Summary
Här presenterar vi ett protokoll som syftar till att analysera genome-wide bindningen av oligodendrocyte Transkriptionfaktorn 2 (Olig2) i akut renat hjärnan oligodendrocyte föregångare celler (OPCs) genom att utföra låg-cell kromatin immunoprecipitation (ChIP) , bibliotek förberedelse, hög genomströmning sekvensering och bioinformatiska dataanalys.
Abstract
I däggdjursceller regleras gentranskription i en cell typ specifika sätt interaktioner transkriptionell faktorer med genomiskt DNA. Härstamning-specifika transkriptionsfaktorer anses spela avgörande roller i cell specifikation och differentiering under utveckling. ChIP tillsammans med hög genomströmning DNA-sekvensering (ChIP-seq) används ofta för att analysera genome-wide bindningsställen transkriptionsfaktorer (eller dess associerade komplex) genomisk DNA. Det krävs dock ett stort antal celler för en standard ChIP reaktion, vilket gör det svårt att studera det begränsade antalet isolerade primära celler eller ovanlig cellpopulationer. För att förstå den reglerande mekanismen av oligodendrocyte härstamning-specifika transkription faktorn Olig2 i akut renad mus OPCs, en detaljerad metod med ChIP-seq för att identifiera genome-wide bindande platser för Olig2 (eller Olig2 komplexa) visas. Det första protokollet förklarar hur att rena trombocyt-härrör tillväxtfaktor receptor alfa (PDGFRα) positiva OPCs från mus hjärnor. Nästa, Olig2 antikropp medierad ChIP och bibliotek konstruktion utförs. Den sista delen beskriver bioinformatisk programvara och förfaranden som används för Olig2 ChIP-seq analys. Sammanfattningsvis rapporterar detta papper en metod att analysera genome-wide bindningar av transkriptionell faktor Olig2 i akut renat hjärnan OPCs.
Introduction
Det är viktigt att studera protein (eller proteinkomplex) DNA bindningar och epigenetiska märken att bygga transkriptionell regleringsnät inblandade i olika biologiska processer. Särskilt, kan bindningarna av transkriptionsfaktorer i genomisk DNA spela en viktig roll i genreglering, celldifferentiering och vävnad utveckling. Ett kraftfullt verktyg för att studera Transkriptionsreglering och epigenetiska mekanismer är kromatin immunoprecipitation (ChIP). På grund av de snabba framstegen i den nästa generations sekvensering teknologin används ChIP tillsammans med hög genomströmning DNA-sekvensering (ChIP-seq) för analyser av protein-DNA bindningar och epigenetiska märken1. Ett standardprotokoll för ChIP-seq kräver dock cirka 20 miljoner celler per reaktion, vilket försvårar tillämpningen av denna teknik när cellen är begränsade, såsom isolerade primära celler och sällsynta cellpopulationer.
Oligodendrocyte härstamning celler inklusive oligodendrocyte föregångare celler (OPCs) och oligodendrocyter distribueras i hela hjärnan och är en förutsättning för utveckling och funktion av hjärnan. Som en typ av prekursorceller klarar OPCs av både självförnyelse och differentiering. OPCs inte bara fungera som stamfäder för oligodendrocyter men också en viktig roll i spridningen av nervcellernas signalering genom att kommunicera med andra typer av hjärnans celler2. Tidigare studier har föreslagit att oligodendrocyte utveckling är reglerat av härstamning-specifika transkriptionsfaktorer såsom Olig2 och Sox103,4. Dessa transkriptionsfaktorer konstaterades för att binda till promotorn eller enhancer regioner i vissa avgörande gener att påverka deras uttryck under oligodendrocyte specifikation och differentiering. Men är det utmanande att identifiera DNA-binding protein (eller proteinkomplex) intresset för akut renat primära OPCs med ett mycket begränsat antal celler.
Det här protokollet beskriver hur man systematiskt undersöka den genomiskt DNA-immunoprecipitated av Olig2 i renad mus OPCs genome-wide skala med ChIP-seq teknik. OPCs från mus hjärnor var akut renas genom immunopanning och används i ett ChIP experiment utan spridning in vitro. Ett begränsat antal OPCs kan erhållas genom immunopanning och är otillräcklig för standard ChIP-seq experiment. Häri, är en låg-cell ChIP-seq protokoll med så lågt som 20 tusen celler per ChIP reaktion för transkriptionsfaktorer beskriven. I korthet, var tvärbundna celler lyserat och sonicated av en ultraljudsbehandling enhet vill skeva kromatinet. Klippt kromatinet var inkuberas med Olig2 antikroppar samt protein A-belagd pärlor för att fällningen Olig2 antikropp bunden genomiskt DNA. Efter eluering från protein A-belagd pärlor och omvänd cross-linking renades genomiskt DNA fälls ut av Olig2 antikroppar av fenol-kloroform extraktion. Den resulterande produkten var kvantifieras och utsätts för T-tailing, primer glödgning mall växling och förlängning, tillägg av adaptrar och förstärkning, bibliotek storlek urval och rening steg för ChIP-seq bibliotek konstruktion.
Efter sekvensering analyserades kvaliteten på de raw-läsningar från både provet beredd med Olig2 transkription faktor antikropp och kontrollprovet. Låg kvalitet baspar och adapter som innehåller Läs fragment var putsade. Nästa, trimmade läsningar anpassades till mus referens genomet. Genomisk Regionkommittén som var avsevärt berikad för ChIP läsningar, jämfört med stickprovet, identifierades som toppar. Betydande toppar, som representerar potentiella transkription faktorn bindningsställen, var filtreras och visualiseras i en genomet webbläsare.
