Summary
Ein Protokoll ist für gleichzeitig Extrahieren von Metaboliten, Proteine und Lipide aus einer einzigen Bodenprobe, ermöglicht reduzierte Probe Zubereitungszeiten und ermöglicht Multi-Omic Massenspektrometrie Analysen von Proben mit begrenzten Mengen vorgestellt.
Abstract
Massenspektrometrie (MS)-auf der Grundlage integrierter metaproteom, Metabolomic und Lipidomic (Multi-Omic) Studien verändern unsere Fähigkeit zu verstehen und mikrobielle Gemeinschaften in ökologische und biologische Systeme zu charakterisieren. Diese Messungen ermöglichen erweiterte Analysen komplexer Boden mikrobieller Gemeinschaften, die die meisten sind sogar komplexe mikrobielle Systeme bisher bekannt. Multi-Omic Analysen haben jedoch Probe Vorbereitung Herausforderungen, da separate Extraktionen für jede Omic Studie, dadurch erheblich verstärken die Zubereitungszeit und Probenmenge benötigt in der Regel benötigt werden. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde eine 3-in-1-Methode für die gleichzeitige Gewinnung von Metaboliten, Proteinen und Lipiden (MPLEx) aus der gleichen Bodenprobe durch Anpassung einen Lösungsmittel basierender Ansatz geschaffen. Dieses Protokoll MPLEx erweist sich als einfach und robust für viele Probentypen sein, auch wenn für begrenzte Mengen von komplexen Bodenproben genutzt. Die MPLEx-Methode aktiviert auch die schnelle Multi-Omic Messungen erforderlich, um ein besseres Verständnis der Mitglieder der einzelnen mikrobiellen Gemeinschaft bei der Auswertung der Veränderungen auf biologische und ökologische Störungen.
Introduction
Bewertung von Boden mikrobiellen Gemeinschaften hat wichtige Implikationen für Kohlenstoff Radfahren und Klima Wandel verstehen. Neuere Studien haben jedoch Schwierigkeiten, wie das Fehlen von sequenzierten Genome für Mikrobiota in verschiedenen Bodenarten und die unbekannte Funktion vieler Proteine erkannt hervorgehoben. Diese Herausforderungen ergeben sich aufgrund der Boden der komplexesten mikrobiellen Gemeinschaft bekannt,1,2,3bis heute. Multi-Omic Analysen, die Ergebnisse von metagenomischen, Metatranscriptomic, metaproteom, Metabolomic und Lipidomic Studien zu verbinden, wurden in zahlreichen Studien der Erde zu einem besseren Verständnis in die Mikroben vorhanden, während vor kurzem umgesetzt erhalten umfassende Informationen über die molekulare Veränderungen aufgrund von ökologischen Störungen1,4,5. Eine Herausforderung mit Multi-Omic Studien ist, dass der Massenspektrometrie (MS)-auf der Grundlage metaproteom, Metabolomic und Lipidomic Messungen erfordern in der Regel eine spezielle Extraktionsverfahren für jedes Omic MS kompatibel6,7 , 8 , 9. präzise Gestaltung dieser Verfahren deren Umsetzung äußerst schwierig oder unmöglich wenn nur eine begrenzte Menge der Probe zur Verfügung steht. Diese Herausforderungen haben uns eine gleichzeitige Metabolit, Protein- und Lipid-Extraktion (MPLEx) Methode in der Lage, mit Hilfe kleiner Probenmengen oder Massen, Verbesserung der Genauigkeit und Bereitstellung schnellere Probe Vorbereitungen für alle drei Analysen untersuchen veranlasst 10. bislang gibt es keine alternativen Boden Extraktionsverfahren, die alle diese Ziele erreichen können.
