Summary
Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.
Abstract
Kümelenmiş düzenli olarak serpiştirilmiş palindromik tekrarlar (CRISPR) - CRISPR - protein prokaryotik edinilmiş bağışıklık savunma sistemi kesin ökaryotik genom mühendisliği için güçlü bir araç olarak ortak tercih 9 (Cas9) ilişkili. Burada, C. elegansgenomik noktası mutasyonların verimli ve hassas nesil chimeric tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNA) ve CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) kullanarak hızlı ve basit bir yöntem mevcut. Biz bir boru hattı sgRNA hedef seçimi, homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonu tasarım, CRISPR-Cas9-RNP kompleks ve teslim ve doğru düzenlenmiş hayvanlar sağlam ve hızlı tanımlaması sağlar bir Genotipleme strateji tanımlamak. Yaklaşımımız sadece facile üretimi ve istenen genomik noktası tanımlaması mutant hayvanlar izin verir, ancak aynı zamanda diğer karmaşık Indel allelleri algılama yaklaşık 4-5 gün içinde yüksek verimliliği ve azaltılmış tarama iş yükü ile kolaylaştırır.
Introduction
Son teknolojik gelişmeler kökten değiştirdi ve tam olarak mühendis genleri yeteneği hızlandırılmış. Özellikle, RNA güdümlü endonükleaz Çift Kişilik strand mola (DSB) faiz hedef sıra ikna etmek için Cas9 dayanan, CRISPR-Cas9 sistemi kapsamlı olarak doğru bir şekilde kullanılan model organizmalar çoğunluğu genom mühendisi kullanılmaya başlanmıştır Biyomedikal Araştırma1,2,3,4. Önemli ölçüde, CRISPR-Cas9 kullanımı bile zor türler C. elegans5gibi genom düzenleme kilidi. Türü ne olursa olsun, sistem düzenleme CRISPR-Cas9 dayalı genom ile nokta mutasyonlar üreten üç çekirdek bileşenleri üzerinde dayanır: 1) Cas9 endonükleaz, bir hedef sıra ve tasarlanmış 3) bir kullanıcı için Cas9 endonükleaz yönlendirir 2) bir tek Kılavuzu RNA (sgRNA) İstenen içeren homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonunu faiz2/ edit(s).
Hedefleme sgRNA ve Cas9 tanıtmak için kullanabileceğiniz çeşitli yöntemler vardır nükleaz plazmid, RNA ve viral alan teslim yöntemleri6dahil olmak üzere hücre içine. Son zamanlarda, pre-complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) doğrudan teslim CRISPR Cas9 esaslı genom7düzenleme güçlü ve etkili bir araç ortaya çıkmıştır. Pre-complexed CRISPR-Cas9 RNPs doğrudan teslim Yani birkaç farklı avantajı vardır: 1) RNPs bypass hücresel transkripsiyon ihtiyacını ve çeviri, 2) RNPs hızla temizlenir, hangi-ebilmek artmak özgüllük için kullanılabilir zamanı azaltarak kapalı-hedef bölünme ve 3) RNPs non-yerli dizileri rasgele tümleştirme yoluyla ana bilgisayar genom içine giriş circumvents hiçbir yabancı DNA/RNA unsurları içerir. Birlikte, bu öznitelikler muhtemel hedef kapalı etkileri en aza indirerek CRISPR hedef olarak düzenleme kısa ömürlü bir patlama sağlar.
C. eleganssiteye özgü genomik değişiklikleri tanıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı tanımlar. Bu iletişim kuralı sgRNA ve tek telli Oligonükleotid (ssODN) HDR şablon tasarımı, sgRNA-Cas9 RNP kompleks ve teslim ve düzgün düzenlenmiş hayvanlar kesin tanımlaması için bir Genotipleme strateji hedefleme içerir. Bu stratejiyi kullanarak, sadece istediğiniz siteye özgü değişiklikleri elde edilebilir, ama diğer non-spesifik Indel mutasyonlar da kurtarılabilir. Böylece, bizim strateji allelic dizisi tek bir strateji kullanarak mono allelic, BI allelic nerede nesil verir ve Indel mutantlar F1 üretimi oluşturulabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Ulusal Sağlık enstitüleri ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Michigan Üniversitesi'nde kılavuz izledi. Ve ipuçları protokol boyunca pipet RNase free çözümleri kullanın. Çalışma alanı, Pipetler, tüpler ve santrifüj ( Malzeme tabloyabakın) Üretici yönergeleri izleyerek RNase dekontaminasyon çözüm ile temiz.
