyonları aşağıda olacak: 20 mM bicine, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 0,5 mM spermidine ve 0.5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP. Toplam karışımı 20 µL birimdir.
      2. Oda sıcaklığında 30 dakika tepki karışım izin verin. Tüm örnek uygulamak (i.e. 20 µL) PEI-selüloz TLC plaka üzerine (2.5.6.).
    5. NP1 veya n etkinliğinin değerlendirilmesi-butanol yordamlar artırılması
      1. Dibinde tüp 50 µL su ile yıkayın. Orada kurmak için 30 s ve spin bir santrifüj 1.600 x g (1 dk) için şiddetle hiç bulaşma kapağı üzerinde karışımıdır. 5 µL PEI-selüloz TLC tabağa (20 x 20 cm) nokta. Bir çözüm 280 mM (NH4)2ile çok kullanarak Kromatograf4 ve 50 mM NaH2PO4, pH 6.8.
    6. Adducted deoxynucleotides ayrılması TLC
      1. Önceden TLC plakaları distile su ile yıkayın. Özellikle ev yapımı tabak için önerilir.
        Not: Bu yıkama Kaplamalar, arka plan, özellikle Çözücü açık yükseltebilir bir renk sarı renk kaldırmak için yapılmalıdır.
      2. Tüm örnek PEI-selüloz TLC plaka üzerine spot ve Kromatografi başlatmak (2.5.4.); Temizlik adducts D1 ve D2 yön (Şekil 2) plaka geliştirme tarafından gerçekleştirilir.
      3. Bir D1 yönde (Şekil 2) plaka geliştirmek. Kullanım 1.7 M sodyum fosfat tampon, DNA adducts emin olmak için pH 6.8, TLC plaka başında kalan. Mahsum, plaka bu tampon kullanarak D2 yönde geliştirmek. Yordamlar için olası arabellekleri hakkında bilgi için bkz: çözümler çeşitli çözümlenmesi için açıklanan adducts20,28.
        Not: Plaka D2 yönde geliştirilmesi atlanabilir.
      4. Kromatografi için yaklaşık 5 dakika içinde iki ardışık banyo sonra plaka deiyonize suyla yıkayın. Bundan sonra tabakları kuru.
      5. Plakayı 3.5 M lityum formiat tampon, pH 3.5 kullanarak D3 ve D4 yönde geliştirmek, D3 yön için 8.5 M üre ve 0,5 M Tris-HCl tampon, pH 8.0, D4 yön (Şekil 2) için 0, 8 M LiCl ve 8.5 M üre içeren. Çözücüler adduct noktalar TLC plaka üzerinde geliştirmek için ayarlanması gerekir. D3 ve D4 gelişmekte olan yordamlar için olası arabellekleri hakkında bilgi için bkz: çözünürlük birkaç tür23,24,25,28adducts için açıklanan çözümler.
      6. D4 yön ve su yıkama kalkınma sonra D4, herhangi bir sorunları önlemek için 1.7 M sodyum fosfat, pH (genellikle D5 yönde gelişme olarak atanmış), 6.0 bir kağıt fitil (12 x 11,5 cm) üst (D4) boyunca levha geliştirmek.
        Not: D5 yön aynı zamanda atlanabilir. Bu durumda, solvent TLC zirvesine ulaşmıştır TLC tankı açın ve kaçmak için 60 dakikaya kadar izin vermek gereklidir. Bu yöntem bir fitil (sık sık D4 herhangi bir sorun silmek için birçok laboratuvarlarda kullanılan yöntemi) ekleyerek daha bile iyidir.
    7. Normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides miktar hidroliz sonra
      1. Hidrolizat bir aliquot seyreltik (--dan 2.5.1. DNA hidroliz açıklayan) distile su ile (i.e., 2.5 µL sindirim karışımı 2.5.1. 250 µL için ayarlanabilir ve bu çözümün 10 µL ayarlanabilir 150 µL).