Särskilt kan den metod som beskrivs i detta protokoll användas i stort sett för ChIP-seq av andra transkriptionsfaktorer med vilken celltyp i begränsat antal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur användning och experimentella protokoll var utförts enligt guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur och godkänts av den institutionella biosäkerhet och djur välfärd kommittén vid University of Texas Health Science Center vid Houston.
1. rening av PDGFRα positiva Oligodendrocyte härstamning celler från mus hjärna (modifierad från tidigare beskrivna immunopanning protokoll5,6,7)
-
Förberedelse av en immunopanning platta för PDGFRα positiva cellmarkeringen och 2 plattor för utarmning av endotelceller och mikroglia.
Obs: Observera att petriskålar men inte cell kultur rätter fungerar för immunopanning experiment; om renat cellerna kommer att användas för odling, måste immunopanning steg utföras i biosäkerhet skåp- Coat en 10 cm Petri tallrik med 30 µL get anti råtta IgG i 10 mL pH 9,5, 50 mM Tris-HCl över natten vid 4 ° C. Agitera plattan att se till att ytorna på plattorna är jämnt och helt omfattas av beläggning lösningen.
- Förbereda PDGFRα antikropp lösning genom att späda 40 µL av råtta anti-PDGFRα antikroppen med 12 mL Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) som innehåller 0,2% BSA.
- Efter 3 tvättar av IgG belagda platta med 10 mL Inkubera 1 x DPBS varje, IgG-belagd plåt med PDGFRα antikropp lösning vid rumstemperatur i 4 h.
- Tvätta råtta anti-PDGFRα antikropp belagda plattan 3 gånger med 10 mL 1 x DPBS varje. Lägg försiktigt till DPBS lösning längs sidovägg av plattan och stör ej belagda ytor.
- Coat 2 nya 15 cm Petri plattor för utarmning av endotelceller och mikroglia med 20 mL DPBS innehåller 2,3 µg/mL Banderiaea simplicifolia lektin 1 (BSL-1) för 2 h.
- Tvätta den BSL-1 belagda plattor 3 gånger med 20 mL 1 x DPBS. Lägg försiktigt till DPBS lösning längs sidovägg av plattorna och stör ej belagda ytor.
-
Rening av PDGFRα positiva oligodendrocyte härstamning celler ändras från tidigare publicerade metoder6 , 7 , 8.
- Dissekera kortikala vävnader från 2 postnatal dag 7 (P7) mus brains enligt tidigare publicerade protokoll5,6.
- Separera vävnader för att generera en encellig suspension med nervvävnad dissociation Kit (P) enligt detaljerade anvisningar.
- Kort, skär dissekerade kortikala vävnader i bitar med en skalpell och utsätta dem för enzymatisk nedbrytning vid 37 ° C. Efter matsmältningen, manuellt dissociera bitar med eld-polerat glas Pasteur pipetter till en enskild cell suspension.
- Centrifugera encelliga suspensionen vid 300 x g under 10 minuter vid rumstemperatur och avbryta cellpelleten med 15 mL immunopanning buffert (immunopanning buffert är DPBS med 0,02% BSA och 5 µg/mL insulin).
- Inkubera encelliga suspensionen från 2 mus hjärnor sekventiellt på 2 BSL-1 belagda plattor under 15 minuter vid rumstemperatur med försiktig skakning av plattan var 5 minut för att säkerställa en bättre uttömning av mikroglia och endotelceller.
- Snurra försiktigt på plattan för att samla in icke-anhängare cellerna i cellsuspensionen och inkubera dem på råtta-PDGFRα antikroppsbelagda plattan för 45 min i rumstemperatur.
- Efter inkubering av cellsuspensionen på råtta-PDGFRα antikroppsbelagda plattan, försiktigt snurra på plattan för att samla in cellsuspension, och skölj plattan 8 gånger med DPBS bli av icke-anhängare celler. Försiktigt lägga tvättlösning längs sidovägg av plattan och agitera plattan flera gånger för att bli icke-anhängare celler.
- Lossa cellerna från råtta-PDGFRα antikropp belagda plattan med 4 mL cell avlossning lösning behandling under 10 minuter vid 37 ° C. Skaka plåten för att få bort fastsittande celler.
- Samla in de renade OPCs genom centrifugering vid 300 x g rumstempererat, centrifugerade cell med 2 mL OPC cellodlingsmedium och räkna cellerna med hjälp av trypan blå och en hemocytometer (500 mL cellodlingsmedium är DMEM/F12 medium innehållande 5 mL penicillin-streptomycin lösning (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 µg/mL insulin, 0,1% BSA, 20 ng/mL bFGF och 10 ng/mL PDGFRα).
-
Validering av renheten av OPCs efter immunopanning.
- För att utvärdera anrikningen av OPCs efter immunopanning, använda en del av de renade OPCs för RNA-extraktion med en guanidium kaliumtiocyanat baserat extraktion enligt tillverkarens anvisningar.
- Utföra qRT-PCR med fluorescerande grön dye master mix för att kontrollera för anrikningen av PDGFRα uttryck i renat OPCs jämfört med dissocierade hjärnceller enligt den tidigare publicerade material4.
- Dessutom frö några renat OPCs i den Poly-D-lysin belagda 24 väl plattor för immunfärgning med anti-NG2 chondroitin sulfate proteoglykan (NG2) antikropp som tidigare publicerat material9.