1. sgRNA hedef seçimi
- Bir web tarayıcısı kullanarak Web sayfasını açın: http://crispor.tefor.net8
- ~ 60 baz çifti (bp) istenen düzenleme ilgi kanat sırası giriş (Yani 30 bp 5' ve 3' istenen düzenleme).
- Caenorhabditis elegans genom açılan menüden seçin.
- Protospacer bitişik Motif seçin (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) açılan menüsünden.
- Gönder'i tıklatın. Sonuç sayfası faiz düzen için en yakın üst sırada hedef sırası seçin. Kanat 60 bp Giriş dizisi içinde hiçbir uygun hedef site varsa, en fazla 100 sorgu sırası genişletin bp (Yani 50 bp istenen her iki tarafında düzenleme).
- Bir kaynaktan, örneğin synthego, aşağıdaki özelliklere sahip bir 20-mer hedef sgRNA elde etmek: 3 nmol; modifikasyon yok.
- Aldıktan sonra liyofilize sgRNA tüp, içeren santrifüj kapasitesi > 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk için. Tüp TE nükleaz Ücretsiz 60 µL ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı kullanarak 15 - 20 kez P200 pipet pipetting tarafından yeniden askıya. Son 50 µM bölgedir.
2. homoloji-yönetmen onarım şablon tasarımı
- Bir ssODN HDR şablonu içeren tasarım: 1) faiz mutasyon, 2) bir benzersiz çerçeve kısıtlama endonükleaz sitesi, birini veya her ikisini NGG PAM dizisi içinde Gs sessiz 3) bir mutasyon ve ilk ve son mutasyon kanat 4) 50 bp 5' 3' homoloji silah. (Şekil 1 c) 9 , 10.
- Mutasyon NGG PAM sırası mümkün değilse, 5-6 sgRNA-aracılı bölünme ssODN HDR şablonunun önlemek için sgRNA hedef tanıma dizisi içinde sessiz mutasyonlar tanıtmak.
- Bir kaynaktan, örneğin idtdna, bir "Ultramer DNA Oligonükleotid" aşağıdaki parametrelerle elde etmek: Ölçek: 4 nmol; Formülasyon: None; Arıtma: Standart Desalting.
- Aldıktan sonra liyofilize ssODN tüp, içeren santrifüj kapasitesi > 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk için. Yavaşça ssODN 100 µM son bir konsantrasyon için GKD nükleaz ücretsiz2içinde O 15 - 20 kere P200 pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya alma.
3. tasarım Genotipleme astar
- ~ 400-700 bp PCR amplicon11oluşturmak için genom değişiklik kanat ayarla bir astar tasarım.
- PCR bisiklet koşullarını tek ve belirli amplicon11üretmek için en iyi duruma getirme.
4. enjeksiyon karışım hazırlamak
- Tablo 1 reaktifler 4 ° C'de 2 min için maksimum hızda santrifüj kapasitesi
- Listelenen sırayla Tablo 1 reaktifler bir nükleaz ücretsiz PCR tüp ekleyin.
- Yavaşça aşağı yukarı 10 kez P20 pipet ile pipetting tarafından iyice karıştırın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika için enjeksiyon karışımı kuluçkaya.
5. enjeksiyon Protokolü
- Yük enjeksiyon micropipette yaklaşık yarısı enjeksiyon ile12karıştırın. Enjeksiyon iğne takunya ya da tatili halinde enjeksiyon mix kalan kaydedin.
- Yavaş yavaş akan çözüm12~ 20-30 psi üretir micropipette ipucu break.
Not: Büyük çap ipuçları olumsuz hayvan sağlığını etkileyen ve F1 döl verim azaltın. - 10-15 genç enjekte yetişkin solucanlar her iki eşey kollarında mümkünse12. Eğer değilse, bir eşey kol içine enjeksiyon yeterlidir.