      2. 5 µL (10 pmol normal deoxynucleotides) bu özünü aliquot al, 2.5 µL 10 mM Tris-HCl tampon, pH 9.0 ve etiket olarak ekleyin 2.5.4. (karışım son hacmi 10 µL is). Oda sıcaklığında 30 dakika tepki olanak sağlar.
      3. 4 µL karışımı aliquot al ve 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 ile 750 µL oranında seyreltin. Mix ve spin kapağı yok kirlenme kurmak için. 5 µL PEI-selüloz TLC tabak içinde geçerli. Yani 280 mM (NH4)2bir çözümde TLC plaka geliştirmek4 ve 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. TLC sonra kurumasını sağlar.
      4. Yaklaşık 45 dakika, dört değiştirilmemiş deoxynucleotide bis-fosfat yerelleştirmek için ortam sıcaklığında gerçekleştirilen autoradiography kullanın. Spot için miktar sıvı mercek veya sayma Cerenkov kesti.
    8. Göreli hesaplanması adduct (RAL) etiketleme
      1. Adduct noktalar sayar ve etiketli değiştirilmemiş (normal) deoxynucleotides aliquot sayar değerlerini belirleyin.
        Not: İkinci eski, RAL değerleri adduct düzeylerinin değerlendirilmesi için değiştirilmemiş (normal) deoxynucleotides sayısı uygulamak için dönüştürme faktörü olan bir rakam daha malzeme daha az 180.000 sayıları belirlenmesi gerekir. DNA RAL adducts yukarıda gösterilen denklem (2) göre hesaplanır.
    9. Bağlama test kanserojen veya uyuşturucu radyoaktif etiketli ilaç kullanarak DNA tespiti
      1. 3H veya 14C radyoaktivite sıvı mercek sayarak kimyasallarla değiştirilmiş DNA değerlendirmesi.
      2. 10-50 µL DNA çözüm mercek şişe bir mercek çözümde 3 mL ekleyin. İyice karıştırın. Mercek sayaç radyoaktivite ölçmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kimyasal maddeler (kanserojen/ilaçlar) potens onların kovalent sonuçlanan ara ürün için metabolize araştırmak için harekete geçirmek enzim katalize (Yani, P450, peroksidaz, redüktaz) kullanımı için burada açıklanan protokolleri kullanarak DNA için bağlama (DNA nesil adducts), antikanser Ajan ellipticine farmakolojik eylem (için bir daha gözden geçirme gördüğünüz gibi29,30,31), (i) bir roman mekanizma gidermek başardık (II etyoloji iki bitki alkaloid aristolochic asit (Aristolochic asit nefropati ve Balkan endemik nefropati) (bir daha gözden geçirme bkz:32,33,34, neden üst ürotelyal yolu kanseri ile ilişkili nephropathies 35,36,37,38,39) ve birçok kanserojenleri gibi bir hava kirletici 3 - carcinogenicity (III) genotoksik mekanizmaları nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45 ve indirgeyici karşılığı, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,47,48 bitki alkaloid aristolochic asit,32,33,34,35,36,37 , 38 , 39 ve bir aromatik Amin o- Anisidin. 49 , 50 , 51 , 52 daha fazla, bu kimyasalların biyolojik etkileri belirleme enzimler açıklanan yöntemleri istihdam belirlenmiştir.

