Summary
Een stroom cytometry gebaseerde cellulaire bindende test wordt beschreven die voornamelijk als een instrument voor screening gebruikt wordt ter identificatie van stoffen die een remmende werking van de binding van een fluorescently geëtiketteerde CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) aan de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).
Abstract
Farmacologische richten van G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) is van groot belang voor de gezondheid van de mens, zoals disfunctionele GPCR-bemiddelde signalering draagt bij aan de progressie van veel ziekten. Het ligand/receptor paar CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) heeft belangrijke klinische belang, bijvoorbeeld als een potentieel doelwit voor de behandeling van kanker en ontstekingsziekten. Kleine moleculen, alsmede therapeutische antilichamen die specifiek gericht CXCR4 en remmen van de receptor functie worden daarom beschouwd als waardevolle farmacologische hulpmiddelen. Hier, wordt een stroom cytometry gebaseerde cellulaire assay waarmee identificatie van verbindingen (bijvoorbeeld kleine moleculen) die CXCL12 binding aan CXCR4 trekt, beschreven. De bepaling is in wezen afhankelijk van de competitie voor receptor bindend tussen een vast bedrag van fluorescently geëtiketteerde CXCL12, de natuurlijke chemokine agonist voor CXCR4 en labelloze verbindingen. Vandaar, is het ongewenst gebruik van radioactief gelabelde sondes vermeden in deze test. Bovendien, worden levende cellen gebruikt als de bron van receptor (CXCR4) in plaats van de voorbereidingen van de celmembraan. Hierdoor is eenvoudig aan te passen van de bepaling naar het formaat van een plaat, dat de doorvoer verhoogt. Deze test is gebleken te zijn een waardevolle generiek geneesmiddel ontdekking assay CXCR4-targeting verbindingen te identificeren. Het protocol kan waarschijnlijk worden aangepast aan andere GPCRs, ten minste als fluorescently geëtiketteerde liganden beschikbaar zijn of kunnen worden gegenereerd. Voorafgaande kennis over de intracellulaire signaalroutes die zijn geïnduceerd na activatie van deze GPCRs, is niet vereist.
Introduction
G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) zijn cel-oppervlakte-eiwitten die kunnen worden geactiveerd door extracellulaire liganden (bijvoorbeeld peptiden, eiwit hormonen, aminen),1waardoor het reguleren van veel fysiologische en ontwikkelingsdoelen verwerkt. Wanneer een agonist haar GPCR bindende zak neemt, de geïnduceerde conformationele verandering in de receptor proteïne bevordert de binding van intracellulaire receptor-associated heterotrimeric G eiwitten, bestaande uit Gα- BBP en Gβγ subeenheden. De latere uitwisseling van GTP BBP over de Gα subeenheid resultaten in de dissociatie van de G eiwit subeenheden (Gα-GTP en Gβγ), dat op zijn beurt, verder stroomafwaarts leiden zal signaling pathways2,3. Wanneer de Gα-GTP wordt gehydrolyseerd, opnieuw vereniging van de G-α- BBP en Gβγ subeenheden zal converteren het G-eiwit terug naar haar rust staat3,4. Verschillende soorten G eiwitten bestaan (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), die zijn gecategoriseerd op basis van volgorde gelijkenis met de Gα subeenheid5. Alle van deze G-proteïnen veroorzaken gedefinieerde intracellulaire signaalroutes die ten grondslag liggen aan de biologische reactie receptor activering. Na receptor activering phosphorylate GPCR kinases (GRKs) de intracellulaire staart van GPCRs, aldus de interactie met β-arrestins te bevorderen. Dit proces leidt tot de beëindiging van de G-proteïne signalering, receptor desensibilisatie en internalisering6. Β-arrestins zijn ook onderdeel van multi moleculaire complexen dat onafhankelijk is van de G-proteïne signalering7trigger signalering cascades.
GPCRs behoren tot de meest gevalideerde moleculaire targets voor therapeutische interventie, zoals gedereguleerde GPCR-bemiddelde signalering, bijvoorbeeld als gevolg van de winst-van-functie mutaties in de receptor gen of een overexpressie van receptor, draagt bij tot de etiologie van veel ziekten bij de mens8. Daarom, GPCRs vormen een van de meest belangrijke klassen van drug targets onderzocht door de farmaceutische industrie8,9,10. Een opmerkelijk voorbeeld van een klinisch relevante GPCR is de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4), die kan worden geactiveerd door een enige natuurlijke ligand, de CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)-11. Als gevolg van zijn gevestigde rol als een belangrijke co receptor voor humaan immunodeficiëntie virus 1 (HIV-1) ingang en infectie in cluster van differentiatie 4 (CD4) positieve T-lymfocyten12, CXCR4 eerst als een antiviraal geneesmiddel doel onderzocht werd. CXCL12-CXCR4 interactie in het beenmerg verder regelt het bewaren en homing van stuurpen en voorlopercellen cellen13. Ook, gezien haar betrokkenheid in de vele aspecten van kanker biologie (bijvoorbeeld tumor overleving van de cel, metastase, tumor-gerelateerde angiogenese)14 en verschillende andere ziekten bij de mens (bijvoorbeeld ontstekingsziekten)15, CXCR4 significant belang verhoogd als een veelbelovende doelwit voor drugontdekking. AMD3100, een klein molecuul dat zich specifiek richt op CXCR4, aanvankelijk als een anti-HIV drug kandidaat-16 werd ontdekt en is nog steeds een van de meest potente CXCR4 antagonisten beschreven tot en met datum17. Zijn ontwikkeling als een antivirale medicijn echter was niet voortgezet18. Dit molecuul wordt momenteel gebruikt als een stamcel mobilisatie agent tijdens de behandeling van multiple myeloom en lymfoom patiënten18. Verschillende andere chemisch ongerelateerde kleine moleculen en biologics die CXCR4 functie met verschillende sterkte remmen zijn beschreven19.
