本方案描述了一种制备富集的气孔保卫细胞的方法，适用于生理学及其他生物学研究。
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摘要
摘要
保卫细胞的研究对于了解该细胞类型对植物整体功能的具体贡献至关重要。然而，保卫细胞的分离通常较为困难，因此对其研究常常面临挑战。
本研究建立了一种气孔保卫细胞富集方法。该方案利用透明胶带分离保卫细胞并从中提取蛋白质。该方法在细胞分离过程中提高了保卫细胞的完整性和得率，为研究细胞信号转导过程及其与气孔运动表型之间的关联提供了可靠的样品。在本方法中，将植物叶片夹在两段胶带之间，撕开以去除叶片的远轴面。该方案已应用于拟南芥叶片组织以分离保卫细胞。细胞经荧光素二乙酸酯（FDA）处理以检测其活性，并用脱落酸（ABA）处理以评估其对ABA的气孔运动响应。综上所述，该方案在制备富集的气孔保卫细胞及蛋白质分离方面具有实用价值。所获得的细胞和蛋白质质量可满足生理学及其他生物学研究的需求。
引言
气孔在植物的整体生理功能和适应性中起着重要作用。这些微小的植物特有结构由两种特化的表皮细胞——保卫细胞构成，主要大量分布于叶片的远轴面。气孔对于植物与大气之间的气体交换以及通过蒸腾作用控制水分流失至关重要。保卫细胞通过整合多种外部（例如，光照、湿度、病原体接触、二氧化碳浓度）和内部（例如，内源激素）信号来调节气孔开度1,2。在过去的20年中，这类细胞已成为研究植物细胞信号传导过程的模式系统。保卫细胞仅占叶片总细胞的一小部分；因此，若要以单细胞水平研究其独特的细胞、生化和分子特性，必须将其从其他类型的叶细胞中分离出来。过去，保卫细胞的研究通常涉及制备保卫细胞原生质体（GCP）3,4,5。该方法通常需要使用大量细胞壁降解酶，或通过匀浆进行机械破碎，且已被证明成本高、耗时长，一般需要数小时才能制备一份GCP样品，且常常产量较低。更重要的是，由于保卫细胞是以成对形式协同调节气孔开度的，因此使用原生质体可被视为一种人工系统，用于研究保卫细胞的信号传导过程。
本文中，我们建立了一种制备气孔的方法，该方法可富集完整的保卫细胞，并使其保持对刺激的生理响应能....
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方案
1. 植物培养
- 在育苗基质中播种并使其萌发。将植株置于生长室中培养，光照强度为 140 µmol photons m−2 s−1，光周期为 8 小时光照（22 °C）和 16 小时黑暗（18 °C），持续培养 2 周。
- 选取大小相近的幼苗，分别移栽至装有土壤、直径为 4" 的花盆中，并在与步骤 1.1 相同的条件下继续培养 3 周。
注意：每周用自来水浇灌两次，以保持土壤湿润。
2. 富集气孔的制备
- 用解剖刀去除5周龄的 A. thaliana 植株的叶片。
- 将每片叶片用两片透明胶带贴附，其中一片粘贴在叶片的远轴面（下表面），另一片粘贴在近轴面（上表面）。使胶带在叶片上保留5秒。
- 用双手的拇指和食指轻轻将两片胶带分开，从而分离出带有表皮细胞和保卫细胞的远轴面以及带有叶肉细胞的近轴面。
- 将来自叶片远轴面的表皮条在收集过程中立即放入含有60 mL气孔开放缓冲液（50 mM KCl，10 mM MES-KOH，用1 M KOH调节至pH 6.2）的40 mm × 12 mm培养皿中。
- 重复上述步骤，直至收集完所有样品的表皮条。
- 将含有表皮条的培养皿置于光照条件与步骤1.1所述相同的培养箱中....
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结果
消化叶肉细胞和表皮细胞前后拟南芥保卫细胞的代表性图像如图所示 图1. 可通过FDA检测酶活性和细胞膜完整性，观察叶肉细胞和表皮细胞去除前后保卫细胞的存活状态（图1B 和 1D). 图2 展示了拟南芥在 ABA 处理下气孔运动的变化。ABA 处理 30 分钟后，气孔孔径减小超过 50%。 图 2A 气孔运动的时间进程。在不同时间点，使用光学显微镜拍摄图像。利用ImageJ测量气孔孔径，结果以60至80个孔径测量值的平均值±标准误差表示。每个时间点的气孔孔径代表性图像如图所示 图2B蛋白质的检测、分离及相对丰度通过SDS-PAGE观察图3包含四个生物学重复，以强调该方法提取蛋白质的可重复性.......
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讨论
保卫细胞是研究植物信号转导机制的模式系统，因此确保所用样品的制备方法最适合回答生物学问题是十分重要的。尽管植物研究领域对保卫细胞的兴趣日益增加，但目前尚无一种通用的方法可用于制备气孔保卫细胞，以在同一系统中同时研究气孔运动与生理过程以及分子水平的变化。分离保卫细胞的困难在很大程度上源于其体积微小、数量稀少以及独特的结构，这些特性使得从完整叶片中分离它们的难度显著增加。
本方案提供了一种克服上述困难的方法，即采用改进的胶带剥离法进行分离。本方案所述方法可实现完整保卫细胞的分离，且分离后的保卫细胞仍保持对刺激的生理响应能力。此类样品的制备使得提取保卫细胞蛋白质成为可能，所获蛋白可作为深入蛋白质组学研究的起始材料，例如利用串联质谱标签（Tandem Mass Tags, TMT）或同重同位素标签用于相对与绝对定量（Isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ）进行的定量蛋白质组学研究11,12。此外，.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢布赫霍尔茨高中数字视频制作团队的 Daniel Chen 在视频剪辑方面的协助。陈实验室关于气孔保卫细胞、蛋白质组学和代谢组学的研究得到了美国国家科学基金会资助（项目编号：0818051、1158000 和 1412547）。孔文文受到中国国家留学基金管理委员会资助。庞秋颖博士受到中国国家留学基金管理委员会和国家自然科学基金委员会（项目编号：31570396）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不锈钢手术刀 | Feather | NC9999403 | |
| 透明胶带（3M） | ULINE | S-9781 | |
| 培养皿 | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| 纤维素酶（Onozuka R-10） | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| 果胶酶 R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B 显微镜 | Leica Microsystems | ||
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge 高速 PPCO 离心管 | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ 蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| 荧光素二乙酸酯（FDA） | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| 脱落酸 | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 培养基 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli 样品缓冲液 | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe 考马斯亮蓝（G-250） | Bio-Rad | 161-0786 | |
| 微量离心管（2 mL） | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | ||
| 镊子 | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX 预制胶 | Bio-Rad | 456-1043 | |
| 显微镜载玻片 | Fisherbrand | 12-550-A3 |
参考文献
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M.
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重印与许可