Burada, ellipticine P450s tarafından oksidatif aktivasyonu üzerinde temsilcisi sonuçları ve kovalent nesil içinde kaynaklanan peroxidases DNA ile 3-NBA kovalent DNA değiştiren, gösterilir metabolitleri azaltılması üzerinde adducts.

Bitki alkaloid ellipticine (5,11-Dimetil-6H- pyrido [4,3 üzerinden -b] Karbazol) ve onun türevleri hücre döngüsü tutuklanması ve indüksiyon dahil çeşitli mekanizmalarla DNA zarar veren ilaç olarak hareket antitümör ajanları vardır Apoptozis (için genel bir bakış, bkz:29,30,31). Bu çalışmada açıklanan protokolleri kullanarak, biz antikanser ilaç kovalent DNA oluşturur gösterdi mikrozomal P450s tarafından katalize metabolik bioactivation sonra adducts (şekil 3) ve peroxidases (şekil 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61ve bu bu Ajan kanser hücreleri30karşı güçlü verimliliğini açıkladı. [3H]-radiolabeled ellipticine ve 32P postlabeling tekniği nükleaz P1 sürümü ağırlıklı olarak kullanılan çalışmalar29,30,31',53 ,61. Hücre altı enzim sistemleri, enzim inhibitörleri ve açıklanan protokoller, baskın reaktif türlerin DNA oluşturan oksitleyici ellipticine adducts P450 enzimleri ve yapıları kullanan deneylerde saf enzimler ile karmaşık çalışma kullanarak Bu reaktif türler olduğunu karakterize29,30,31,55. Muayene P450s insan CYP3A4 enzim ellipticine oksidasyon 12-hydroxyellipticine ve 13-hydroxyellipticine, kendiliğinden ellipticine-12-ylium ve ellipticine-13-ylium çürüten ellipticine metabolitleri en verimli DNA (şekil 5) bağlama. 55 , 61 CYP enzimler Ayrıca bir detoksifikasyon metaboliti, 7-hydroxyellipticine ve ellipticine N2kabul edilir 9-hydroxyellipticine gibi daha da metabolitleri oluşturmak-küçük oluşan oksit ellipticine metabolitleri. 9-hydroxyellipticine yanı sıra 7-hydroxyellipticine ve ellipticine N2-oksit esas olarak kurulan CYP1A1 ve CYP2D6, anılan sıraya göre. 55 , 57 , 58

Peroxidases (Yani, horseradish peroksidaz (HRP), lactoperoxidase (LPO), myeloperoxidase (MPO) ve cyclooxygenases (COX-1 ve COX-2)) aynı oluşturmak için ellipticine metabolize ellipticine elde edilen DNA adducts (şekil 4)61 şekil 5' te gösterilen mekanizmaları.

Nitroaromatic 3-NBA (3-nitro-7H-benzdeanthracen-7-one) Dizel egzoz bir bileşenidir ve hava parçacıkları62,63,64' de bulunur. Bu kirletici, 3-ABA,64,65 büyük metaboliti Dizel emisyon uzun süre63sinin tuz madenleri, işçilerin idrarda tespit edilmiştir. Bu bulgu bu işçiler 3-NBA sinin gösterdi. Bu nitroaromatic akciğer tümörleri boğaza korumak67sonra fareler neden olur. 3-NBA de bir alkil nanomole başına 6 milyondan daha fazla revertants bu zorlanma62' üreten Ames Salmonella typhimurium test (içinde nitroreductase ve Ooverexpressing gerilme YG1024 - asetiltransferaz), görevi görür. Onun genotoksik kudret Ayrıca DNA içinde vitro, ile bu iş ve in vivo kemirgen hayvan (şekil 6 çeşitli organlarında açıklanan protokolleri kullanarak çeşitli enzimler tarafından harekete geçirmek sonra kovalent adducts nesil tarafından sunuldu )39,40,41,42,43,44,45,,4647 ,64,67,68.