Receptor bindende methoden zijn waardevolle hulpmiddelen in farmacologie, die het mogelijk maken de identificatie van stoffen (bijvoorbeeld kleine moleculen) die rechtstreeks interageren met de GPCR van belang. Om bindende studies, is er geen behoefte aan voorafgaande kennis over de intracellulaire signalering eigenschappen of functionaliteit van een bepaalde GPCR. Hoewel dit kan worden beschouwd als een voordeel, betekent het dat verbindingen voor welke receptor bindend kan worden aangetoond verder worden gekenmerkt moeten door de evaluatie van hun potentiële agonistic of antagonistische activiteit. Deze activiteit kan worden geëvalueerd met behulp van farmacologische of biologische tests aan de GPCR bestudeerde gerelateerde. Afhankelijk van hun activiteit profiel, receptor bindende moleculen kunnen vervolgens potentieel te evolueren om roman loodverbindingen voor onderzoek in de pre-klinische en klinische studies. Moleculen die zich specifiek aan een receptor met hoge affiniteit binden kunnen ook dienen als steigers voor het genereren van therapeutische of diagnostische hulpmiddelen, bijvoorbeeld door hen voor noninvasive in vivo imaging van tumor cellen20, radiolabeling of als potentieel voertuigen voor gerichte levering van therapeutics21. In geval van CXCR4, is in vivo imaging van tumorcellen al aangetoond met behulp van Muismodellen waarin gelabelde CXCR4-targeting moleculen toegestaan de visualisatie van menselijke kanker xenografts20,22,23 .
In dit verslag beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een competitie bindende assay waarmee de identificatie van kleine moleculen en biologics die direct agonist (CXCL12) bindend aan CXCR4 storen. Het fundamentele principe van de test is de concurrentie tussen een vast bedrag van fluorescently geëtiketteerde ligand (CXCL12AF647, Zie tabel van materialen en reagentia) en ongelabelde compounds voor binding aan de receptor eiwitten17, 24. het specifieke fluorescent signaal van gelabelde ligand gebonden aan afzonderlijke cellen uiten CXCR4 wordt vervolgens geanalyseerd door stroom cytometry. Dit fluorescent signaal zal worden verminderd wanneer labelloze kleine moleculen de interactie tussen CXCL12AF647 en CXCR4 verstoren. De bepaling maakt gebruik van niet-gemanipuleerd levende cellen die endogeen CXCR4 uitdrukken (dat wil zeggen, Jurkat cellen). Vandaar, geen voorbereiding celmembraan is vereist, waardoor de assay gemakkelijke, snelle en compatibel met grotere gegevensdoorvoer. Omdat een fluorescently geëtiketteerde ligand wordt gebruikt, de radioactiviteit wordt vermeden.
Want CXCL12 de natuurlijke agonist voor CXCR4 is, zijn klein molecuul verbindingen die met de binding van de CXCL12AF647 in de bepaling interfereren waarschijnlijk om te interageren met de orthosteric receptor bindende site (dat wil zeggen, de bindende site door de natuurlijke bezet agonist). Moleculen die met receptor bandplaatsen topografisch onderscheiden van de orthosteric binding site interageren zou blijven onopgemerkt, als ze niet bindend van CXCL12 beïnvloeden. Bijvoorbeeld, wordt positieve en negatieve allosteric modulatoren, een belangrijke en opkomende categorie van GPCR gericht op moleculen op allosteric bindende sites25, mogelijk niet opgehaald met deze test. Bovendien of de verbindingen met deze bindende bepaling functie als receptorantagonisten of geïdentificeerd als agonisten niet kan worden afgeleid. Onderzoek van de geïdentificeerde verbindingen in extra farmacologische of functionele receptor-gerelateerde tests zal dus worden vereist. Deze testen kunnen bevatten (een combinatie van) cellulaire fluorescentie - of luminescentie gebaseerde tests voor de opsporing van tweede boodschappers (b.v., Ca2 +, cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP)), fenotypische of biologische tests en β-arrestin de testen van de rekrutering, de keuze daarvan hangt af van de specifieke signalering eigenschappen van de GPCR bestudeerde. Vandaar, de concurrerende bindende bepaling hierin voornamelijk beschreven fungeert als een eerste screening test die worden aangevuld met andere cel-gebaseerde testen moet om een diepgaande karakterisering van verbindingen met de receptor bindende potentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. onderhoud van celkweek
Opmerking: Alle stappen beschreven onder 1 en 2 worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire flow kabinet.