2. låg-cell flisa förberedelse och ChIP bibliotek konstruktion för High-Throughput sekvensering
-
Olig2 låg-cell flisa preparationen med ett kommersiellt tillgängliga ultraljudsbehandling system och ett kommersiellt tillgängliga låg cellantal ChIP kit (se tabell för material) genom att följa de detaljerade standardförfaranden från tillverkarens anvisningar.
- Efter frånkoppling från en råtta anti-PDGFRα satt antikroppsbelagda plattan och cellen räknar med trypan blått och en hemocytometer 20.000 renat OPCs i cellodlingsmedium i 1 mL OPC för varje ChIP reaktion.
- Tillsätt 27 µL av 36,5% formaldehyd fixar cellsuspension i 10 min i rumstemperatur.
Försiktighet: Observera att formaldehyd måste användas i den kemiska dragskåp av säkerhetsskäl. - Stoppa DNA-protein cross-linking med 50 µL 2,5 M glycin för 5 min i rumstemperatur.
Obs: Alla åtgärder måste utföras på is eller i 4 ° C kallt rum från denna punkt. - Tvätta tvärbunden cell pellets med 1 mL av iskall Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) med proteashämmare cocktail och få celler pelleterat av en nedkylda Centrifugera vid 300 x g vid 4 ° C.
- Lysera cellpelleten i 25 µL komplett lyseringsbuffert för 5 min på is.
Obs: Skaka röret att avbryta cellerna i lyseringsbuffert. - Komplettera cellen lysate med 75 µL iskall HBSS innehållande proteashämmare cocktail och skjuvning kromatinet i cell lysate av pre kyls ultraljudsbehandling system med 5 cykler av 30 s ON och 30 s OFF programmet. Alltid Sonikera 6 rör ihop och kontrollera balans rören innehåller 100 µL vatten.
- Efter klippning, Centrifugera 14 000 x g i 10 min 4 ° C och samla supernatanten i en ny tub efter centrifugering.
- Späd 100 µL av klippt kromatin med lika volym iskall komplett ChIP buffert med en proteashämmare.
- Spara 20 µL av det utspädda klippt kromatinet som Input kontrollprov.
Obs: Input kontrollprov krävs också som jämförelsen till Olig2 immunoprecipitated prov att identifiera Olig2 antikropp immunoprecipitated DNA. - Lägg till 1 µL kanin-anti-olig2-antikropp till 180 µL utspädda klippt kromatin och inkubera reaktionsröret på ett roterande hjul på 40 rpm för 16 h vid 4 ° C.
Obs: Utföra detta steg i ett kallt rum. - För varje ChIP reaktion, tvätta 11 µL magnetiska protein A-belagd pärlor med 55 µL pärlor tvättbuffert och sätta pärlan pellet i 11 µL pärla tvättbuffert efter 2 tvättar.
Obs: Utföra detta steg i ett kallt rum. - För varje ChIP reaktion, tillsätt 10 µL förtvättat Protein A-belagd pärlor i ChIP reaktionsröret. Utför det här steget om du i ett kallt rum.
- Inkubera ChIP reaktionsröret vid 4 ° C för en annan 2 h på ett roterande hjul.
- Pålagda magnetiska racket för 1 min ChIP reaktionsröret.
Obs: Utföra detta steg i ett kallt rum. - Avlägsna supernatanten och inte rubba pärla pelleten.
- Tvätta pärla pelleten med 100 µL för varje 4 tvätta buffertar respektive för 4 min på ett roterande hjul vid 4 ° C.
- Efter tvättar, tillsätt 200 µL eluering buffert i pärla pelleten och inkubera ChIP reaktionsröret vid 65 ° C i 4 h att vända korslänk protein-DNA.
- Dessutom lägga 180 µL av eluering buffert till 20 µL Input kontrollprov och inkubera vid 65 ° C under 4 h att vända korslänk protein-DNA också.
- Tillsätt 200 µL 25:24:1 (v/v) blandning av fenol, kloroform och isoamylacetat alkohol varje ChIP reaktionsröret.
- Vortex kraftigt i 1 min och centrifugera vid 13 000 x g i 15 min i rumstemperatur. Överföra den övre fasen till en ny tub.
- Tillsätt 40 µL 3 M natriumacetatlösning, 1000 µL av 100% etanol och 2 µL av glykogen fällningsmedel kovalent kopplad till ett blått färgämne till varje ChIP reaktionsröret övernattning på-20 ° C.
- Centrifugera vid 13 000 x g under 20 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten, tvätta med 500 µL kallt 70% etanol och centrifugera vid 13 000 x g i 20 min vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten, hålla pellet luften torr i 10 min och lös pelleten med 50 µL vatten.
-
ChIP bibliotek konstruktion för hög genomströmning sekvensering
- Rengör och koncentrera ChIP DNA med en sanering kit enligt tillverkarnas instruktioner.
- Kvantifiera ChIP provet genom en pico-grön enligt tillverkarens anvisningar.
- Använda ett ChIP-seq kit för T-tailing, replikering och tailing, mall växling och förlängning, tillägg av adaptrar och förstärkning, bibliotek storlek urval och rening enligt tillverkarens anvisningar.
- Efter denaturering av dsDNA, dephosphorylate 3' ände ssDNA av räkor alkaliskt fosfatas och Lägg till en poly (T) ssDNA genom terminal deoxynucleotidyl transferas.
- Glödga ssDNA mallen för DNA-replikation och mallen byta DNA Poly (dA) primern.
- Efter mall växling, förstärka ChIP-seq biblioteket med PCR med framåt och bakåt primers för indexering.