3-NBA elde edilen DNA adducts 3-NBA harekete geçirmek sitozolik redüktaz (Örneğin, NQO1) ile ölçülen sonra nükleaz P1 ve ntarafından kurulan-butanol zenginleştirme yöntemleri 32P postlabeling yöntemi iletişim kuralları'nda açıklanan Bu çalışmada sundu. Beşe kadar DNA oluşumu adducts sonuçları gösterilir (adduct noktalar Şekil 71-5), ve üç tane 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone olarak karakterize (dA -N6-C2-ABA; Sigara spot 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (dG -N2-C2-ABA; nokta 3 adduct) ve N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-C8 -N-ABA; noktalar adduct 4. ve 5) (Şekil 7 ve şekil 8). 32P postlabeling yöntemi, dG nükleaz P1 sürümü kullanan-C8 -N-ABA (adduct noktalar 4 ve 5) tespit edilemez (Şekil 7 ve şekil 8). Bazı sınırlamalar 32P postlabeling bu sürümünün, yani ortaya bu sonuç alt çizgiler, çoğu adducted deoxynucleotides (varsa) düşük algılama nükleaz P1 tarafından dephosphorylated (Yani, adducts sırasında oluşan oksidasyon arylamines ya da N- hydroxyarylamine-türevleri için aromatik nitroderivatives azalma deoxyguanosine C8 yerine). Çalışma ellipticine ile benzer, kullanan karmaşık çalışma ile hücre altı enzim sistemleri, enzim inhibitörleri, saf enzimler ve DNA adduct standartları bu çalışmada, baskın açıklanan protokoller istihdam deneylerde sitozolik 3-NBA metabolitleri metabolize üreten DNA, yani, 3-NBA (N-OH-ABA), azaltma tarafından kurulan reaktif metaboliti adducts ve üç DNA'ın yapıları adducts azaltma enzimler 3-NBA tarafından üretilen edildi (Şekil 7 ile karakterize ve Şekil 8). Karaciğerde, 3-NBA vitro bioactivation için insan temelde atfedilebilecek olması ve NQO1 sıçan bulundu (Şekil 7), insan N, süreO- acetyltransferases (NAT), NAT2, NAT1, sulfotransferazlar (SULTANAHMET'deki), SULT1A1 ve için bir daha az ölçüde, SULT1A2 faz II 3-NBA42aktive baskın enzimler vardır. Hepatik mikrozomal POR içinde belgili tanımlık harekete geçirmek-3 en iyi41de etkilidir, ancak farelerde, esas olarak bioactivated bu mikrozomal POR42yerine NQO1 3-NBA. 3-NBA carcinogenicity67için hedef doku olan akciğerde azaltmak NQO1 ve XO 3-NBA metabolitleri üreten DNA adducts. Ancak, XO bir küçük 3-NBA aktive enzimi bu organ69olarak hareket gibi görünüyor.