- Het groeien van cellen in T75 cultuur kolven op 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
Opmerking: In deze test, Jurkat cellen (dat wil zeggen, menselijke leukemische T-lymfocyten cellen die endogeen express CXCR417) worden gebruikt. Uitdrukking van CXCR4 bij het celoppervlak moet worden geëvalueerd in de gehele cel kweken door middel van cytometry van de stroom. Een beschrijving van de stroom cytometry procedure en reagentia te bepalen receptor expressie niveaus op het celoppervlak is, echter niet binnen de werkingssfeer van dit protocol, maar is beschreven eerder17. - Laat Jurkat cellen groeien in suspensie totdat ze 80-85% confluency. Voordat het passaging van de cellen in een maatkolf van de roman, wil alle reagentia tot kamertemperatuur (RT).
- Voeg 20 mL verse volledige groeimedium (RPMI-1640 medium, 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM glutamine) aan een roman T75 cultuur maatkolf.
- Voeg 5 mL celsuspensie van Jurkat uit de oorspronkelijke T75 kolf (met 25 mL celsuspensie) naar de roman T75 cultuur kolf. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
2. bereiding van CXCL12, Assay Buffer en Jurkat cellen voor de competitie bindend Assay.
- Bereid een stockoplossing van CXCL12AF647 (20 µg/mL; Zie tabel van materialen en reagentia) door de ontbinding van het gelyofiliseerd reagens (opgeslagen bij-80 ° C, in het donker) in ultrazuiver water aangevuld met 0,01% (volume/volume) van Polysorbaat 20. Opslaan Eenpersoonsgebruik aliquots van deze stamoplossing bij-80 ° C, beschermd tegen licht.
- Assay buffer te bereiden door toevoeging van 40 mL HEPES (1 M, 20 mM definitieve concentratie) op 200 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS, 10 x, zonder fenol rood en natriumbicarbonaat, 1 x eindconcentratie). Toevoegen ultrazuiver water tot een eindvolume van 2 L. toevoegen 4 g (gewicht/volume 0,2%) bovien serumalbumine (BSA) te verkrijgen, en los van de BSA via magnetische roeren. Tot slot breng de pH op 7.4 (NaOH hiervoor gebruiken) en filtreer de oplossing door middel van 0,2 µm poriën (Zie tabel van materialen en reagentia) met behulp van een vacuüm variëteit.
Opmerking: Deze buffer test zal worden gebruikt in alle verdere stappen van het protocol. - Tellen van het aantal en de levensvatbaarheid van de cellen. Hiervoor, neemt een monster van de celsuspensie en Verdun het in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Opmerking: We gebruiken routinematig een geautomatiseerde cel levensvatbaarheid analyzer (Zie tabel van materialen en reagentia) geschikt voor het tellen van cel schorsingen in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar. Verdun voor het tellen van de cel, 0,5 mL celsuspensie in 1,5 mL PBS (andere verdunningen, bijvoorbeeld 0,1 mL in 1.9 mL PBS, zijn ook mogelijk). Het gebruik van deze methode, die is gebaseerd op de trypan methode voor de uitsluiting van de blauwe kleurstof, geweest eerder26beschreven. Verschillende andere apparaten zijn commercieel verkrijgbaar voor het tellen van celaantal en levensvatbaarheid die even goed zou moeten werken. - Het gewenste aantal cellen (dat wil zeggen, ~ 24 x 106 cellen uit te voeren van de bepaling met één volledige 96-wells-plaat) verzamelen in een steriele 50 mL-buis door middel van centrifugeren (Zie tabel van materialen en reagentia voor het soort centrifuge gebruikt) bij 400 x g gedurende 5 min op RT.
- Giet voorzichtig af de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet. Toevoegen van verse assay buffer (bijvoorbeeld 20 mL) en resuspendeer de cellen door pipetteren zachtjes op en neer.
- Centrifugeer de cellen opnieuw bij 400 x g gedurende 5 min op RT.
- Giet weer af het supernatant en resuspendeer de pellet cel in verse assay buffer te verkrijgen van een dichtheid van 5 x 106 cellen/mL.
3. concurrentie bindende Assay
Opmerking: De daadwerkelijke mededinging bindende bepaling wordt uitgevoerd bij RT en niet-steriele omstandigheden kan worden uitgevoerd.