Um globale Multi-Omic Analysen von einer einzigen Bodenprobe zu ermöglichen, war ein Bio solvent-Extraktion-Protokoll basierend auf Chloroform, Methanol und Wasser Trennungen eingesetzten10. Diese Methode wurde ursprünglich für den gesamten Lipid Extraktionen9,11 und wurde vor kurzem geändert, für die gleichzeitige Gewinnung von Metaboliten, Proteine und Lipide aus einer einzigen Probe12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, so dass weniger Probenmenge und experimentelle Variabilität10. Im Protokoll von MPLEx ist Chloroform nicht mischbar mit Wasser, das die Grundlage für die triphasische chemische Trennung der Probe Bestandteile in verschiedene Fraktionen bildet. Die obere wässrige Phase enthält daher die hydrophilen Metaboliten, gefolgt von einem Protein-Datenträger und dann eine Lipidschicht in der unteren Chloroform Phase (Abbildung 1). Wenn MPLEx auf den meisten Böden angewendet wird, partikulären Schmutz sammelt sich ganz unten der Probenahme Röhren und kann weggeworfen werden, nachdem alle Schichten gesammelt werden. Jede Bodenart kann abweichen, jedoch und in höchst organischen Böden wie Torf, der Boden Schmutz bleibt in der Mittelschicht und fällt nicht auf den Grund der Messgasleitung. MPLEx bietet mehrere Vorteile, wenn mehrere Molekül isolieren aus derselben Probe eingibt, wie (1) kleinere Probenmengen können verwendet werden, für Multi-Omic Analysen, 2) Multi-Omic Extraktionen aus der gleichen Probe Rückgang insgesamt experimentelle Variabilität und (3) größere Zahl von Proben können viel schneller für höheren Durchsatz Studien10vorbereitet werden. Zusammen sind diese Vorteile für eine bessere Messmöglichkeiten zur Bewertung von Bodenproben und deren komplexen mikrobiellen Gemeinschaften von entscheidender Bedeutung.
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Protocol
Hinweis: Sehr nasse Böden können vor der Extraktion ohne Nachteil für die Wirksamkeit der Extraktion lyophilisiert. Nasser Erde kann auch verwendet werden, sondern sollte in Betracht gezogen, beim Hinzufügen von Reagenzien in bestimmten Verhältnissen.
Hinweis: Es wird empfohlen, 20 g der trockenen Boden Gewicht pro Extraktion, zu verwenden, die zwischen zwei 50 mL Röhrchen (maximal 10 g Erde pro 50 mL-Tube) aufgeteilt werden muss. Extraktionen können nach oben oder unten je nach verfügbare Beispiel skaliert werden.
Hinweis: Trocken Bodenproben können durch einen 3 mm-Bildschirm um zu homogenisieren und entfernen kleine Wurzeln und Felsen gesiebt werden. Nicht nass Bodenproben, Sieb, wie die Probe in den Bildschirm stecken wird.
1. Boden Sie Zelle Lysis und Extraktion von Metaboliten, Proteinen und Lipiden (Timing ~ 1 d)
- Pro 20 g Bodenprobe wiegen Sie 10 g in zwei separaten 50 mL-Tuben, die Methanol/Chloroform kompatibel sind. Extrem vorsichtig sein mit den Rohren gewählt, wie Chloroform die meisten Kunststoffe, Kontamination der Proben Lauge wird. Verwenden Sie Glas, wann immer möglich oder Kunststoff Rohre aus Polypropylen oder Polytetrafluorethylen (PTFE) gefertigt.
Hinweis: Halten Sie den Boden auf dem Eis und so kühl wie möglich während der anfänglichen wiegen und Homogenisierung Schritte. - Jede Röhre 10 mL Chloroform gewaschen Edelstahl und Granat Perlen hinzufügen. Auf dem Eis hinzufügen 4 mL kalten ultrapure Wasser (siehe Tabelle der Materialien für Reinigungssystem), um jedes Rohr (eine Probe Split zwischen zwei Rohren) und übertragen Sie die Proben in einem Eiskübel in einer Dampfhaube.
- Fügen Sie mit Hilfe einer serologischen 25 mL Glaspipette hinzu, schnell 20 mL eiskaltes 2:1 Chloroform: Methanol (V/V).
Achtung: Chloroform: Methanol hat akute mögliche gesundheitliche Auswirkungen: Hautreizungen, mögliche chemische Verbrennungen, und Reizung der Atemwege. Es kann die Nieren, Leber und Herz beeinflussen. Geeignete Schutzbrille, Kleidung und Handschuhe zu tragen, und immer unter einem Abzug arbeiten. - Ziehen Sie den Deckel und Wirbel in Lösung. 2:1 Choloroform:methanol hilft die Zellwand von Prokaryoten brechen und auch inaktiviert enzymatische Aktivitäten.
- Legen Sie wenn möglich die Rohre auf 50 mL Tube Wirbel Anhänge und horizontal Wirbel für 10 min bei 4 ° C in einem Kühlschrank. Legen Sie dann die Proben in einem-80 ° C Gefrierschrank ~ 15 min. um sie vollständig abkühlen.
- Mit einer Sonde sonikator in einer Dampfhaube beschallen jede Probe mit einer 6 mm (1/4")-Sonde bei Amplitude 60 % für 30 s auf dem Eis.