- Välj PCR amplifieras ChIP-seq bibliotek med fragment allt från 250 till 500 bp av paramagnetiska pärlor av alternativ 2 för dubbel storlek urval.
- Kontrollera kvaliteten på den valda ChIP-seq bibliotek använder en mikroflödessystem chip-kapillär elektrofores enhet.
3. dataanalys
- Förbereda katalogstruktur.
- Skapa en katalog för att utföra ChIP-seq dataanalys. Inuti den nyskapade katalogen, skapa sex underkataloger med följande namn: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis och rapporter.
- Förbereda data och utföra kvalitetskontroll analys av råsekvensdata.
- Flytta till katalogen ”raw.files” och hämta ChIP-seq datafilerna.
- Kontrollera filnamnen. Om sekvensering var ihopkopplade-slutet, det blir 4 filer (två för behandling) och två för input med liknande bas namn: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq och PDGFRα_input.read2.fastq. Om filnamnen är olika, byta namn på dem med kommandot ”mv”.
- Flytta till katalogen ”fastqc.output”.
- Erhålla kvalitetskontroll mätvärden från de raw-läsningar med hjälp av en fastq fil kvalitetskontroll programvara10. Använd kommandot i Figur S1A för att köra kvalitetskontrollprocessen separat för varje fastq-fil. Programvaran kommer att visa flera kvalitetskontroll mätvärden i en HTML-fil.
- Öppna HTML-kvalitetskontroll filen och kontrollera antalet läsningar, Läs längd, per bas sekvens kvalitet, per sekvens kvalitetsresultat, sekvens GC innehåll, sekvens dubbelarbete nivåer, adapter innehåll och kmer innehåll.
- Trim avslutande låg kvalitet läsningar och adapter innehåll.
- Observera ”Per bas sekvens kvalitet” och ”Adapter innehåll” tomter. Bestämma trimningslängd för både huvud och svans av varje Läs. En tillräcklig längd för trimning är där bas kvaliteten sjunker under 30 och det finns bevis för adapter innehåll.
- Flytta till katalogen ”raw.files”.
- Hämta och installera en programvara för trimning läsningar11. Använd kommandot i Figur S1B för putsning både behandling och ingången separat. Parametern 'Beskär' anger återstående Läs längden efter trimning baser från slutet och 'HEADCROP' anger antalet baser elimineras från början av Läs.
- Kommandot trimma även den minsta Läs längd accepteras efter filtrering i parametern 'MINLEN'. Om läser är minst 50 bp, användning 35 bp som Läs längd gräns.
- Flytta till katalogen ”fastqc.output”.
- Utföra fastq fil kvalitetskontroll analysen efter trimning läser. Verifiera att de kvalitetskontroll frågorna har lösts. Använd kommandot i Figur S1C för att erhålla kvalitetskontroll mätvärden.
- Justera den single-end eller Parade-end ChIP-seq läser till mus referens genomet.
- Flytta till katalogen ”bowtie.output” för mappning.
- Hämta GENCODE mm10 mus referens genomet. Byt namn på mm10 mus referens genomet som ”mm10.fa”.
- Hämta en Läs mapper12 och installera det i systemet.
- Skapa en indexfil av nedladdade referens genom kommandot i Figur S2A. Sex filer skapas automatiskt: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 och mm10.rev.2.bt2.
- Använd kommandot i Figur S2B att utföra justeringen och justera parametern ”-p” med antalet processorkärnor enligt dina systeminställningar. Om kör parad-end-läge, Visar parametrar ”-1” och ”-2” namnen på de trimmade fastq filerna.
Obs: Kartläggning utförs separat för behandling och input prover och utdata metriska loggfiler skapas för varje prov. - Ladda ner en programvara för att hantera filer i SAM format13 och installera det i systemet. Konvertera filen SAM arrangera i rak linje till en BAM fil med kommandot i Figur S2C.
- Erhålla kvalitetskontroll mätvärden av mappade läser innan topp kräver båda Parade-end behandling och kontroll prover.
- En av de viktigaste kvalitetskontroll mätvärden till adressen är det sekvensering djupet. Öppna filer ”log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt” och ”log.bowtie.PDGFRα_input.txt” i katalogen bowtie.output och kontrollera att antalet unikt mappade Läs par i varje prov är större än 10 miljoner.
- Flytta till katalogen ”homer.output”.
- Ladda ner en programvara för motiv upptäckten och nästa generations sekvensering analys14 och installera det i systemet.
- Skapa en katalog som heter ”tagDir”.
- Kontrollera etiketten clonality, använda kommandot avbildas i Figur S3A. Kommandot ”makeTagDirectory” kommer att generera fyra kvalitetskontroll utdata files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt och tagLengthDistribution.txt.
- Flytta till katalogen ”tagDir”.
- Kopiera filen ”tagCountDistribution.txt” i katalogen ”rapporter”.
- Flytta till katalogen ”rapporter”.
- Öppna filen tagCountDistribution.txt med ett kalkylprogram och skapa en bar tomt på antalet Taggar per genomisk position. Lagra histogram filen med namnet ”tag.clonality.xlsx”.
- Installera R programmering språk15 i systemet.
- I terminalen, skriv 'R' och tryck på ENTER för att komma åt programmeringsmiljön R.
- Hämta en R-paketet för bearbetning ChIP-seq data16 och installera den med hjälp av kommandot som avbildas i Figur S3B.
- Använda skriptet R i Figur S3C för att rita strand cross-korrelationen.
- Påvisande av toppar med en peak mapper.
- Flytta till katalogen ”macs2.output”. Ladda ner och installera en peak mapper17 i ditt system.