- Verdun de verbindingen onderzochte in assay buffer (zie 2.2) te verkrijgen van de gewenste concentratie. Ofwel bereiden een vaste concentratie van compound voor eerste screening (bijvoorbeeld 10 µM eindconcentratie) of, als alternatief, een seriële verdunningsreeks van concentraties voor meer karakterisering van de verbindingen gedetailleerde (bijvoorbeeld een 1/3, 1/4 of 1 / 5 verdunningsreeks basisgewicht van 1 µM, eindconcentratie). Houd in gedachten dat de samengestelde oplossing uiteindelijk 2 x verdund in de analyse worden zal; Daarom bereiden een 2 x geconcentreerde oplossing.
- Breng 100 µL van samengestelde oplossing (2 x geconcentreerd) in een duidelijke 96-Wells ronde bodemplaat (Zie tabel van materialen en reagentia) volgens een vooraf gedefinieerde experimentele lay-out (bijvoorbeeld Figuur 1 c).
Opmerking: In dit stadium, positieve en negatieve controlemonsters zijn opgenomen in de bepaling. In de negatieve controlemonsterwordt 100 µL van assay buffer toegevoegd in plaats van samengestelde aan de putjes van de 96-wells-plaat. Voor de positieve controlemonster, wordt assay buffer ook toegevoegd tijdens deze stap. Zie ook Figuur 1 c voor een typische experimentele lay-out waarin een verdunningsreeks van diverse verbindingen wordt getest. - 50 µL celsuspensie toevoegen (zie 2.7; 0,25 x 106 cellen) uit een reservoir reagens in de 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet. Incubeer de plaat gedurende 15 min. op RT in het donker.
- Voeg 50 µL van fluorescently geëtiketteerde CXCL12 (d.w.z., 100 ng/mL CXCL12AF647 in assay buffer, 4 x geconcentreerd, 25 ng/mL eindconcentratie) uit een soortgelijke reagens reservoir aan de putjes van de 96-wells-plaat. Incubeer gedurende 30 min op RT in het donker.
Opmerking: Voor de negatieve controlemonsters, toevoegen assay buffer in plaats daarvan. Vandaar komt het fluorescent signaal gedetecteerd in de negatieve controlemonsters overeen met de autofluorescent achtergrond signaal (figuur 1A). Voor de positieve controlemonsters, voeg 50 µL per putje van CXCL12AF647. De positieve controlemonsters levert de maximale fluorescentie signaal gedetecteerd, aangezien geen potentiële remming door pre-incubatie met verbindingen werd opgenomen (figuur 1A). - De 96-wells-plaat bij 400 x g gedurende 5 min op RT. Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de Ingehuld cellen door flipping via de plaat centrifugeren. De plaat op een tissue droog.
- 200 µL van verse assay buffer uit een reservoir reagens toevoegen aan de putjes met behulp van een meerkanaalspipet. Onmiddellijk overgaan.
- De plaat weer voor 5 min bij 400 x g bij RT. Verwijder de bovendrijvende vloeistof door flipping via de plaat centrifugeren en weer droog het op weefsel.
- Zachtjes resuspendeer de pellet cel in 200 µL van 1% paraformaldehyde opgelost in PBS. Deze stap zal het bevestigen van de cellen.
- Het vervolg van het protocol onmiddellijk met de kwantificering van de fluorescentie door stroom cytometry.
4. analyse van de monsters door stroom cytometry
CXCL12AF647 gekleurd en gefixeerd cellen zijn nu klaar om te worden geanalyseerd met behulp van stroom cytometry. Verschillende soorten flow cytometers kunnen worden gebruikt, maar ze moeten worden uitgerust met de juiste laser (dat wil zeggen, een rode laser, excitatie bereik ~ 630 nm) voor excitatie en geschikte filters voor de detectie van de fluorophore (emissie filters ~ 660 nm). Zij moeten geschikt voor het verwerken van monsters in de indeling van een 96-wells-plaat. Voorbeelden van geschikte stroom cytometry apparaten worden gegeven in de tabel van materialen en reagentia.
- Start het apparaat en open de bijbehorende software (Zie tabel van materialen en reagentia).
- Selecteer de volgende cellulaire parameters voor worden gevisualiseerd in een dot vlek formaat: scatter (FSC), kant scatter (SSC) en het fluorophore (CXCL12AF647) detectie kanaal toekomen.
Opmerking: Met de parameter FSC cellen worden gediscrimineerd op basis van hun omvang, aangezien de gedetecteerde lichte absorptie evenredig aan de diameter van de cel is. De WS-parameter, meting van de verstrooiing van licht in een hoek van 90°, informatie over de granulariteit van de cellen. - Kies één monster (bijvoorbeeld een negatieve controlemonster) uit te voeren gating een gedefinieerde homogene celpopulatie op basis van de parameters van de FSC en WS.
- Automatische injectie van ~ 100 µL van gefixeerd cellen selecteren door deze negatieve controlemonster in de cytometer van de stroom. Selecteer de optie "mengen", vóór injectie en gebruik een bemonsteringsstroom van 1,5 µL/s.
- In dit voorbeeld uitvoeren door het selecteren van "Ophaal Data." De parameters van het FSC en WS voor dit voorbeeld wordt nu weergegeven op het scherm.