Achtung: Es wird empfohlen, einen Ton abflauen Gehäuse und Ohr Schutz beim beschallen zu verwenden. Hohe Spannung liegt das Netzkabel Lieferung und hoher Frequenz an. Berühren Sie den Boden oder auf Seiten das Probengefäß mit einer aktiven Sonde; Es kann zu knacken oder das Plastik schmelzen. - Legen Sie die Proben im-80 ° C Gefrierschrank ~ 15 min, wie beschallen viel Wärme erzeugen kann.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,5-1,7.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Proben während des Verfahrens Lyse kalt bleiben. - Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 x g für 5 min, 4 ° C. An dieser Stelle wird die Probe in der oberen Metabolit Schicht, die Protein-Zwischenschicht und die unteren Lipidschicht (und restlichen Trümmer Pellet) getrennt werden. Siehe Abbildung 1.
- Legen Sie die Proben auf Eis in einem Eiskübel und innerhalb einer Abzugshaube und mit einer 10 mL Glas serologische Pipette, entfernen Sie die obere Metabolit Schichten aus zwei 50 mL Röhrchen in eine große Glasflasche.
Hinweis: Vermeiden Sie Absaugen eines Protein-Schicht in die Pipette; eine kleine Schicht von Metaboliten zu verlassen, falls erforderlich. - Kippen Sie leicht die 50 mL-Tube um die Protein-Zwischenschicht zu lösen, so dass es frei schwebend auf die unteren Lipidschicht. Mit einem sauberen Edelstahl Schlitz-Lab Spatel, sorgfältig scoop beider Protein Zwischenschichten und legen Sie sie zusammen in ein neues 50 mL-Tube.
- Mit einer serologischen 25 mL Glaspipette, entfernen Sie die unteren Schichten der Lipid in ein großes Glas-Fläschchen.
Hinweis: Versuchen Sie, angehende Bodenpartikel zu vermeiden; jedoch einige Boden Schmutz und Partikel zusammen mit strebte die Lipide werden zu einem späteren Zeitpunkt entfernt werden. - Ort, atmungsaktive Membranen über den oberen Teil der Metaboliten und Lipid Glas Vials und Trocknen in einem Vakuum Konzentrator bis Trockenheit (Lipide ~ 4-5 h, Metaboliten über Nacht).
- Das Protein Probenröhrchen und die restlichen Trümmer Pellet Rohre fügen Sie 20 mL eiskaltes Methanol zueinander und Wirbel hinzu. Dies ist die Trümmer Pellets Chloroform abspülen, bevor Sie versuchen, jede mögliche verbleibende Protein aus den Trümmern solubilisieren bevor es werfen.
- Zentrifuge, die Trümmer Pellets und Protein bei 4.000 x g für 5 min, 4 ° C füllharz, dann das Methanol in ein gefährlicher Abfälle Gefäß in einer Dampfhaube Dekantieren.
- Die Protein- und Schutt Pellets in flüssigem Stickstoff Einfrieren und Trocknen in einem Gefriertrockner (mit einer Kollektortemperatur fähig-105 ° C durch Methanol haben einen sehr niedrigen Gefrierpunkt-98 ° c) für etwa 2 Stunden.
Hinweis: Nicht übermäßig trocknen Sie die Pellets, da sie schwieriger zu lösen sein werden. - Am Protein Zwischenschicht Rohr und 20 mL zu jedem der Trümmer Pellets 10 mL Protein Solubilisierung Puffer (4 % SDS, 100mM DTT (DL-Dithiothreitol) in 50mM Tris-Puffer, pH 8.0; siehe Ergänzende Reagenz Setup) hinzufügen.
Achtung: SDS verursacht akute Toxizität und ist brennbar. Es ist eine Haut, Augen und Atemwege reizend. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille. - In der Dunstabzugshaube Sonde beschallen die Proben bei 20 % Amplitude für 30 s in Lösung zu bringen. Vortex 2 min. lang.
- Legen Sie die Protein-Zwischenschicht-Probe in ein Labor-Rohr-Rotator für 30 min bei 300 u/min, 50 ° C, um das Protein zu solubilisieren.
- Horizontal Wirbel die Trümmer Proben für eine zusätzliche 10 min bis alle verbleibenden intakten Zellen lysiert drehen Sie dann mit der Zwischenschicht Proteinproben für die restlichen 20 min.
- Alle Beispiele bei 4.500 x g für 10 min, Raumtemperatur (RT), Zentrifugieren und sammeln des Überstands jede Röhre pro Probe in zwei 50 mL Röhrchen.