- Använda den funktionen ”callpeak” med behandlingen och kontrollera BAM filer som genereras i steg 3.4.6.
Observera: Andra parametrar inkluderar ”-f” för indatafilen format ”,-g” för genomet storlek ”,-namn” för att ange huvudnamnet för alla utdatafiler, och ”-B” för att lagra de fragment pileup i bedgraph format. Komplett topp ringer kommandot ingår i Figur S4A. Använd BEDPE för Parade-end prover. - Kontrollera att den topp mapparen genereras sex filer: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg och PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
- Öppna filen PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls att Visa kallas topparna, plats, längd, toppmötet position, pileup och peak anrikning mätvärden:-log10(pvalue), vik berikning och -log10(q-value).
- Filtrera och kommentera kallas toppar.
- Använda filen i föregående steg, filtrera resulterande toppar enligt fold berikning, p-värde och/eller q-värdet. För att besluta om tillräcklig filtrering tröskelvärden, göra en histogram komplott för att bestämma tätheten av varje mätvärde. Filtrera bort värden under en vald tröskel att få betydande toppar.
- Hämta mm10 svarta listan (regioner är kända att ha konstlat hög signal) och filtrera ut de ChIP-seq toppar som är inne i någon av de regionerna som artefakt.
- Skapa en säng-fil med filtrerade toppar som innehåller följande kolumner: kromosom, start, slut, peakID, mock och strand. Fylla kolumnen håna med en punkt ””. eftersom den inte används. I kolumnen strand in alla värden på ”+”. Spara filen säng som ”filtered.peakData2.bed”.
- Kopiera filen ”filtered.peakData2.bed” i katalogen ”rapporter”.
- Flytta till katalogen ”rapporter”.
- För att kommentera filtrerade toppar till en specifik gen region, Använd funktionen ”annotatePeaks” med säng filen skapats i föregående steg. Kommandot används visas i Figur S5A.
- Öppna filen ”filtered.annotatedPeaks.txt” med hjälp av en statistisk programvara.
- Filtrera resulterande toppar liggande i en intergenic region på avstånd större än 5 kb från en kommenterad TSS. Använd kolumnen ”avstånd till TSS” i filen som avståndet för filtrering. Förvara de filtrerade topparna i en excel-fil som heter ”5kbup.geneBody.peakData.txt”.
- Store den resulterande filtreras toppar i en bedGraph fil med kolumner: kromosom, start, slut och -log10(q-value). Döp filen till ”5kbup.geneBody.peakData.bedGraph”.
- Generera pamp filer för webbläsarens visualisering.
- Hämta och installera en programvara för genomet aritmetiska18.
- Hämta ett verktyg för att konvertera bedgraph till pamp och installera i systemet. Hämta filen 'mm10.chrom.sizes'.
- Använd kommandot i Figur S6A för att generera en pamp-fil.
- Hämta och installera en genomet webbläsare19 i systemet.
- Genomet webbläsaren och läsa in filen ”5kbup.geneBody.peakData.bigwig” för att visualisera de filtrerade betydande topparna och deras läge med avseende på kända gener.
- Motiv Sök.
- Flytta till katalogen ”motif.analysis”.
- Hämta ett de novo motiv skanning och motiv berikande program och installera den i din system20.
- Hämta en omfattande motiv-databas som innehåller motiv av Olig2.
- Få genomsekvenser 500 bp regioner centrerad vid betydande peak toppmöten. Lagra sekvenserna som peak.sequences.txt. Använd kommandot i Figur S7 för att söka efter Olig2 motiv inom var och en av Regionkommittén topp 500 bp.
- Filtrera de resulterande motiv med hjälp av en lämplig E-värde (standard = 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Låg-cell ChIP-seq framfördes och bioinformatiska analyser utfördes för att undersöka de potentiella interaktioner av transkriptionell faktor Olig2 med genomiskt DNA i akut renat hjärnan OPCs. Figur 1 visar en allmänna arbetsflödet för både de experimentella och data analys förfaranden. I detta protokoll, var postnatal möss hjärnor separerade till en enskild cell suspension. Efter vävnad dissociation utfördes immunopanning för att rena OPCs med hjälp av PDGFRα antikropp. Figur 2 visar betydande anrikning av PDGFRα, lite uttryck för neuron markör Tuj1 (neuron-specifika klass III beta-tubulin), astrocyt markör Fredsgenomförande (glial fibrillary sura protein), mikroglia markör Joniserat kalcium bindande adapter molekylen 1 (Iba1), myelinating mogen oligodendrocyter markör myelin grundläggande protein (Mbp) och myelin-oligodendrocyte glykoprotein (Mog) från renat OPCs som utvärderas av RT-qPCR. Immunfärgning resultat indikerar dessutom flertalet celler är NG2 positiva som visas i figur 2. Därefter 20 tusen renat OPCs per reaktion fastställdes av formaldehyd och kromatin var klippt med hjälp av en ultraljudsbehandling system. Olig2 låg-cell flisa utfördes och biblioteket byggdes. Efter ChIP bibliotek förberedelse, har den genererade produkten kvalitet validerats av en mikroflödessystem chip-kapillär elektrofores enhet. Figur 3 visar ett exempel elektroferogram av ett Olig2 låg-cell ChIP bibliotek. En tydlig topp av Oligo2 bibliotek produkt, från 250 till 500 bp ska synas efter storlek urval av bibliotek PCR-produkten. ChIP-seq biblioteken av både provet förberedd med Olig2 transkription faktor antikropp och referensprovet utsattes till hög genomströmning sekvensering att producera Parade-end 50 cykel sekvensering läsningar. Läs längder kommer att förbättra de mappning priserna och minska sannolikheten av flera kartläggning, på bekostnad av sekvensering kostnader. Med 50 bp ChIP-seq Parade-end sekvensering bibliotek uppnås vanligtvis goda resultat.