- Selecteer de software gating gereedschap. Op basis van de FSC en SSC dot vlek visualisatie, vooraf definiëren een homogene en levensvatbare celpopulatie gating. Maak een vorm (met behulp van de software gating gereedschap) dat de homogeen verspreid enkele cellen ("events") op basis van deze twee dimensies bevat om dit te doen.
Opmerking: De gating procedure wil definiëren een homogene en levensvatbare celpopulatie die zal worden gebruikt voor verdere analyse. Gating berust op de veronderstelling dat de meerderheid van levensvatbare cellen een homogene celpopulatie op basis van de FSC en SSC parameters zal vormen. Door het uitvoeren van deze stap, kunnen cellulaire puin, dode cellen, en cel aggregaten grotendeels worden uitgesloten van verdere analyse. Een illustratie van het gating proces is gegeven in figuur 1B.
- Selecteer voor het analyseren van 20.000 "gebeurtenissen" (dat wil zeggen, individuele cellen) per monster.
Opmerking: Dit betekent dat voor elk monster, 20.000 cellen die binnen de vooraf gedefinieerde poort vallen uiteindelijk zal worden geanalyseerd. Data-acquisitie voor elk monster wordt voortgezet totdat dit aantal gebeurtenissen is geanalyseerd. - Start de run ("recordgegevens selecteren"). Het apparaat van stroom cytometry zal nu alle monsters één-door-één analyseren door het opnemen van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elk monster. Deze MFI komt overeen met het gemiddelde fluorescent signaal overeenkomt met de 20.000 cellen die binnen de vooraf gedefinieerde poort vallen.
5. de gegevensanalyse
Gebruik de MFI verkregen voor elk monster alle verdere berekeningen uit te voeren. Analyse van de stroom cytometry gegevens kan worden uitgevoerd door verschillende commercieel beschikbare softwarepakketten (Zie tabel van materialen en reagentia).
- Om te bepalen van het percentage remming van het fluorescerende bindende-signaal, als gevolg van samengestelde pre-incubatie, gelden de volgende formule:
Waar:
MFIExp = de MFI van de experimentele (= stof-behandeld) monster
MFIPC de MFI van de positieve controle =
MFINC de MFI van de negatieve controle = - De IC50 om waarde te bepalen van een stof (dat wil zeggen, de concentratie van de stof die de fluorescerende bindende signaal met 50% kan verminderen), gelden de volgende formule:
Waar:
Logconc.2 = het logboek van een concentratie van de stof die in minder dan 50 resulteert % inhibitie van het verschil tussen de waarde van de MFI's van de PC en NC
Logconc.1 = het logboek van een concentratie van de stof die in meer dan 50 resulteert % inhibitie van het verschil tussen de waarde van de MFI's van de PC en NC
Opmerking: Als alternatief, in geval van zeer actieve verbindingen, een dosis-responscurve die betrekking hebben op verschillende logboeken van omvang kan worden gegenereerd op basis van de MFI die overeenkomt met elke geteste concentratie van stof. Door het toepassen van niet-lineaire regressie curve-fitting met behulp van de juiste software (Zie tabel van materialen en reagentia), IC50 waarden kunnen vervolgens worden afgeleid uit de gegenereerde bochten. Een voorbeeld van deze benadering vanuit de analyse is afgebeeld in Figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De algemene workflow van de bindende bepaling is in figuur 1Agepresenteerd. Een illustratie van het soort stroom cytometry gegevens verkregen voor verschillende monster typen in een standaard experiment (dat wil zeggen, negatieve controle, positieve controle en experimentele monster) is afgebeeld in figuur 1B, en een mogelijke plaat lay-out om uit te voeren de bepaling in een 96-wells-plaat-indeling wordt gegeven in Figuur 1 c. Incubatie van Jurkat cellen, die endogeen express de chemokine receptor CXCR4 (dat wil zeggen, de GPCR van belang in deze test), met steeds grotere hoeveelheden fluorescently geëtiketteerde CXCL12 (dat wil zeggen, CXCL12AF647) resulteerde in toegenomen niveaus van fluorescentie (Figuur 2), als gevolg van verhoogde niveaus van ligand binding aan CXCR4. Om aan te tonen de receptor-specificiteit van bindende CXCL12AF647 , werd een gevestigde en receptor-specifieke CXCR4 antagonist (het kleine molecuul AMD3100) gebruikt. Jurkat cellen werden eerst vooraf geïncubeerd met een van 1/5-verdunningsreeks van AMD3100 variërend van 0.064 ng/mL tot 1000 ng/mL, gevolgd door een incubatie met een eindconcentratie van 25 ng/mL CXCL12AF647 (dat wil zeggen, het vaste bedrag van gelabelde chemokine routinematig gebruikt in de test). Jurkat cellen werden vervolgens verder verwerkt, zoals wordt beschreven in het protocol. Het fluorescent signaal (de gemiddelde TL intensiteit, MFI) na toevoeging van het vaste bedrag van CXCL12,AF647 , aan de vooraf bebroede Jurkat cellen, werd verkregen door stroom cytometry analyse voor alle monsters. Dit fluorescent signaal bijna volledig kan worden geremd in het geval dat Jurkat cellen waren vooraf behandeld met de hoogste concentratie van AMD3100 (1000 ng/mL). Onder deze voorwaarde, het geremde niveau van fluorescentie was alleen iets boven het achtergrondniveau overeenkomt met het niveau van autofluorescence voor Jurkat cellen. Kortom, een grote fluorescent signaal venster (als in vergelijking met de negatieve controle) toepassing van 25 ng/mL (eindconcentratie) CXCL12AF647 in de bindende bepaling gegenereerd met een minimale residuele niveau van aspecifieke receptor binden ( Figuur 3A).