- Fügen Sie 10 mL der Solubilisierung Puffer zum Protein Zwischenschicht Pellet, dann beschallen und Wirbel zurück in die Lösung und Zentrifuge wie zuvor.
- Kombinieren Sie die Überstände in die zwei 50 mL Röhrchen gleichermaßen und Zentrifugieren bei 8.000 x g für 10 min, 4 ° C, in einem festen Winkel-Eimer-Rotor.
Hinweis: Eine endgültige Zentrifugation ist notwendig, um übermäßige kontaminierenden Huminstoffe entfernen. - Dekantieren Sie die Überstände in zwei 50 mL Röhrchen, damit in jedem gibt es 30 mL. Dann fügen Sie mithilfe einer serologischen 10 mL Glaspipette 7,5 mL TCA (Trichloressigsäure Säure) um jedes Rohr. Wirbel in Lösung. Das macht 20 % TCA in jeder Probe 30 mL (entsprechend anpassen),
Achtung: TCA ist ätzend, giftig und Mai Hautverbrennungen verursachen. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille. - Legen Sie die Proben in einem Gefrierschrank-20 ° C für 2 h über Nacht.
Hinweis: Proteine werden in der Regel innerhalb von 1 h Niederschlag können jedoch Links über Nacht (bis zu 18 h).
Hinweis: Lassen Sie nicht die TCA-Extraktion länger als 18 Uhr wegen möglich saure Hydrolyse des Proteins zu gehen. Wenn die Probe eingefroren ist, tauen sie auf Eis; lassen Sie sich nicht die Probe vorbei Tauwetter Aufwärmen. - Um das ausgefällte Eiweiß zu Pellets, die Probe bei 4.500 x g für 10 min, 4 ° C Zentrifugieren und Dekantieren des Überstands in das Abwasser.
- Fügen Sie 10 mL eiskaltem Aceton 100 % jedes Protein Pellet, Wirbel und kombinieren wie Pellets in einem Rohr.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit der kombinierten Pellet (mit einer Waage), und dann Dekantieren des Überstands in das Abwasser.
Achtung: Aceton Atemwege und Haut- und Augenreizungen verursachen kann, und ist eine brennbare Flüssigkeit und Dampf. Tragen Sie Schutzbrillen Handschuhe und einen Laborkittel, arbeiten in einer Dampfhaube. - Waschen Sie das Pellet zweimal mit 1,5 mL Aceton und schließlich auf eine 2 mL-Tube für die endgültige Spin bei 10.000 x g für 5 min zu übertragen.
- Dekantieren des Überstands in das Abwasser und erlauben das Pellet Trocknen invertiert auf ein Papier wischen unter einem Abzug für ~ 20 min oder unter einer Stickstoff-Stream, bis das Pellet leicht beginnt zu knacken.
- Fügen Sie 100-200 µL des Puffers Protein Solubilisierung, abhängig von der Größe der Pellets.
Hinweis: Stellen Sie die Lautstärke der Solubilisierung Puffer hinzugefügt, um die Probe so gering wie möglich. Nachfolgenden Filter Aided Probe Vorbereitung (FASP) können nur bis zu 50 μL solubilisiert Probe pro Spalte verwenden; Jeder muss mehr sein, mehrere FASP Spalten aufgeteilt. - Beschallen und Vortex das Pellet in Lösung. Beachten Sie, dass die Probe kann zähflüssig durch Huminstoffe Fällung zusammen mit Protein, die mit einer anschließenden Zentrifugation entfernt werden.
- Schütteln der Probenmaterials in einem Inkubator/Shaker für 30 min bei 300 u/min, 40 ° C, um anderweitig das Protein in Lösung und fahren mit Proteinverdauung.
- Snap Einfrieren die Probe in flüssigem Stickstoff und Shop in einem-80 ° C Gefrierschrank bis zum Proteinverdauung bereit.
(2) Lipid-Vorbereitung (Timing ~ 20 min)
- Sobald die Lipid-Proben trocken sind, fügen 200 μL der 2:1 Chloroform: Methanol, das Fläschchen, Vortex in Lösung und Transfer in ein 1,5 mL Polypropylen-Rohr, eine zusätzliche 200 μL auf das Glas Fläschchen, Wirbel und pipette die restlichen Lipide und übertragen auf das Rohr.
- Zentrifugieren Sie die Trümmer aus der Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C.
- Den überstand in eine Glasflasche Lipid und speichern bei-20 ° C bis zur LC-MS/MS-Analyse (Weitere Details für LC-MS/MS in Ergänzungsmethoden) übertragen.
- Wenn die Proben sofort nach der Zubereitung analysiert werden können, müssen die Lipide in Lösungsmittel bei-20 ° C zu verhindern Oxidation und Abbau gespeichert werden.
(3) Metabolit Vorbereitung und Derivatisierung (Timing ~ 5 h)
- Am Tag nach der Extraktion die Speed-Vac entnehmen Sie Metabolit Proben und Lagern Sie bei-20 ° C trocken, bis bereit für Derivatisierung und Analyse auf der GC. Ansonsten läuft die Metaboliten auf ein GC, dann bereiten sie mit dem entsprechenden Protokoll für das Instrument.
- Unmittelbar vor der derivatizing der Metaboliten zur Analyse auf der GC, übertragen Sie durch Zugabe von 200 μl von Methanol, aufschütteln und hinzufügen ein 1,5 mL Polypropylen-Rohr aus die große Glasfläschchen. Einmal wiederholen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12.000 x g für 10 min, 4 ° C. Übertragen Sie den überstand in kleinen Glasfläschchen, fügen Sie eine atmungsaktive Membrane nach oben, und völlig trocken in einer Speed-Vac.
- Derivatize die Metaboliten durch Zugabe von 20 µL der Methoxyamine Lösung der Probenfläschchen und Wirbel für 30 s auf einem Vortexer bei mittlerer Geschwindigkeit.
Achtung: Methoxyamine Hydrochlorid verursacht schwere Verbrennungen und schwere Schäden an Augen, Sensibilisierung durch Hautkontakt hervorrufen kann. Schutzbrille, Handschuhe und Kittel tragen und arbeiten unter einem Abzug. - Verwenden Sie ein Bad sonikator, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig gelöst ist.
- Inkubieren Sie die Probe in einem Inkubator mit Kondensation Prävention Deckel mit 1.000 u/min schütteln bei 37 ° C für 1 h 30 min gehalten.
- Invertieren Sie das Fläschchen einmal Proben mit kondensierten Tropfen an der Kappe-Oberfläche zu mischen. Spin-down der Probenmaterials bei 1.000 x g für 1 min, RT
- Führen Sie Silylation durch Zugabe von 80 µL (mit einer Spritze) von N-Methyl - N-(Trimethylsilyl) Trifluoroacetamide mit 1 % Trimethylchlorosilane. Für 10 s Wirbel.
Achtung: MSTFA + 1 % TMCS Haut Korrosion, schwere Augenschäden und zielgruppenspezifische Orgel Toxizität verursachen können, und ist eine brennbare Flüssigkeit und Dampf. Schutzbrille, Handschuhe und Kittel tragen und arbeiten unter einem Abzug. - Inkubieren Sie die Probe in einem Inkubator mit Kondensation Prävention Deckel mit 1.000 u/min schütteln bei 37 ° C für 30 min gehalten.
- Invertieren Sie das Fläschchen einmal Proben mit kondensierten Tropfen an der Kappe-Oberfläche zu mischen.
- Spin-down der Probenmaterials für 5 min bei 2.000 x g, RT
- Übertragen Sie die umgesetzten Lösung in Ampullen für die GC-MS-Analyse geeignet.
4. die Proteinverdauung (Timing ~ 1 d)
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 15.000 x g für 5 min, RT, um jeglichen Schmutz pellet.
- Filter-Aided--Probenvorbereitung (FASP) durchführen, für die Verdauung mit FASP kits (siehe Tabelle der Materialien) folgende Änderung des Herstellers Anweisungen31,32:
- Fügen Sie 400 μl des Puffers 8 M Harnstoff in einer FASP Spalte (500 μL 30K MWCO Spin Filter).
- Sobald die Probe Zentrifugieren beendet, pipette aus der Überstand (verwerfen das Pellet) und bis zu 50 μL der Probe 400 μl von 8 M Harnstoff in der Spalte hinzufügen.
Hinweis: Fügen Sie nur bis zu 50 μL der Proben pro Spalte. Wenn es mehr als 50 μL der Probe, mehrere Spalten verwenden und kombinieren die Peptide nach der Verdauung. Es empfiehlt sich, dieses Volumen so gering wie möglich zu verlassen (30 µL ist ideal) zur Sicherstellung der FASP Spalte wird entfernen Sie alle der SDS die Masse Spec Analyse erheblich stören kann. - Setzen Sie die Säule in der mitgelieferten 1,5 mL Tube und Zentrifugieren der Probe bei 14.000 x g für 30 min, RT
- Entfernen Sie den Durchfluss in das Abwasser und die Spalte 400 μl von 8 M Harnstoff hinzu und Zentrifugieren Sie wieder.
- Wiederholen Sie die vorherigen Schritt noch einmal für eine Gesamtmenge von 3 Harnstoff-Spülungen.
Hinweis: Sicherstellen die Probe geht in der Nähe von Trockenheit auf die Spalte, wenn es irgendeine mehr als ~ 30 µL noch auf den Filter nach jedem Dreh weiter Zentrifugieren. - Fügen Sie 400 μl 50 mM NH4HCO3 und Zentrifuge bei 14.000 x g für 20 min hinzu, entsorgen Sie die Abfälle und einmal wiederholen.
- Übertragen Sie die Spalten auf eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
- 75 μl Trypsin-Verdauung-Puffers zu Spalten hinzufügen und mit einer Kondensation Prävention Deckel bei 750 u/min bei 37 ° C für 3 h in einem Inkubator inkubieren.
- 40 µL 50 mM NH4HCO3 zu Spalten hinzufügen.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 x g für 15 min, die Peptide in das Rohr zu sammeln, unter Beibehaltung der hochmolekularen Schadstoffe auf die Stütze.
- Hinzu kommen 40 μl 50mM NH4HCO3 die Spalte und Zentrifuge wieder.
- Entsorgen Sie die Spalte, trocken Sie hinunter die Peptide in das Rohr in eine Speed-Vac ~ 30 µL und BCA-Assay (Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit; siehe Tabelle of Materials) Peptide.
- Führen Sie optional einen Bereinigung Schritt, wenn SDS Kontamination (sichtbare Bläschen)33vermutet wird. Eine Festphasenextraktion muss danach erfolgen, wenn diese Option zu wählen. Detaillierte Informationen zu dieser Methode gibt es in den Ergänzenden Methoden.
- Die Probe für MS-Analyse verdünnen oder fahren Sie wahlweise mit HPLC Fraktionierung (zwei Stufen).
- Um fraktionieren, verdünnen Sie Proben mit einem Volumen von 400 µL mit 10 mM Ammonium-Formiat Puffer (pH 10,0).
- Beschlussfassung über eine C18-Säule (siehe Tabelle der Materialien) durch die Trennung mit 0,5 mL/min mit einer HPLC-Anlage mit mobilen Phasen (A) 10 mM Ammonium-Formiat, pH 10,0 und (B) 10 mM Ammonium-Formiat, pH 10,0/Acetonitril (10: 90).
- Einstellen Sie den Verlauf von 100 % A zu 95 % A über die ersten 10 min, 95 % A, 65 % A über min. 10, 70, 65 % A bis 30 % A über min 70 bis 85, bei 30 % A über min 85 bis 95 pflegen.
- Neu mit 100 % A über min 95 bis 105 equilibrate und halten in 100 % A bis 120 min.
- Fraktionen alle 1,25 min (96 Fraktionen über den gesamten Verlauf) zu sammeln und schließlich verbinden jede Zeile für eine Gesamtmenge von 12 Proben oder jede zweite Zeile für 24 Proben (jeweils mit n = 8 und n = 4 Fraktionen gebündelt).
- Trocknen Sie alle Fraktionen unter Vakuum und fügen Sie 15 µL Reinstwasser jeweils für die Lagerung bei-20 ° C bis LC-MS/MS-Analyse hinzu.
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Representative Results
Als das MPLEx-Protokoll verwendet wurde, um Moleküle aus Kansas native Prairie Boden (ein Mollisol Boden) zu extrahieren, vorgesehenen dreifacher Analysen Ergebnisse 3376 Peptide, 105 Lipide und 102 polaren Metaboliten (alle eindeutigen Kennungen). Während das MPLEx-Protokoll für die allgemeine Extraktion von Lipiden und Metaboliten12,13,14,15,16,17,18 etabliert hat ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, deren Gegenüberstellung zu gemeinsamen Boden Protein Extraktionsmethoden für mikrobielle Analysen, wie Boden Protein Extraktion Kits (siehe Tabelle des Materialien) und SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) Extraktionen35, wird hier weiter ausgewertet. Um diese Techniken zu beurteilen, wurden Kansas native Prairie Boden Proteine mit jeder Ansatz extrahiert und direkt mit umgekehrt-Phase LC-MS/MS mit einem UPLC-System gekoppelt mit einem Hybrid Quadrupol/Orbitrap Massenspektrometer analysiert. Detaillierte Informationen über die Methodenparameter sind in den Ergänzenden Methodenzur Verfügung. Das daraus resultierende experimentelle Peptid MS/MS-Spektren von jeder Extraktion Ansatz wurden im Vergleich mit prognostizierten Peptid Sequenzen aus der Vertreter Kansas native Prairie Metagenom2 mit einem strengen MS-GF + spektrale Wahrscheinlichkeit Cutoff von 1 x 10 -10 36 , 37 und eine Masse Fehler Cutoff von weniger als 5 ppm. Es sei darauf hingewiesen, dass die Analyten extrahiert aus dem Boden mit dem MPLEx-Protokoll für MS-Studien und andere analytische Techniken eignen. Wenn zunächst vergleicht drei der bekannten Methoden der MoBio und SDS repliziert, überschnitten nur 12 % der Peptide zwischen den beiden Techniken zeigt die Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaft und verschiedenen Extraktion Effekte (Abbildung 2). Beim Vergleich der MPLEx mit MoBio und SDS-Extrakten wurden ~ 38 % der Peptide mit MPLEx Methode beobachtet auch erkannt, wenn mit der SDS und/oder MoBio Extraktionen (Abbildung 2). Betrachtet man die Anzahl der Arten in der Kansas Boden Bakteriengemeinschaft und seine Metagenom2, die Überlappung von Peptid Identifikationen ist vernünftig und aufgrund seiner Komplexität, die Kombination der Methoden extrahiert mehr Peptide als jeweils allein 35. auch, da diese Proben wurden unfraktionierte und von nur 1-dimensionale LC-MS/MS analysiert, die extrem hohen Probe Komplexität möglicherweise verursachte etwas Vorspannung in der Erkennung durch verschiedene Peptid Konzentrationen extrahiert, indem jeder Ansatz. Das MPLEx Protokoll galt auch für andere Bodenarten wie Permafrost und Feuchtgebiete, und in allen Fällen die vorläufige Proteomic Ergebnisse sind von ähnlicher Qualität derjenigen der Kansas native Prairie Bodendaten hier vorgestellt.
Die breite Anwendbarkeit des MPLEx-Konzepts wurde mit einer vielfältigen Reihe von Proben, einschließlich dem Archaeon Sulfolobus Japan, ein Unicyanobacterial Konsortium38, Maus Hirngewebe Kortex, menschlicher Urin, zuvor ausgewertet und Blätter von Arabidopsis Thaliana (Abbildung 2)10. Für alle Proben mit Ausnahme von A.thalianasind Harnstoff Extraktionen die gängigste Methode, Proteine, zu extrahieren, so dass sie als die Kontroll-Ansatz zur Auswertung verwendet wurden. Die A. Thaliana MPLEx Ergebnisse waren im Vergleich zu einer Extraktion mit Trichloressigsäure Säure (TCA) durchgeführt, da Blätter der Pflanze reich an phenolischen Verbindungen sind, die vor dem MS Analysen39entfernt werden müssen. In allen Fällen war die Zahl der Proteine beobachtet von der MPLEx-Methode ähnlich wie für die Steuerelemente10, zeigt seine Nützlichkeit für viele verschiedenen Probenarten. Auch gab es keine Trends, verbunden mit den spezifischen Proteins Klassen in alle Probentypen (inkl. Boden) extrahiert. Daher macht die breite Anwendbarkeit der MPLEx auf zahlreiche biologische und ökologische Systeme es einen vielversprechenden Ansatz.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung zeigt den MPLEx-Prozess, in dem Metaboliten, Proteine und Lipide sind gleichzeitig aus der gleichen Bodenprobe für MS-Analysen extrahiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Venn-Diagramme zur Veranschaulichung der Peptid-Überlappung für eine vielfältige Reihe von Proben mit MPLEx und ein standard Harnstoff-basierte Protein-Extraktions-Verfahren normalerweise extrahiert durchgeführt. Daten aus MPLEx Extraktion des Archaeon S.acidocaldarius, das Unicyanobacterial Konsortium menschlicher Urin, Maus Hirnrinde und A.thaliana Pflanze Blätter von Nakayasu, E. S. Et Al. 201610angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle Laboratorien die gleiche Ausstattung haben werden, so dass bestimmte Methoden, zum Beispiel die Lyse Schritt, angepasst werden können. Hier verwenden wir aufschütteln und beschallen, aber die Verwendung eines großen 50 mL Wulst Beater funktionieren würde. Wenn ein Gefriertrockner mit einer in der Lage,-105 ° C Kollektortemperatur nicht verfügbar ist, können Proben unter einer Stickstoff-Stream getrocknet werden. Auch Bodenarten sind sehr unterschiedlich und können einschließen, Sand, Schlamm, Lehm, Torf und Lehm (etc.), und sie können auch variieren je nach pH-Wert, Salzgehalt und organischer Substanz Reichtum. Jeder der diese Abweichungen kann wirken auf dem Protokoll, daher es wichtig ist, flexibel zu sein und bei Bedarf Anpassungen vornehmen. Es ist wichtig, jedoch, dass die Verhältnisse und die Prozentsätze unverändert.