- Oda sıcaklığında 1-2 h için kurtarmak enjekte hayvanlar (P0) 35 mm OP50 numaralı seribaşı nematodunun büyüme medya (NGM) plaka üzerinde izin. Daha sonra bireysel OP50 numaralı seribaşı 35 mm NGM tabak Platin tel solucan kullanarak tek enjekte P0 hayvanlara12seç.
6. ekran P0 plakaları ve tek mCherry(+) F1s
- İki gün sonrası enjeksiyon, F1 döl mCherry floresan stereomicroscope kullanarak yutak olarak ifade içeren P0 plakaları tanımlamak (şekil 1 d, gün 2 - 3). En mCherry(+) F1 hayvanlar içeren üç P0 plakaları seçin.
- Her üç seçili P0 plakalar, 8-12 mCherry(+) F1 hayvanlar 24-36 mCherry(+) F1s bir solucan kullanarak toplam tek seçin (şekil 1 d, gün 2 - 3).
Not: mCherry(-) hayvan-da var saydı P0 tabakları, ancak doğru bir şekilde belirlenmesi olasılığını hayvanlar çok düzenlenmiş (şekil 2A) daha düşük. - Bireysel F1ler Self-fertilize ve oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca yumurtlamak izin verir.
7. tek solucan PCR ve Genotipleme
- 1-2 gün sonra yumurta atma, F1s 7 µL solucan lizis bir solucan pick (Tablo 2, şekil 1 d, gün 4-5) kullanarak arabellek içeren bireysel PCR şerit tüp kapakları aktarın.
- Santrifüj PCR tüpleri tüp altına hayvan getirmek ve tüpler için 1 h-80 ° C'de dondurmak için oda sıcaklığında 1 dk. için maksimum hızda.
Not: Worms-80 ° C'de süresiz olarak saklanır. - Aşağıdaki programı kullanarak bir thermocycler de donmuş solucan parçalayıcı: 4 ° C 60 ° C 60 dk, 15 dk, 95 ° C için tutun.
- Tablo 3' te gösterilen kurulum PCR mastermix.
- 21 µL PCR mastermix temiz PCR tüpler içine ekleyin ve sonra adım 3 4 µL solucan lizis ekleyin. İyi bir pipet kullanarak mix ve ( Malzeme tabloyabakın) üreticileri yönergeleri izleyerek PCR programını çalıştırın.
- Üreticinin yönergelerini izleyerek bir DNA temiz ve konsantre kit kullanarak PCR reaksiyonları arındırmak ( Malzeme tabloyabakın). DNA spin sütun 10 µL su ekleyerek elute.
- Tablo 4' te gösterildiği gibi set-up restriksiyon enzimi mastermix.
- Restriksiyon enzimi mastermix 10 µL temizlenmiş her PCR reaksiyon ekleyin ve 1-2 h 37 ° C13için kuluçkaya.
- Ayrı 120 V 1 x Tris-asetat-EDTA (TAE) arabellek14kullanarak çalıştırmak % 1.5 özel jel PCR ürünleri sindirilir.
8. kimlik ve sıra doğrulama düzenlenen hayvan
- Potansiyel hayvanlar14 (şekil 1 d, 4-5 gün) düzenlenmiş belirtmek bantları varlığı için sindirilmiş enzim örnekleri inceleyin.
Not: Grup boyutu ve/veya desenleri bantlama beklenmedik ve karmaşık restriksiyon enzimi sindirim nöbetleşe olarak gözlenen potansiyel Indel mutasyonlar tanımlamak için bir N2 denetimini yükleyin. - Potansiyel düzenlenen hayvan belirlenmesi sonra solucan lizis kalan 3 µL kullanın ve PCR reaksiyon tekrarlayın. Temiz mi veya restriksiyon enzimi sindirmek PCR reaksiyon program tamamlandıktan sonra. PCR reaksiyon % 1'özel jel, ayrı olarak yüklemek ve bir jel ekstraksiyon kiti15 kullanarak Grup ayıklamak ( Malzeme tabloyabakın).