Deze bindende bepaling is hoofdzakelijk gebruikt scherm voor verbindingen verstoren de binding van het ligand in panelen van labelloze verbindingen met een enkele vaste concentratie of bestuderen van het effect van de dosis-afhankelijke van actieve verbindingen. In het laatste geval is het doel het verkrijgen van IC50 waarden (dat wil zeggen, de concentratie van de stof die het bindende signaal met 50 remt %), die de bindende kracht van de verbindingen te weerspiegelen. Figuur 3 illustreert hoe stroom cytometry gegevens verkregen met deze bindende bepaling kan worden gebruikt om te bepalen van de remmende potentie (in termen van IC50) van kleine moleculen de binding van CXCL12 aan CXCR4 verstoren. Gebaseerd op de remming van de dosis-afhankelijke CXCL12AF647 binding door de AMD3100, werd de IC50 waarde bepaald hier door toepassing van niet-lineaire regressieanalyse. In dit voorbeeld correspondeert met de berekende waarde van IC50 voor AMD3100 18.12 ng/mL. Omdat bij bevolkingsonderzoek campagnes, de meerderheid van de willekeurig geselecteerde verbindingen naar verwachting zullen niet remmen de binding van CXCL12AF647 tot CXCR4+ Jurkat cellen, een voorbeeld van een inactieve verbinding werd ook opgenomen in deze studie. Hier, werd de kleine molecuul maraviroc, dat krachtige anti-HIV-1 activiteit vertoont door op te treden als een specifieke antagonist voor de CC chemokine receptor 5 (CCR5)27, getest in de bindende bepaling. Geen remming van het signaal maximale fluorescerende bindend werd ontdekt nadat vooraf aan het broeden Jurkat cellen met maravoric, zelfs met de hoogste concentratie teststof (100 ng/mL getest; Figuur 3B). In hetzelfde experiment was een seriële verdunningsreeks van AMD11070, een ander klein molecuul gerelateerde aan AMD3100, maar met verbeterde farmacokinetische eigenschappen28, opgenomen. In tegenstelling tot maraviroc geremd een verdunning van 1/5-serie van AMD11070 variërend van 0.0064 tot 100 ng/mL duidelijk en dosis-dependently CXCL12AF647 bindende (figuur 3B).
Figuur 1: overzicht van de werkstroom en illustratie van het soort gegevens verkregen. (A). de belangrijkste stappen van het protocol zijn geschematiseerde voor de positieve en negatieve controlemonsters, en monsters van stof-behandeld. Monsters zonder samengestelde pre-incubatie en zonder toevoeging van fluorescently geëtiketteerde chemokine (CXCL12AF647) zijn opgenomen om te bepalen van de achtergrond (auto) fluorescentie (negatieve controlemonsters). Monsters zonder samengestelde pre-incubatie, maar met toevoeging van een vast bedrag van CXCL12AF647 worden gebruikt om te bepalen van het maximale bindende signaal in de assay (positieve controlemonsters). Cellen worden in samengestelde behandeld monsters, vooraf geïncubeerd met samengestelde vóór toevoeging van een vast bedrag van CXCL12AF647. (B). het gemiddelde TL bindende signaal wordt bepaald door de stroom cytometry analyse van Jurkat cellen. Van alle evenementen (dat wil zeggen, Jurkat cellen) geanalyseerd (linkerpaneel) wordt alleen het fluorescent signaal van een gated populaties van cellen gebruikt voor verdere analyse (middelste deelvenster). Pre-incubatie van cellen met kleine moleculen (bijvoorbeeld AMD3100) remt de binding van de fluorescently geëtiketteerde receptor-ligand, en dit zal het maximale bindende signaal (juiste paneel, weergegeven in een histogram weergave). (C). een mogelijke plaat lay-out bij het uitvoeren van de concurrerende bindende bepaling in een 96-wells-plaat-indeling. In dit geval zes verschillende verbindingen (cpd 1 - 6) worden getest in een 1/5 seriële verdunningsreeks (in tweevoud) variërend van 1.000 nM tot 0.32 nM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Binden van CXCL12,AF647 , Jurkat cellen. Jurkat cellen werden geïncubeerd met steeds grotere hoeveelheden CXCL12AF647, in afwezigheid van pre-incubatie met stof. De gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI, in willekeurige licht eenheden) ± SD wordt weergegeven (n = 2). Curve-fitting werd uitgevoerd met behulp van niet-lineaire regressie met behulp van een model van de totale één-Sitebinding na de vergelijking