Figure 1
Resim 1: P-postlabeling 32tahlil şeması. 32P postlabeling yöntemi ve gelişmiş, işlemleriyle bireysel adımlar gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: desen DNA adduct elüsyon PEI-selüloz TLC plakaları. DNA'ın çok yönlü Kromatografi PEI-selüloz üzerinde adducts plakaları gösterilir. KÖKENLİ PEI-selüloz TLC plaka üzerinde bir başlangıç konumudur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: 32P postlabeling analizleri DNA'ın adducts ellipticine, NADPH ve fare (A) ve (B) insan hepatik microsomes ile inkübe buzağı timus DNA oluşan, (C) bir denetim örnek microsomes. Adducts 1 ve 2 oklarla atanmış DNA'deoxyguanosine içinde tarafından oluşturulan microsomes ile aktif ellipticine. 32 P-postlabeling (Adım 2.5.2.) yöntemi nükleaz P1 sürümü istihdam gerçekleştirildi Kökenleri alt sol köşe bulunmaktadır (üst ve sağ soldan D4 D3--dan dip). D2 ihmal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: 32ellipticine-aracılı DNA analizlerini P postlabeling adducts. Buzağı timus DNA tepki ellipticine (100 µM) ve horseradish peroksidaz(a)ile oluşan Adducts sığır lactoperoxidase (B), insan myeloperoxidase (C), ovine Siklooksijenaz-1 (D), insan Siklooksijenaz-2 () E) (5 µg peroxidases incubations içinde mevcut), karaciğer DNA ile 40 mg ellipticine kilogram vücut ağırlığı (bw) (F), başı buzağı timus DNA tedavi sıçan tepki ellipticine ve insan CYP3A4 ile gelen (G), ile 13 - hydroxyellipticine()H), ellipticine N2-oksit (Ben) ve 12-hydroxyelipticine (J). Tahlil (Adım 2.5.2.) nükleaz P1 sürümünü kullanarak deneyler yapıldı Kökenleri vardır alt sol köşe (üst ve sağ soldan D4 D3--dan dip). D2 ihmal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: ellipticine peroxidases tarafından oksidasyonunu ve ellipticine metabolitleri ve bu gösterilen CYPs önerdi DNA üretmek için adducts. Parantez içinde bileşikleri yok hala deneylerde kullanılan deneysel koşullar altında tespit ve DNA bağlanma nihai türler olarak öne electrophilic metabolitleri vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: metabolik aktivasyonu ve DNA adduct oluşumu 3-nitrobenzanthrone tarafından. 3-NBA, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, NAD (P) H:quinone oxidoreductase; NAT, N,O- acetyltransferases; BAYİNİZ, sulfotransferazlar; CYP, sitokrom P450; POR, NADPH: sitokrom P450 oxidoreductase; HRP, horseradish peroksidaz; LPO, lactoperoxidase; MPO, myeloperoxidase; COX-1, Siklooksijenaz-1. R = - COCH3 veya -SO3H; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; dG -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; dG-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: 323-NBA elde edilen DNA analizlerini P postlabeling adducts. Nükleaz P1-(kapı aynası sol) ve n-butanol ayıklama sürümleri (doğru panelleri) yöntemi kullanılmıştır. Abir ve Ab, adducts yılında kurulan buzağı timus DNA 3-NBA ile (300 µM) harekete geçirmek ile fare hepatik cytosols sonra tepki gösterdi. Bbir ve Bb, adducts buzağı timus DNA, harekete geçirmek ile insan hepatik sitozol (havuza alınan kesir) sonra 3-NBA ile (300 µM) tepki olarak kurdu. Cbir ve Cb, adducts 3-NBA ile (300 µM) harekete geçirmek ile saf fare hepatik sonra tepki buzağı timus DNA, oluşan NQO1 (0.09 adet). Dbir ve Db, adducts buzağı timus DNA, harekete geçirmek ile insan rekombinant NQO1 sonra 3-NBA ile (30 µM) tepki oluşan (0,06 adet). Ebir ve Eb, adducts yılında kurulan somon testis DNA N-OH-ABA ile tedavi. Fbir ve Fb, adducts yılında kurulan karaciğer DNA'ın vahşi tipi littermates 3-NBA kg c.a. başına 2 mg maruz C57BL/6 arka plan üzerinde Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: 32P postlabeling analizleri 3-NBA elde edilen DNA adduct standartları [dG -N2-C2-ABA (A), dA -N6-C2-ABA (B) ve dG-C8 -N-ABA (C)] (panelleri bir) ve 3-NBA ve bu 3-NBA-DNA yapıları adducts () panelleri b). N-butanol ayıklama yöntemi sürümünü kullanılmıştır (içinde panelleri bir). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji bioactivated kovalent DNA'ın üretimi kaynaklanan metabolik ara ürün için olmak kimyasallar potens eğitim adducts gösterilmiştir. Bu çok önemli bir konudur, çevresel kimyasallar potens veya enzimatik onların harekete geçirmek için kovalent DNA üreten metabolitleri ilaçların değerlendirilmesi adducts çünkü kanser ve tedavisi, geliştirilmesinde önemli bir alandır. DNA'sı değişikliğe göre kanserojen tümör gelişiminin neden kabul şimdi kanserojen tarafından neden karsinojenezis merkezi bir dogma olarak karar verilir. Bu öneri bulgular, olayları gibi çeşitli tarafından onaylandıktan bu: (i) kanserojen özelliklerini çeşitli kanserojen bioactivation DNA; Nükleofilik merkezleri ile tepki metabolitleri için bu bileşiklerin bağlıdır (ii) DNA düzeyde adducts sık sık karşılık gelen çok sayıda kanserojen yanıt; (III) ve bazı Tümör baskılayıcı genler ve birkaç proto-oncogenes aktivasyonu mutasyon kimyasallar kanserojen potenslerine ile onların değişikliği neden olabilir. Ayrıca, DNA kovalent değişikliğe göre antikanser ilaçlar da bunların kullanımı kanser tedavisinde en etkili DNA-zarar etkileri bu ilaçların biri olarak gösterilmiştir.