- Sanger sıra16 jel doğru düzenlenmiş hayvanlar (şekil 1A) tanımlamak için F1 astar kullanarak DNA elde
Not: okuma içerir Heterozygote doruklarına vahşi türü varlığı nedeniyle overlaid ve alleli tasarlanmış. - Homozigoz hayvanlar doğrulanmış heterozigoz düzenlenen hayvanlardan, tek 8-12 F2 hayvanlar almak ve 7-8 adımları gerçekleştirmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutasyonların insan süperoksit dismutaz 1 (SOD1) ailesel amyotrofik lateral skleroz, felç ve ölüm17' ye kaçınılmaz götüren bir yıkıcı nörodejeneratif hastalık ~ 10-%20 hesabı. İnsan SOD-%1 55 kimlik ve % 70 benzerlik C. elegans SOD-1 protein ile (şekil 1B) paylaşımı örümceklerle korunmuş bir proteindir. Basitlik, fizibilite ve CRISPR-Cas9 RNP dayalı yaklaşım verimliliğini göstermek için C. elegans çimen-1 gen hastalık ilişkili insan G93A varyantı solucan genom (şekil 1A) içinde tanıtmak için hedef.
C. elegans genom G93A mutasyon mühendisi, bir sgRNA olan PAM tanıma sitesi 3 oturur seçildi kan basıncı upstream in G93 kodon (şekil 1 c). Biz bir ssODN HDR onarım şablonu içeren tasarlanmıştır: G93 kodon A93 için dönüştürmek için 1) nükleotit değişiklikleri (GGA GCA), NGG PAM sessiz 2) bir değişiklik sıra (CGG CAG) sgRNA-Cas9-aracılı bölünme HDR şablonunun sessiz 3) bir mutasyon (CT) önlemek için bu benzersiz bir HindIII restriksiyon enzimi site Genotipleme ve 4 için tanıttı) 50 bp 5' 3' homoloji silah (şekil 1 c). PCR astar seti (F1-R1) bir tek 592 bp PCR ürünü N2 denetimlerindeki (şekil 1A) üretmek için tasarlanmıştır. SgRNA içeren bir enjeksiyon karışım, Cas9, ssODN ve floresan marker plazmid (pCFJ90) birlikte karışık, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ve mikroenjeksiyon pipet yüklü.
Enjeksiyon karışımı bir enjeksiyon micropipette yüklendikten sonra şekil 1 d iş akışı gösterilmektedir. Gün 0, 10-15 P0 hayvanlar standart mikroenjeksiyon tekniği18,19kullanarak bir veya her iki erbezi kollarında enjekte edildi. Enjekte hayvan 1-2 h için yeniden elde etmek ve daha sonra tek tek OP50 numaralı seribaşı NGM Tabaklarda kaplama. 2-3 gün sonra başarılı P0 enjeksiyonları bu mCherry(+) F1 döl olan tarafından tespit edilmiştir. En iyi üç P0 tabak (Yani bu mCherry(+) F1s en fazla olan) daha sonraki analiz için seçilmiştir. Bu üç tabak (P0-8, P0-10, P0-12) herbirinden 8 mCherry(+) F1s saydı OP50 numaralı seribaşı bireysel 35 mm NGM tabak 24 mCherry(+) F1s toplam için. (Gün 4 - 5) yumurta atma 2-3 gün sonra bireysel F1s solucan lizis arabellek içeren PCR tüpler içine transfer ve-80 ° C'de 1 h için dondurulmuş Daha sonra F1s, genomik DNA kurtarmak için lysed ve PCR için tabi. PCR ürünleri o zaman saf ve HindIII ile 1 h için sindirilmiş ve üzerinde % 1.5 özel jel hayvan potansiyeli tanımlamak için düzenlenmiş çalıştırın. Doğru düzenlenmiş hayvanlarda HindIII sindirim tam uzunlukta PCR ürünü keser (592 bp) 370 iki grup içine kan basıncı ve 222 bp. Bu Genotipleme strateji belirsizliğe yer bırakmadan vahşi-türü arasında ayırır (592 bp), heterozygote (592, 370, 222 bp) ve homozigot (370, 222 bp) hayvanlar. Şekil 2A 24 mCherry(+) hayvanlar için Genotipleme sonuçları göstermektedir.