met Bmax (maximale specifieke binding) = 18,345; Kd = 92.8 ng/mL; NS (de helling van niet-specifieke binding) = 2.139; en achtergrond = 332.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Inhibitie van de binding van CXCL12AF647 door actieve en inactieve verbindingen. (A) dosisafhankelijk remming van CXCL12AF647 binding door cellen met toenemende concentraties van AMD3100, vóór toevoeging van 25 ng/mL CXCL12AF647vooraf aan het broeden. Opmerking dat de maximale gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI; in willekeurige licht eenheden) geremd is nog steeds een beetje boven de achtergrond (auto) fluorescentie verkregen voor Jurkat cellen (± SD betekenen (n = 3)). Curve-fitting werd uitgevoerd met behulp van niet-lineaire regressie met een variabele helling (vier parameters) volgens
Hier is de HillSlope 1.313 en de berekende IC50 18.12 ng/mL. (B). dosis-afhankelijk effect van AMD11070 en maraviroc op CXCL12AF647 binding aan CXCR4+ Jurkat cellen (MFI ± SD (n = 3)). Curve passend voor de AMD11070 reactie is ook uitgevoerd met een HillSlope van 1.458 en een berekende waarde IC50 0.9052 ng/ml. Voor de reactie van maraviroc, werd geen montage uitgevoerd gezien het gebrek aan activiteit van dit samengestelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vergeleken met andere soorten bindende analyses (dat wil zeggen, verzadiging bindende en kinetische bindende experimenten), zijn competitie bindende analyses zeer geschikt voor screeningonderzoek. Inderdaad, zij toestaan dat evaluatie van grote hoeveelheden van labelloze verbindingen, bijvoorbeeld kleine molecules, door hun vermogen om te interfereren met de binding van een vast bedrag van een gelabelde receptor-ligand te scoren. Stoffen die zich aan andere receptor sites dan de gelabelde ligand binden kunnen blijven onopgemerkt in de test. Hoewel de competitie bindende experiment hierin richt zich op de chemokine receptor CXCR4 in het bijzonder beschreven, kan het waarschijnlijk dienen als een blauwdruk voor het ontwerp van concurrentie bindende analyses voor andere GPCRs alsook. Bijvoorbeeld, werd de CXC chemokine receptor 7 (CXCR7) beschreven als een alternatieve receptor voor CXCL12, staat van bindende CXCL12 met hoge affiniteit29,30. Vandaar, gebruikt de zelfde gelabelde chemokine (CXCL12AF647) als voor de beschreven CXCR4 competitie bindende bepaling kan worden gebruikt om CXCR7 bindende experimenten opzetten. Omdat CXCR4 en CXCR7 op CXCL12 als een gemeenschappelijke ligand dezelfde, zou het belangrijk zijn om te werken met cellulaire modellen waarin slechts één van beide receptoren wordt uitgedrukt op het celoppervlak, teneinde specifieke receptor binden. Onze vorige werk heeft aangetoond dat Jurkat cellen geen endogene expressie van CXCR717 vertonen. Dus, in de hier beschreven voor CXCR4 assay, interferentie met binding aan CXCR7 is uitgesloten.
Aantal belangrijke functies van de competitie bindende bepaling laat het worden gebruikt als een snel, initiële, screening tool om te identificeren van kleine molecules agonist binden aan CXCR4 verstoren. Een van de belangrijkste voordelen van de bepaling is het gebruik van hele, levende cellen uiten van de receptor van belang. Dit nalaat de noodzaak voor arbeidsintensieve celmembraan preparaten. Het lage niveau van achtergrond (auto) fluorescentie met Jurkat cellen ontdekt is ook gunstig. Samen met het grote signaal venster bij de toevoeging van de omschreven hoeveelheid fluorescently geëtiketteerde sonde verkregen, draagt het bij aan een gunstige signaal achtergrond /. Dit vergemakkelijkt de opsporing van potentiële bindende remming door labelloze verbindingen. In het geval dat deze bindende test wordt uitgevoerd met andere CXCR4 waarin cellen, wordt aangeraden om altijd deze parameters (achtergrond fluorescentie, signaal venster) upfront zoals ze van cellijn aan cellijn afwijken kunnen. Het feit dat Jurkat cellen endogeen CXCR4 een consistent niveau uiten over lange periodes, maakt het een handig cellulaire model. Hetzelfde consistent niveau van receptor expressie kan worden verkregen met stabiel transfected cel klonen. In tegenstelling, raden we het gebruik van Transient transfected cellen omdat dit zal waarschijnlijk resulteren in een veel bredere verdeling van fluorescentie intensiteiten, minder responsief cellen in de bepaling en minder samenhang tussen experimenten. Aangezien geen CXCR4 negatieve Jurkat cellen zijn, werd specificiteit van receptor binden aan deze cellen aangetoond door de pre-incubatie met gevestigde specifieke receptorantagonisten (AMD3100 en AMD11070). Deze antagonisten zijn structureel anders dan de gelabelde ligand. Dit is belangrijk omdat, wanneer u de labelloze variant van het ligand als concurrent, zowel de gelabelde als de labelloze ligand ook voor binding met aspecifieke bandplaatsen potentieel aanwezig op het celoppervlak concurreren misschien.
