Presenta protocolo una novela en vitro la tira de ensayo más modelos adecuadamente el proceso de en vivo brotación angiogénesis mediante la incorporación de pericitos. Esta modificación permite el ensayo de grano más fielmente recapitular las interacciones celulares heterotípicos entre las células endoteliales y las células murales que son críticas para la angiogénesis.
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Artículo de método
Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo
En este artículo
Resumen
Resumen
Angiogénesis es la formación de nuevos vasos de vasculatura preexistente y es un componente importante de muchos procesos biológicos, incluyendo la embriogénesis y desarrollo, la cicatrización de heridas, crecimiento tumoral y metástasis y enfermedades oculares y cardiovasculares. Se necesitan modelos eficaces en vitro que recapitulan la biología de la angiogénesis adecuadamente este proceso de estudio e identificar mecanismos de regulación que pueden ser objeto en definitiva de nuevas estrategias terapéuticas. El análisis de la angiogénesis de grano ha demostrado previamente para recapitular las etapas múltiples de brotes endoteliales in vitro. Sin embargo, una limitación de este ensayo es una falta de endotelial – interacciones célula mural, que son fundamentales para la regulación molecular y fenotípica de células endoteliales función en vivo. El protocolo aquí presenta una metodología para la incorporación de las células murales en el ensayo de grano angiogénesis y muestra una asociación estrecha de las células endoteliales y pericitos durante brotación in vitro. El protocolo también detalla una metodología eficaz silenciamiento de genes de la blanco usando siRNA en las células endoteliales para estudios mecanísticos. En conjunto, este protocolo proporciona un análisis en vitro que más apropiadamente modelos de los tipos de células distintos implicados en brotes de angiogénesis y proporciona una plataforma más fisiológicamente relevantes para la evaluación terapéutica y nuevo descubrimiento de mecanismos de regulación de la angiogénesis.
Introducción
Angiogénesis es vital para la embriogénesis apropiado y la cicatrización de heridas, y también desempeña papeles claves en numerosas enfermedades incluyendo cáncer progresión1 y la arteria coronaria de la enfermedad. 2 , 3 tener una mejor comprensión de cómo se produce la angiogénesis en el desarrollo normal, y cómo se reactiva en contextos patológicos, es fundamental para el desarrollo de la novela, la terapéutica eficaz. Modelos fieles en vitro que recapitulan las etapas importantes y tipos de células implicados en la angiogénesis en vivo son necesarios para permitir....
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Protocolo
Día 1:
1. transitorios de la transfección de las células endoteliales
- Si lo desea, realizar una transfección transitoria de humano Umbilical vena Endothelial células (HUVEC) usando oligonucleótidos gene-regulatorios (por ejemplo micro-ARN o ARN interferente pequeño (siRNA)) y el reactivo lipofectamine apropiado según instrucciones del fabricante.
Nota: Este protocolo ha tenido gran éxito realizando inversas transfecciones con secuencias de siRNA personalizado y un reactivo de transfección comercial (véase tabla de materiales). Los autores no han probado otros protocolos de la transfección y reactivos c....
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Resultados
Este protocolo permite una estrecha asociación de la dos celda tipos in vitro, y la presencia del pericitos complementa la ocurrencia de brotes (figura 1A, B). El protocolo también permite la eficaz silenciamiento (p. ej. mediante ARN de interferencia) de un gen de interés en un tipo de células de interés como (VEGFA específicamente en las células endoteliales) o PDGFRβ en pericitos7,
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Discusión
Este protocolo presenta un método para la caracterización de las etapas complejas e interacciones celulares heterotípicos de brotación angiogenesis por lo que permite al investigador a emplear enfoques genéticos y proyección de imagen completa investigaciones mecanicistas. Cuando se realiza el ensayo, es esencial que eficiente recubrimiento endotelial de los granos ocurre durante la cuenta pasos de agitación. Pobre capa endotelial se hará evidente, si los granos no aparecen tienen una superficie áspera de la bola como de.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los Drs. Victoria Bautch y Joshua Boucher para discusiones útiles y asesoramiento en la optimización de cuentas estándar brotación las condiciones analíticas y una brotación prueba de protocolo de tinción. S.H.A. fue apoyado en parte por una subvención de la Instituto Nacional de General médica Ciencias bajo concesión de GM007092 de 5T32.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Puntas de pipeta estériles | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 10T1/2 Media | |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF |
| Media PBS de grado de cultivo de tejidos | Gibco | 14190-144 | Sin magnesio ni calcio |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | Para el levantamiento HUVEC |
| Tripsina | Life Technologies | 15050065 | Para el levantamiento de 10T 1/2 y NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microportadores | Sigma | C3275 | |
| Placas de 6 y 10 cm recubiertas de cultivo de tejidos | Corning | ||
| Fibrinógeno de plasma bovino | Sigma | F8630 | |
| Trombina | Sigma | t9549 | |
| Aprotinina | Sigma | a3428 | |
| Falcon Tubos de fondo redondo | Incubadora | ||
| Placas | |||
| De lo contrario, el plástico para cultivo de tejidos también es aceptable. | |||
| filtración estéril |
Referencias
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M.
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