Floresan mCherry işaretçisi genom değiştirilmek üzere zenginleştiren göstermek için de 8 mCherry(-) hayvanlardan her üç P0 plakaların aldı. Ekranlı 24 mCherry(+) F1s (kırmızı çubuk), 10 allelic mono veya bi-allelic değişiklik (% 42), 10 edildi vahşi türü (% 42), bulunan 3 potansiyel indels (% 13) idi ve 1 PCR hatası (şekil 2A). Vahşi türü (% 96) 23 yaşından, buna ek olarak, ekranlı 24 mCherry(-) F1s sadece 1 hayvan doğru şekilde değiştirilmiş (%4); iken (Şekil 2A). Şekil 2B Kromatografik üzerinden tam uzunlukta ayıklanan PCR ürünü (F18-6) jel, kesin nükleotit değişiklikler ssODN HDR şablonu tasarladığınızı gösteren bu homozigoz F genom sadakatle dahil gösterir 1 hayvan. Özellikle, F1 hayvanlar 10-7, 10-8 ve 12-3 beklenmeyen PCR ürün boyutları ve kısıtlama Özet bantlama desenleri, bu hayvanların karmaşık Indel mutasyonlar (şekil 2A) taşıyabilir düşündüren sergiledi. Böylece, bizim yöntem sadece kolaylık, verimlilik ve sadakat ile istenen genom tüm değişiklik(ler) üretme yeteneğine sahip değil, ama aynı zamanda kimlik ve gen işlevi önemli ve beklenmedik içgörü dökmek benzersiz Indel allelleri kurtarılması izin verir.
Resim 1 . CRISPR-Cas9 mühendislik C. elegansçimen-1 locus. (A) C. elegans çimen-1 locus exon-intron yapısı gösteren şematik. Kırmızı çubuk G93 konumda exon 3 gösterir. Astar çifti set Kırmızı oklar (F1-R1) tarafından belirtilmektedir. (B) sıra insan ve C. elegans (solucan) SOD-1 proteinler. Hedeflenen G93 kalıntı kırmızıyla vurgulanır. (C) Top, genomik DNA G93 kodon çevreleyen bir bölümünü bir referans olarak gösterilir ve PAM (yeşil) ve sgRNA (mavi) hedef siteleri vurgulanır. Alt, tek telli Oligonükleotid (ssODN) homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonu içeren gösterilir: bir sessiz A93, sgRNA-Cas9 kompleksi tarafından bölünme önlemek için PAM motifi sessiz bir değişiklik için G93 değiştirme kodon Düzenle değiştirmek için benzersiz bir HindIII restriksiyon enzimi sitesi (sarı kutu) tanıtmak ve 5' ve 3' 50 bp homoloji kanat (siyah çubuklar) silah. SsODN tasarlanmış tüm nükleotid vurgulanan kırmızı değişikliklerdir. (D) üretmek ve CRISPR-Cas9 RNP-esaslı nokta mutantlar tanımlayan boru hattı şematik gösterimi. Gün 0, 10-15 P0 hayvanlar enjeksiyon karışımı enjekte et. Gün 2-3, floresan F1 döl içerenler tarafından başarılı bir şekilde enjekte P0 hayvanlar belirlemek ve üç P0 pilakalar ve en floresan döl seçin. Her üç P0 plakaların 8 Floresan F1 döl tek. Gün 4-5, (a) adım 1, bireysel F1s aldı ve lizis arabellek içeren PCR tüpler içine yerleştirilir; (b) adım 2,-F1 solucan içeren PCR tüpleri-80 ° C'de dondurma sonra lysed-PCR şablon olarak kullanılır genomik DNA serbest bırakmak için. PCR ürünlerinin sonra temizlenir ve benzersiz restriksiyon enzimi ile sindirilmiş; (c) adım 3, sindirilmiş enzim nerede vahşi ürünler üzerinde bir özel jel çözüldü türü (+/ +), heterozigoz (m / +), ve homozigoz (m/m) hayvan desenleri bantlama kısıtlama digest tarafından belirlenebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Genotipleme veri için çimen-1 (G93A) mutantlar. (A) F görüntüsünü jel tek tek edildi 1 hayvanlar lysed, PCRed ve HindIII