Behalve de cellulaire host, diverse andere aspecten van de hier beschreven test moeten rekening worden gehouden, voordat u begint met het bouwen van een soortgelijke bepaling voor andere Fluorescently geëtiketteerde sondes die gericht zijn op GPCRs zijn ontwikkeld als alternatief voor GPCRs. radioactieve sondes, maar zijn momenteel alleen beschikbaar voor een beperkt aantal GPCRs en ze zijn relatief duur. Bovendien, de bindende eigenschappen ten opzichte van de labelloze bovenliggende molecule, met name in geval van zeer kleine liganden (bijv . aminen) of kleine peptiden31, kan worden gewijzigd door wijziging van natuurlijke receptor liganden met fluorophores 32. bijvoorbeeld in het geval van kleine liganden, is een linker in het algemeen nodig om te scheiden van de pharmacophore van de fluorophore toegang te verlenen tot de receptor van orthosteric bindende site31. De stabiliteit van de complexe receptor-belichting fluorescerende-sonde moet ook rekening worden gehouden. In onze ervaring, na 90-120 minuten (dat wil zeggen, de tijd die nodig is om uit te voeren van twee opeenvolgende 96-wells-platen), de gemiddelde TL intensiteit voor de positieve controle putten meestal is verminderd door ~ 5% ten opzichte van het gemiddelde van alle putjes van de positieve controle op de plaat, met af en toe uitschieters tussen 5 en 10%.
De intrinsieke activiteit van de gelabelde ligand is ook van belang. Overwegende dat receptorantagonisten geen intrinsieke activiteit op de receptor vertonen, gelabelde agonisten waarschijnlijk induceren receptor activering en gevolg, receptor internalisering. Dit compromissen de omkeerbare aard van de ligand-receptor interactie33. Te minimaliseren mogelijk problemen met de receptor internalisering, incubatie met de gelabelde ligand (in geval van een gelabelde agonist) moeten worden beperkt in de tijd en bij voorkeur moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of lager. Het feit dat de procedure is uitgevoerd bij kamertemperatuur maakt de bepaling ook handig en meer compatibel met screening inspanningen in plaat-indeling. Ten slotte, een voldoende aantal cellen per monster (bijvoorbeeld 250.000 per putje van een 96-wells-plaat) moet worden gebruikt in de test uiteindelijk behouden een voldoende aantal cellen (20.000 cellen, "single events," op basis van het gating de hele celpopulatie; Zie Figuur 1) voor stroom cytometry analyse. Minder cuvetten zou bemoeilijken het consequent bereiken dit aantal geanalyseerde cellen, die de betrouwbaarheid van het lezen uit in gevaar kunnen brengen. Minder cuvetten per monster (per putje) ook het tijdsinterval die nodig is voor het analyseren van het monster door stroom cytometry zou verhogen, en dus verhoogt de totale tijd om te analyseren een hele 96-wells-plaat. Dit compromissen grotere gegevensdoorvoer. Als gevolg van de bovengenoemde reden, toekomstige miniaturisatie van de test daarmee zou kunnen blijken niet te worden een triviale taak.
Tezamen, heeft een competitie bindende bepaling dat voornamelijk in ons lab als een screening tool gebruikt wordt om te identificeren van kleine moleculen die met een vast bedrag van gelabelde CXCL12 voor binding aan CXCR4 concurreren kunnen zijn uitvoerig beschreven. Deze bindende studies zijn van belang omdat ze een relatief snelle en eenvoudige methode om te identificeren verbindingen staat receptor binden. Hoewel de identificatie van stoffen met bindende capaciteit al waardevol op zichzelf is, is dit type van test levert geen informatie over de activiteit van de geïdentificeerde verbindingen. Vandaar, blijft het noodzakelijk om verder te valideren en karakteriseren van hun potentiële agonistic of antagonistische activiteit in andere farmacologische en functionele receptor testen. Van belang, in het geval van CXCR4 is gebleken dat receptorantagonisten die verhoogde activiteit de bindende bepaling (dat wil zeggen, dat lage IC50 waarden gegenereerd vertonen voor bindende remming) relatief presteren beter in andere functionele CXCR4-gerelateerde testen alsmede17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Eric Fonteyn voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de KU Leuven (verlenen neen. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, neen verlenen. G.485.08) en de Fondation chalets Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
References
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
- Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
- Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
- Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
- Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
- Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
- De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
- Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
- Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
- Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
- Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).