Efter den inledande kvalitetskontroll bedömningen av raw-läsningar och putsning av adaptrar och avslutande låg kvalitet baspar, avbildas kvalitetskontroll tomterna i figur 4. Trimmade läser bör ha en bas kvalitet som är större än 30, ingen adapter sekvenser, och har en låg dubbelarbete (figur 4B-D). Bra kvalitet trimmade läser kommer att öka den totala justering frekvensen. Andra parametrar såsom GC innehåll är också viktiga och bör övervägas för trimning.
När sekvensering proverna är justerade, är det nödvändigt att kontrollera sekvensering djupet. Det är känt att antalet kallas toppar kommer att öka med ett högre sekvensering djup sedan svaga platser kommer att bli mer statistiskt21. En mättnad analys krävs för att fastställa en tillräcklig sekvensering djup för varje specifik transkriptionsfaktor som används, på bekostnad av tid och budget. Ett samförstånd sekvensering djup för transkription faktorn bindande har föreslagits av konsortiet koda om däggdjur prover: minst 10 miljoner unikt mappas läsningar för vart och ett av minst två biologiska replikerar22. Antalet unikt mappade läsningar och den totala justering frekvensen beräknades genom den Läs mapparen. Ett exempel på bra mappning mätvärden visas i figur 5A. Justerad läser ska mappas till distinkta genomisk platser, som anger en adekvat bibliotek komplexitet, även kallat taggen clonality. KODA konsortiet föreslår att minst 80% av de 10 miljoner av arrangera i rak linje läser ska mappas till olika genomisk regioner22. Figur 5B visar en adekvat taggen clonality där mer än 90% av läser mappas till endast en genomisk plats. Low-complexity bibliotek förekommer vanligtvis när inte tillräckligt med DNA erhålls och PCR amplifieras fragment är sekvenserade upprepade gånger. Ett low-complexity bibliotek kommer att ge en hög falsk topp upptäckten hastighet.
När du använder Parade-end ChIP-seq data, fragment binda runt Transkriptionfaktorn med ett visst avstånd från separation. Parat-end sekvensering möjliggör en mer exakt uppskattning av den genomsnittliga fragment längd vilket ger en bättre uppskattning av Regionkommittén genomisk där mer bindande inträffade. Strand korrelation tomten skildrar en topp på berikning motsvarar den dominerande fragment längden. Såsom framgår av figur 5 c, beräknade fragment längd är 130 bp Läs längden är 50 bp. En ChIP-seq datamängd där fragment längd är längre än Läs är tecken på hög kvalitet16.
Produktionen av peak kallelse är en lista över genomisk regioner sannolikt att vara bunden av transkriptionsfaktor (eller dess komplex). Listan över genomisk regioner eller toppar ingår i en ”säng”-fil som kan ses i en webbläsare i genomet. För varje topp, den här filen innehåller en peak-ID, genomisk platsen för toppmötet i topp, och FDR-log10 (q-värde). De avsevärt berikad topparna är de med högre fold-anrikning och betydelse mätvärden. Ett exempel på peak utdatafilen visas i figur 6A. Efter väljande betydande toppar med anpassade tröskelvärden, filtrering toppar inom KODAS svartlista23och identifiera toppar inom en gen arrangören region (5 kb uppströms och hela genen kropp), är en ”pamp” filen användbar för visning av toppar i ett genom webbläsare. Mest berikat peak regioner har en högre sannolikhet för transkription faktorn bindande. Det är viktigt att bekräfta peak närvaron i kända transkription faktorn regulatoriska regioner liksom peak frånvaro i regioner där transkription faktorn bindande är osannolikt. Figur 6B -E visar exempel på genen regioner med och utan peak anrikning samt deras läge med avseende på koda arrangören regioner.
I silico kompletterande metoder till ChIP-seq experiment är motiv anrikning analys och de novo motiv Sök. Eftersom Olig2 bindning i OPCs inte har studerats före, Olig2 ChIP-seq härrör toppar i motorneuronen stamceller och stamceller användes för de novo motiv identifiering4,24. Olig2 de novo identifierade motiv lades till de omfattande koda motiv databas25 och motiv anrikning analysen utfördes. Hög anrikning av de de novo identifierade OLIG2 motiv och kända transkription faktorn (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 och ASCL1) motiv hittades i ChIP-seq topparna av PDGFRα renat celler. En anrikning av 30 de novo identifierade motiv med en E-value < 0,05 upptäcktes. Figur 7 visar de två översta de novo identifierade motiv av Olig2. Dessa två de novo identifierade Olig2 motiv hittades i > 60% av ChIP-seq topparna erhållits från PDGFRα renat celler, i tillägg till kända motiv.