Özellikle kimyasallar için genotoksik özellikleri, kovalent DNA oluşturmak için onların potenslerine adducts, Yani başarılı değerlendirilmesi belirleyen iki kritik noktaları vardır: (i) bulmak için gidermek ve enzimatik verimliliğini karakterize sistemleri kanserojen/Nükleofilik merkezleri (II) geliştirmek ve hangi tarafından kanserojen/uyuşturucu-DNA adducts en uygun teknikleri kullanmak ve DNA bulundu ve yapısal olarak karakterize electrophilic tür bağlama ilaçlara aktive yeteneğine sahip. Her iki özellik için uygun yöntem bu çalışmada açıklanmıştır.

Yalıtım yordamlar içeren Biyotransformasyon enzimler (P450s ve ek bioactivating enzimler Yani peroxidases veya redüktaz POR, NQO1, XO ve AO sahip mikrozomal veya sitozolik örnekleri), hücresel kesirler için iletişim kuralları bioactivation ilaçların test kanserojen/enzimatik sistemleri (incubations DNA ile) ve kullanımları temsilcisi sonuçları tarafından gösterildiği gibi gösterilir, bu çalışmada gösterildiği genotoksik özellikleri kimyasal maddelerin değerlendirilmesi için uygunluk.

Ayrıca, algılama ve bir miktar için uygun yöntemleri adducts DNA ile iki zenginleştirme versiyonu 32P postlabeling tekniği (nükleaz P1 - ve n -butanol çıkarma yordamları) ve kullanımı gibi radioactively etiketli test bileşikler kanserojen/ilaç xenobiotics genotoxicity değerlendirme çalışmaları için uygun olacak şekilde gösterilmiştir.

Kovalent DNA tayini ile ilgili adducts, sadece bu iki yöntem, aynı zamanda diğer yöntemleri algılama ve ölçüm DNA'ın adducts için uygun kurulan8,70,71,72 edilmiştir ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. 1981 kadar DNA miktar sentetik hazırladık 3H ya da 14C, etiketli kullanılan radyoaktif kimyasallar (kanserojen/ilaçlar), adducts. Tür yöntemler yararlı çalışmalar ile ellipticine için bu çalışmada açıklandığı gibi kullanılmıştır (bkz:53,54). Yine de, türevleri ile yüksek radyoaktivite Onların başarılı kullanım73,80,81için hazırlamak genellikle zordur. Bu nedenle, bu yordamı hala kullanılıyor olsa bile, ne yazık ki vitro deneyler burada açıklanan benzer sınırlıdır. Diğer teknikleri, kütle spektrometresi, elektron sprey iyonlaşma (ESI), matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonlaşma (maldı), hızlandırıcı kütle spektrometresi (AMS), Floresan, immunoassay ve 32 gibi biyolojik yöntemler P postlabeling-bu çalışmanın ayrıntılı olarak açıklanan geliştirilmiştir (gözden geçirme için bkz:8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82).

Bu eser protokolünde açıklanan 32P postlabeling tahlil, hangi sadece uygulanabilirliği vitro deneyler göstermiştir (temsilcisi sonuçları, yani, yeni bileşikler için genotoxicity veya mekanik test görmek) araştırmalar kanserojen/uyuşturucu etkinleştirme, ama daha fazla kullanımları da vardır insan maruz kalma çevre kanserojen değerlendirmek gibi DNA inceleyerek DNA tamiri izleme tümör gelişiminin mekanizmaları üzerinde çalışmalar zarar tarafından endojen bileşikler ve oksidatif reaksiyonlar ve soruşturma yanıtı hasta sitotoksik antikanser ilaçlar72,83.

Bu teknik, ancak, bazı sınırlamalar73değildir. Monodeoxynucleotides kararlı değil, DNA, lezyonlarının güvenilir belirlenemiyor. 32P postlabeling yöntemi DNA'ın yapıları belirleme yeteneğine sahip değildir adduct. Bu nedenle, DNA'ın yapısal karakterizasyon sık adducts bilinen yapıların sentetik standartları ile birlikte onların Kromatografi gösteren dayanır. Nitekim, böyle bir yöntem bu çalışmada (ellipticine, 3-NBA) temsilcisi sonuçlar her iki örnekleri kullanılmıştır.

Sonuç olarak, bu çalışmada gösterildiği protokollerin çevresel kimyasallar potens değerlendirmek için uygun yöntemleri olarak kabul edilebilir veya uyuşturucu enzimatik bioactivated kovalent DNA üreten metabolitleri için olmak adducts, son derece önemli bir işlem için Kanser ve tedavisi geliştirilmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Acknowledgments

Bu çalışmada çek Bilim Vakfı (GACR, grant 17-12816S) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Biyokimya sayı: 133 uyuşturucu kanserojen bioactivation,sitokrom P450 redüktaz DNA Adducts 32P-postlabeling
Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu <em>Vitro</em> ve kararlılıklarını <sup>32</sup>P-postlabeling tarafından Adducts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stiborova, M. Formation of Covalent… More

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter