Мы предлагаем протокол расширения клетки на Макропористые microcarriers и их использования в качестве системы доставки в биореакторе перфузии заполнить матрицу decellularized ткани. Мы также включать различные методы для определения клеточной пролиферации и жизнеспособность клеток, культивируемых на microcarriers. Кроме того мы демонстрируем функциональность клеток после биореактор культур.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Рекомбинатные коллаген я пептидные Microcarriers для расширения клеток и их потенциального использования в качестве системы доставки клеток в биореакторе модель
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тканевая инженерия является многообещающей областью, сосредоточена на разработке решений для растущего спроса на относительно целей трансплантации органов и тканей. Процесс для создания таких тканей является сложным и включает соответствующую комбинацию типов конкретных клеток, подмости и физическое или биохимических стимулы для руководства клеточный рост и дифференциацию. Microcarriers представляют собой привлекательный инструмент для расширения клеток в трехмерное (3D) микроокружения, поскольку они обеспечивают более высокие поверхности для соотношения объема и более тесно имитировать ситуации в естественных условиях , по сравнению с традиционными методами двумерной. Сосудистой системы, поставку кислорода и питательных веществ к клеткам и обеспечения удаления отходов, является важным строительным блоком при генерации инженерии тканей. В самом деле большинство конструкций не после имплантированных ввиду отсутствия сосудистой поддержки. В этом исследовании мы представляем собой протокол для расширения эндотелиальных клеток на рекомбинантных коллагена основе microcarriers в динамических условиях в колбу спиннер и биореакторов, и мы объясним, как определить этот параметр жизнеспособность клеток и функциональности. Кроме того мы предлагаем метод для доставки клеток для целей васкуляризации без дополнительных отряд необходимые шаги. Кроме того мы предоставляем стратегию оценки клетки васкуляризации потенциал в биореакторе перфузии на матрицу decellularized биологических. Мы считаем, что использование представленных методов может привести к разработке новых методов лечения на основе ячеек для большого спектра тканей, инженерных приложений в клинической практике.
Введение
Одна общая проблема в инженерных приложениях ткани необходимо приносить высокий клеточной массы с фенотипом правильным дифференциация на месте. Применение microcarriers для решения этого вопроса началась в 1967 году с увеличением значение на сегодняшний день в таких областях, как ортопедические тканевой инженерии для крупномасштабных поколения кожи, костей, хрящей и сухожилий1. Они позволяют обработку адэрентных культур способами аналогична подвеска культур2 путем расширения клетки на микромасштабной трехмерные (3D) подложках. Таким образом клетки опыт однородной питательных и ячейки матрицы взаимодействий, что приводит ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
hBMSCs были изолированы от головку бедренной кости артроз пациентов, перенесших операцию замены головки бедренной кости. Процедура была выполнена под номером официального утверждения местного комитета этики из Университета Вюрцбурга и осознанного согласия пациентов. Основная микрососудистой эндотелиальные клетки были изолированы от крайней плоти биопсий несовершеннолетних доноров. Их юридические представители представили информированное согласие в письменной форме. Исследования была одобрена местные этические Советом Университета Вюрцбурга (голосование 182/10).
1. изоляция hBMSCs и HDMECs
- Человека костный мозг производные Мезенхим....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как показано на рисунке 1A, мы получили большое количество жизнеспособных клеток на RCP microcarriers после 7 дней культуры, определяется жить/мертвые пятнать. Эти результаты были подтверждены SEM анализ, в котором полностью колониальных microcarriers были замечены вокруг поры, частично зарастание их (рис. 1B). С другой стороны эксперименты, в которых клетки не были посеяны равномерно привело к несколько пустых microcarriers. Неу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Одна Главная цель microcarrier является расширение клеток при сохранении их дифференциации для того, чтобы доставить клетки место необходимости. Представленный метод ввести microcarriers RCP, где клетки смогли прикрепить, размножаться и колонизировать microcarriers с плотностью высокого клеток. Это было отмечено жить/мертвые окрашивания, в которых были обнаружены более чем 90% жизнеспособных клеток пока только несколько мертвых клеток были получены после 7 дней динамических культур. Аналогичным образом SEM изображения по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Исследований, приведших к эти результаты получила финансирование от Европейского союза седьмой рамочной программы FP7/2007-2013 под Грант соглашение n ° 607051 (био-ВДОХНОВЛЯТЬ). Мы благодарим Кристина ван Spreuwel-Гуссенс от Fujifilm производства Europe B.V., для оказания технической помощи при производстве RCP и Вернер Страке из Института Фраунгофера силикатных исследования ISC, для помощи с SEM анализ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразиумбромид (МТТ) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4',6-диамидино-2-фенилиндолдигидрохлорид (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Уксусная кислота 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Аналитические весы Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Аскорбат-2-фосфат | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Биореактор | Кафедра тканевой инженерии и регенеративной медицины, Вюрцбург, Германия | ||
| Светлопольный микроскоп Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Центрифуга пробирки (15 мл, 50 мл) | Greiner Bio-One | ||
| Коллаген R раствор 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор | Sigma-Aldrich | D8537 | Модифицированный, без хлорида кальция и хлорида магния |
| Эозин 1% | Морфисто | 10177.01000 | |
| Этанол 96% | Карл Roth GmbH | T171.4 | Денатурированная |
| фетальная сыворотка для телят (FCS) | Bio& ПРОДАМ | FCS. ADD.0500 | не термоинактивированный |
| флуоресцентный микроскоп BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Гексаметилдисилазан | Sigma-Aldrich | 440191 | Реагент класса, ≥ 99% |
| Инкубатор для биореактора | Кафедра тканевой инженерии и регенеративной медицины, Вюрцбург, Германия | ||
| Набор для двойного окрашивания живых/мертвых клеток | Fluka | 04511KT-F | |
| Магнитная мешалка | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Микропланшетный ридер Tecan Infinite M200 | Tecan | ||
| Игла 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Папаин из папайи латекс | Sigma-Aldrich | P4762 | лиофилизированный порошок, ≥ 10 единиц/мг белок |
| Парафин | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Перистальтический насос | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA набор для анализа | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Сканирующий электронный микроскоп Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Раствор гидроксида натрия 1,0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Спиннер колбы (25 мл) | Шприц Wheaton | 356879 | |
| 1 мл | VWR | 720-2561 | |
| Колбы для культуры тканей (25 см<суп>2, 75 см<суп>2, 150 см<суп>2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Трипан синий 0,4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline клеточная технология | LL-0005 |
Ссылки
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Экспансия клеток на микроносителяхдоставка эндотелиальных клетоккультивирование в колбе с перемешивающим устройством (спиннер-колбе)биореакторная перфузионная системаэквиваленты васкуляризированных тканейанализ жизнеспособности клетоксканирующая электронная микроскопияокрашивание Live/Deadгелеобразование коллагена