ile sindirilir. Her P0 için levha (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) ve 8 mCherry(-) F1 hayvanlar analiz edildi. Mono-allelic (mavi rakam) ve bi-allelic (kırmızı numaraları) düzenlenen hayvan ele geçirildi. Boyutu PCR ürünleri veya Indel mutantlar (sarı numaraları) işaret etmektedir sindirilir bantları da ele geçirilmiştir gizemli HindIII değiştirdi. N2 denetimleri PCR ürünü boyutlandırma ve enzim özgüllük için bir başvuru olarak gösterilir. (B) üst, kodon aralığı ve amino asit çevirileri vahşi türü (WT) için yukarıda gösterilen ve aşağıda ipliklerini G93A için değiştirilebilir. İstenen düzenleme kırmızı bir kutuyla vurgulanır ve bir çerçeve HindIII kısıtlama sitesi oluşturmak sessiz değişiklikler sarı bir kutuyla vurgulanır. Tüm tasarlanmış nükleotit değişiklikler kalın olarak gösterilir. Alt, temsilcisi Kromatografik homozigoz F1 hayvan 8-6 dan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Reaktif | Birim | Son konsantrasyonu |
| GKD2O | 6.3 μL | ---- |
| KCl (4M) | 0,94 μL | 300 mM |
| HEPES (0.5M) pH 7.4 | 0.5 μL | 20 mM |
| pCFJ90 (25 ng/μL) | 1,25 μL | 2.5 ng/μL |
| ssODN (500 ng/μL) | 1,25 μL | 50 ng/μL |
| sgRNA (50 mikron) | 1,25 μL | 5 MİKRON |
| Cas9 (61 mikron) | 1.03 μL | 5 MİKRON |
| Son hacim | 12.5 μL | ---- |
Tablo 1. CRISPR-Cas9 RNP enjeksiyon Mix. Tüm reaktifler GKD nükleaz ücretsiz2' O. ücretsiz teknikleri reaktifler işlerken ve enjeksiyon karışım yaparken kullanılan gerekir RNase yeniden askıya alınmış olmalıdır.
| Reaktif | [Final] |
| KCl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| NP-40 | % 0.45 |
| Ara-20 | % 0.45 |
| İndinavir K | 1 mg/mL |
Tablo 2. Solucan lizis arabellek tarifi. İndinavir K taze her kullanımdan önce eklenmesi.
| Reaktif | 1 x | 24 x |
| 2 x Q5 Mastermix | 12.5 μL | 300 μL |
| Astar F1 (10 mikron) | 1,25 μL | 30 μL |
| Astar R1 (10 mikron) | 1,25 μL | 30 μL |
| Solucan lizis | 4 μL | ---- |
| GKD2O | 6 μL | 144 μL |
| Son hacim | 25 μL | 504 μL |
Tablo 3. PCR Mastermix. PCR mastermix-var karışık çözüm homojen olana de pipetting tarafından. 21 µL PCR mastermix temiz PCR tüpleri için eklenmelidir ve sonra 4 µL in bireysel kurt lysate düzgün etiketli tüpler eklenmelidir.
| Reaktif | 1 x | 24 x |
| Enzim arabellek x 10 | 2 μL | 48 μL |
| Temizlenmiş PCR reaksiyon | 10 μL | ---- |
| GKD2O | 7 μL | 168 μL |
| Restriksiyon enzimi (10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
| Son hacim | 20 μL | 240 μL |
Tablo 4. Restriksiyon enzimi Mastermix. Restriksiyon enzimi mastermix çözüm homojen olana de pipetting tarafından karışık olması. Restriksiyon enzimi mastermix 10 µL temizlenmiş PCR ürünü 10 µL için eklenmelidir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR-Cas9 sistemi tam olarak canlılar genom değiştirmek için güçlü ve etkili bir araçtır. Burada, biz o chimeric sgRNAs20 ssODN HDR şablonları etkinleştir ile yüksek verimli üretimi C. elegansgenomik noktası mutasyonların birleştiğinde göstermek. Önemlisi, biz floresan bir eş seçimi marker olarak kullanıldığında RNP teslim yüksek Düzenleme verimliliği üreten göstermek kolaylık ve güvenilirlik-in teknik vurgulayarak.