Figur 1: översikt över arbetsflödet protokollet. PDGFRα positiva OPCs isolerades från postnatal mus hjärnor och utsattes för Olig2 ChIP experimentera. De utfällda DNA-fragment användes för att förbereda ChIP bibliotek. Efter bedömning av bibliotek kvalitet användes prover för sekvensering. Datauppsättningar analyserades, och toppar identifierades, som visar potentiella Olig2 bindningsställen i OPC renat celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utvärdering av renheten av immunopanned OPCs av qPCR och immunfärgning. (A), PDGFRα antikropp immunopanned celler var seedad och immunfärgning utfördes med hjälp av OPC härstamning markör NG2 antikropp. Blå: DAPI, grön: NG2. Skalstapeln = 10 µm. (B) relativ uttryck nivån av neuron markör Tuj1 i renad OPCs (PDGFRα +) och dissocierade hjärnceller (mix) utvärderades. Tuj1 uttryck i dissocierade hjärnceller var inställd på 1. (C), relativ uttryck nivån på Astrocyten markör Fredsgenomförande i renat OPCs (PDGFRα +) och dissocierade hjärnceller (mix) utvärderades. Fredsgenomförande uttryck i dissocierade hjärnceller var inställd på 1. (D) den relativa uttryck nivån av OPC markör PDGFRα i renat OPCs (PDGFRα +) och dissocierade hjärnceller (mix) utvärderades. PDGFRα uttryck i dissocierade hjärnceller var inställd på 1. (E) den relativa uttryck nivån av myelinating mogen oligodendrocyter markör Mog i renat OPCs (PDGFRα +) och dissocierade hjärnceller (mix) utvärderades. MOG uttryck i dissocierade hjärnceller var inställd på 1. (F) den relativa uttryck nivån av myelinating mogen oligodendrocyter markör Mbp i renat OPCs (PDGFRα +) och dissocierade hjärnceller (mix) utvärderades. MBP uttryck i dissocierade hjärnceller var inställd på 1. (G), relativ uttryck nivån av mikroglia markör Iba1 i renad OPCs (PDGFRα +) och dissocierade hjärnan celler (mix) utvärderades. Iba1 uttryck i dissocierade hjärnceller var inställd på 1. Data i B-G representerar tre exemplar experiment och felstaplarna indikerar standardfel. T-test analys * P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ett exempel elektroferogram av ett bibliotek från Olig2 låg-cell ChIP. Efter dubbel storlek urval analyserades kvaliteten på Olig2 ChIP bibliotek av en mikroflödessystem chip-kapillär elektrofores enhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa Kvalitetskontrollresultat för en 50 bp Läs längd låg-cell ChIP-seq prov. (A) sammanfattande tabell som skildrar det totala antalet läsningar, antal dålig kvalitet läsningar, sekvens längd och övergripande GC innehåll. (B) tomt som anger fördelningen av bas kvalitetsresultat på olika positioner i läser. (C) tomt visar potentiella adapter innehållet på olika positioner i läser. (D) linje handling som anger procenten av dupliceras sekvenser. Majoriteten av läser påbörjar från sekvenser som endast förekommer en gång inom biblioteket, därför tyder på en låg dubbelarbete ränta eller hög bibliotek komplexitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kvalitetskontroll mätvärden erhålls innan peak samtal: bowtie2 justering mätvärden, strand cross-korrelation och tagga clonality. (A) anpassning mätvärden erhålls från den Läs mapparen. De viktigaste mått är antalet unikt mappade Läs par, anges som ”anpassas konkurrenslagen exakt 1 gång”, och den övergripande justering. (B) Histogram visar den taggen clonality. Staplarna anger procenten av genomisk positioner där Taggar hittades. (C) ett exempel på en cross-korrelation tomt uppgifter av god kvalitet. Röda linjer skildra Läs längd 50 bps och dominera fragment längd 130 bps. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: ChIP-seq peak regioner och genomet webbläsare utsikt över betydande ChIP-seq toppar på genomisk orter. (A) exempel på Regionkommittén peak identifieras med peak anroparen. (B) betydande ChIP-seq toppar finns i genen kroppen av Cspg4, en känd OPC markörgen. (B) ingen ChIP-seq toppar hittades i Regionkommittén arrangören eller gen organ av Mbp gen, en markör för mogna oligodendrocyter, (C) Tubb3, en markör för neuronal cell eller (D) Fredsgenomförande, cell markör för astrocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: höganrikat de novo identifierade motiv av Olig2 Funna i PDGFRα-Olig2 ChIP-seq toppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1: beredning av ChIP-seq datauppsättningar. (A) katalog arkitekturen definition. (B) beräkna raw Läs kvalitetskontroll mätvärden. (C) trimning av läser. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S2: justering av läser till referens genomet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S3: kvalitetskontroll av arrangera i rak linje läser, till adress strand cross-korrelation och bestämma taggen clonality. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S4: Peak calling. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S5: annotering av betydande toppar. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S6: konvertering av bedGraph filformat till pamp för peak visualisering i genomet webbläsaren. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S7: De novo motiv Sök och motiv anrikning. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S8: flödesdiagram som beskriver bioinformatik analys av ChIP-seq data. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Däggdjur förordning nätverk är mycket komplex. ChIP-seq är en kraftfull metod att undersöka genome-wide protein-DNA interaktioner. Detta protokoll omfattar hur du utför Olig2 ChIP-seq med ett lågt antal renat OPCs från mus hjärnor (så lågt som 20 tusen celler per reaktion). Det första viktiga steget för detta protokoll är rening av OPCs från mus hjärnor av immunopanning med PDGFRα antikropp. För positiva urval av OPCs med PDGFRα belagda plattor belagda OPCs ofta svagt binder till PDGFRα plattor. Även efter flera tvättar finns det fortfarande vissa icke-anhängare-celler kvar. Det är viktigt att kontrollera icke-anhängare cellerna efter varje D-PBS tvätta under ett mikroskop. Om fler D-PBS wash inte hjälper för att minska antalet icke-anhängare celler, är det dags att samla de markerade cellerna, eftersom överskottet tvättar kan rubba bifogade OPCs och minska avkastningen av renat celler. Otillräcklig tvättar kan dock leda till andra hjärnans celler typer kontamineras. Därför, varje gång efter isolering, är det nödvändigt att utvärdera renheten av de isolerade OPCs genom immunfärgning med OPCs markör NG2 qPCR av uttryck för känd cell-typ specifika gener såsom Tuj1 för nervceller, både för astrocyter, PDGFRα för OPCs, Iba1 för mikroglia, och MOG och MBP för myelinating mogen oligodendrocyter. I figur 2visas immunfärgning resultat visar att majoriteten av renat cellerna är positiva för NG2 färgning. Dessutom några klassiska cell-typ specifika markörer för nervceller, astrocyter, mikroglia och myelinating mogen oligodendrocyter utställning omätbara eller låga extremt nivåer i renat OPCs jämfört med orenat hjärnan cell blandningen. PDGFRα uppvisar hög uttryck nivå i renat OPCs jämfört med orenat hjärnan cell blandningen. Immunopanning metoden, mikroglia är kraftigt reducerad i de renade OPCs jämfört med orenat hjärnan cell blandningen, men en liten mängd förorening finns. Denna observation stämmer med tidigare publikationer av andra7,8,26. Dessutom, vid jämförelse med tidigare publicerade rapporter, används ett kommersiellt tillgängliga kit i detta protokoll för standardiserade, effektiv och bekväm dissociationen av hjärnans vävnader i encelliga suspensioner.