Das MPLEx-Protokoll zeigt große Verheißung für Anwendung in zahlreichen biologischen und ökologischen Systeme und die Fähigkeit, Multi-Omic Analysen Boden mikrobieller Gemeinschaften zu ermöglichen. Bisherige Vergleiche von MPLEx auf andere Extraktion Protokolle für diverse Systeme illustriert ein hohes Maß an Peptid Überlappung10. Allerdings beobachtet man, dass Einschränkung war, dass MPLEx nicht anwendbar auf Blutplasma Proteine, die verbraucht werden müssen. In diesen Fällen wurden die ausgefällten Proteine durch die Antikörper in den Immunodepletion Spalten für die Breite Abdeckung des Proteoms Plasma benötigt nicht gut erkannt. Daher sollten mehr Standardansätze Extraktion unter diesen Umständen verwendet werden. Eine zusätzliche Einschränkung bekannt für MPLex Extraktion Ansatz ist, dass es intrazelluläre und extrazelluläre Protein nicht unterscheiden, aber dies für alle anderen Boden Protein Extraktion Protokolle sowie gilt.
In diesem Manuskript vorgesehenen MPLEx Ergebnisse 3376 Peptide, 105 Lipide und 102 polaren Metaboliten in Kansas native Prairie Boden mit der Extraktion und Analyse-Methoden detailliert im Abschnitt Protokoll. Bessere Überlappung beobachtet zwischen die Peptide in der Steuerung und MPLEx Ansätze der einzelnen Systeme im Vergleich zu den Boden mikrobiellen Gemeinschaft (Abbildung 2) extrahiert. Dies ist keine Einschränkung, sondern eine Folge der Arbeit mit den äußerst komplizierten Boden mikrobiellen Gemeinschaften. Diese Ergebnisse sind weiter festgestellt, wie die bekannten Boden Extraktionstechniken des SDS und MoBio nicht gut überschneiden, entweder aufgrund der großen Vielfalt und Schwierigkeiten, die Gewinnung von Proteinen genauso Boden. Interessant ist, das MPLEx-Protokoll erlaubt die Identifizierung von mehr total Peptide als SDS oder MoBio und auch zusätzliche Komponenten, die nicht in beiden Analysen gesehen erkannt.
Diese Beobachtungen machen MPLEx eine sehr vielversprechende Technik für Arbeiten mit kleinen Proben Größen, Verringerung der gesamten Multi-Omic experimentelle Variabilität und Verringerung der Probe Vorbereitungszeit. Die Vorteile mit MPLEx möglich schauen, um die Multi-Omic Fähigkeiten und für großangelegte mikrobielle Gemeinschaft Studien erforderlichen Analysen ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren möchte Nathan Johnson für seine Hilfe bei der Vorbereitung der Figuren zu danken. Diese Forschung wurde durch das Pan-Omics-Programm unterstützt, die vom U.S. Department of Energy Office von biologischen und Umweltforschung (genomische Science Program), die Mikrobiome im Übergang (MinT) Labor leitete Forschung und Entwicklung gefördert wird Initiative des Pacific Northwest National Laboratory, als auch die nationalen Institute of Health nationalen Institut der Environmental Health Sciences (R01 ES022190) und NIH (P42 ES027704). KEBJ möchte R21 HD084788 für die finanzielle Unterstützung zur Entwicklung und Validierung neuartiger Multi-Omic Extraktionstechniken danken. Diese Arbeit wurde in die W. R. Wiley Umwelt molekularen Wissenschaften Labor (EMSL), eine DOE nationalen wissenschaftlichen Benutzer Anlage am Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) durchgeführt. PNNL ist ein Multi-Programm-nationallabor für DOE unter Vertrag DE-AC06-76RL01830 von Battelle betrieben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
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