C. elegans genom mühendisliği için CRISPR-Cas9 yöntemleri çoğunluğu belirli genetik arka planlar veya co-CRISPR stratejileri1itimat. Co-CRISPR yöntem başarılı genom düzen elde etme olasılığını artırır son derece yararlı bir araç olduğu ispatlanmıştır. Ancak, faiz genom düzenleme için zenginleştiren bir işaretleyici locus fenotip seçilebilir bir Düzenle tanıtımı co-CRISPR yöntemler gerektirir. Güçlü, seçilebilir fenotip taşıyan mutasyonlar tanıtımı düzenlemek için zorlanma veya istenen nokta mutasyon kendisi ilgi şiddetlenir bırakılabilecek veya marker fenotip tarafından bastırılmış fenotipleri sergileyen Eğer istenmeyen olabilir. Ayrıca, co-CRISPR stratejileri hedef kapalı efektleri için katkıda bulunabilir bir işaretleyici locus bir ek Çift Kişilik strand sonu oluşturma gerektirebilir. Burada, uygun genom düzenlemeleri için sadece başarıyla enjekte P0 hayvanlar tanımlanmasını sağlar, ama aynı zamanda zenginleştiren geçici bir floresan işaretçi kullanan bir yöntem mevcut. Bu yöntem önemli ölçüde floresan hayvanlar ile karşılaştırıldığında başarıyla düzenlenmiş hayvanlar için zenginleştirir ve birkaç farklı avantajlar sağlar bizim veri göstermek: 1) sadece bir siteye özgü sgRNA hedefleme gereklidir, 2) bir Cas9 5-fold azalma ve sgRNA konsantrasyonu, 3) zorlanma ve fenotip seçimi bağımsızlık ve 4) nominal tarama iş yükünü (~ 24 F1s). Sağlam CRISPR-Cas9 genom F1 üretimi düzenleme bu yöntemi kullanarak gözlendi. Özellikle, açıklanan PCR-kısıtlama enzim tabanlı algılama strateji mono ve BI allelic düzenlenen hayvan kesin tespiti F1 nesil sağlar. Son olarak, Genotipleme strateji PCR grubu ne zaman vardiya olarak görülebilir potansiyel Indel mutasyonlar tanımlaması kolaylaştırır olmayan olan N2 kontrollere, göre kısıtlama Özet veya verim karmaşık duyarlı ne zaman bantları sindirilir.
Advent yeni nesil hastalığı21ile ayırmak genomik türevleri tanımlaması büyük ölçekli genomik çabaları ile birleştiğinde sıralama hız kazandı. Ancak, patojen işlevsel testleri türevleri çoğunluğu için hücresel ve organizma modeli sistemlerinde gösterilmiştir değil. Bu çalışmada, yaygın olarak okudu tanıtmak C. elegans çimen-1 geni hedef ALS ilişkili SOD-1G93A mutasyon. Bugüne kadar bu mutasyon edilmiş modellenmiş ve C. elegans ve öncelikle transgenik overexpression kullanarak fare okudu. Overexpression hayvan modellerinde versiyonlarının anahtar hücresel özetlemek, hastalık, moleküler ve davranışsal yönleri 'doz' fenotipleri22belirlemede cezayı bir faktör olduğunu giderek açık olsa da. Örneğin, mutasyona uğramış insan SOD-1 gen kopyalarını ~ 24 taşıyan yüksek kopya SOD-1 numaralıG93A fareler sadece ~ 8-10 kopya23,24taşımak SOD-1G93Adl fareler için karşılaştırıldığında büyük ölçüde hızlandırılmış hastalığı sahası sergi. Burada, biz bizim CRISPR Cas9 RNP-tabanlı yöntemi transgenik overexpression, daha doğrusu genetik çoğaltmak için bir çaba gerek kalmadan insan değişken ilişkili mutasyonlar orthologous solucan gen hızla oluşturmak için kullanılması gereken göstermek hastalığı bağlamında. Bizim yöntem üretmek ve genomik değişik-in bilinmeyen önemi endojen düzenleyici denetimi ve overexpression sınırları engellemektedir ifade bağlamında test etmek için uygun bir platform sağlar. Son olarak, biz de türevleri protein yerelleştirme, toplama ve ciro etkilemesi görüntülenmesi için ek bir araç sağlar (Yani GFP), floresan proteinler ile endojen gen etiketlemek için bu yöntemi kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz üyeleri Beg laboratuvar bu el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Beg laboratuvar araştırma hibe tarafından NIH (R01 NS094678) ve Musküler Distrofi Derneği (MDA382300) A.A.B. için desteklenir
Acknowledgments
Bu raporla ilgili hiçbir çatışması vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