Efter cross-linking av renat OPCs, tvärbundna celler ska tvättas med iskall HBSS lösning och återstående ChIP steg bör utföras vid 4 ° C, kan inte annars antikroppen fällningen genomisk DNA ordentligt.
Nästa viktiga steg i detta protokoll är bibliotek förberedelse. De PCR-amplifieringen av ChIP material användes för bibliotek konstruktion. Antalet PCR cykler för bibliotek förberedelse beror på mängden börjar DNA. Ett bra bibliotek preparat kräver exakt kvantifiering av ingående DNA belopp. För många eller för få PCR cykler kan påverka bibliotek koncentration samt komplexiteten, leder till PCR-artefakter.
Det svårt för att konstruera ChIP-seq bibliotek när du använder ett begränsat antal celler för immunoprecipitation27. Tidigare använda standardprotokollet ChIP kräver 10 ng av immunoprecipitated DNA för ChIP-seq bibliotek beredning1,28. Men i protokollet som beskrivs här normalt genererar 2 ng av immunoprecipitated DNA av Olig2 antikroppar från 20.000 OPCs. DNA används för att förbereda ChIP-seq biblioteket med en enda steg adapter tillägg metod, vilket möjliggör förbättrad känslighet så att pikogram av immunoprecipitated DNA kan förstärkas. Genom att kombinera kommersiella kit, ger detta protokoll en praktisk lösning för att utföra ChIP-seq för transkriptionell faktorer utifrån ett litet antal celler.
Ännu viktigare, är den låg cellen ChIP-seq-protokollet som beskrivs tillämplig för ChIP-Seq av andra transkriptionsfaktorer i primära celler eller ovanlig cellpopulationer samt. Antikroppar som används i detta protokoll måste verifieras experimentellt för att vara specifik genom IP-experiment först. Icke-specifik bindning av antikroppar kommer att leda till dåliga resultat. Dessutom är det att föredra att bära ut detta låg cell ChIP-seq experiment i celler med en hög uttryck nivå av Transkriptionfaktorn för intresse.
För analys av data, kan det vara utmanande att välja vilka värden som ska användas som filtrering cut-off efter peak ringer. Beroende på målen för analysen användas strängare eller mer avslappnad parametrar. I allmänhet används en kombination av vik-anrikning och p-värde eller FDR. Om några bindningsställen av Transkriptionfaktorn under studien var tidigare kända, kan detta hjälpa att fastställa tröskelvärdena som filtrering. Transkription faktorn bindande platsdatabaser härrör från allmänt tillgängliga ChIP-seq experiment i olika cellinjer och villkor har varit kompilerad29,30. Man kunde söka efter en gen och kontrollera om transkription faktorn bindningsställen har hittats tidigare. Det är dock viktigt att vara medveten om att transkription faktorn bindande platser skiljer sig åt beroende på celltyper och villkor.
I silico kompletterande metoder till ChIP-seq experiment är motiv anrikning analys och de novo motiv Sök hjälp MEME-ChIP20 eller liknande program. Motiv sökningen kräver en omfattande känd och de novo härrör motiv databas såsom de koda motiv25 eller Hocomoco databas31. Hocomoco är en databas med motiv upptäckte från allmänt tillgängliga mänskliga och mus ChIP-seq experiment. Om motiv för analyseras proteinet är okänd, kunde de novo motiv sökningen avslöja repetitiv sekvens mönster i en betydande del av topparna som nya motiv. Den potentiella kombinatoriska åtgärden av transkriptionsfaktorer kan vara avtäcka när motiv av andra transkriptionsfaktorer finns också för att berikas i de resulterande topparna.
Regionkommittén berikade peak kan verifieras experimentellt med hjälp av kromatinet av muterade eller knockout celler som kontroller. Utför ChIP-seq använder celler inte uttrycka transkriptionsfaktor används för att identifiera falska positiva toppar, även betecknas som ”phantom peaks”32. Falska positiva bör filtreras.
Det är också intressant att jämföra de resulterande ChIP-seq topparna med transcriptomic data. PDGFRα-Olig2 ChIP-seq topparna jämfördes med uttrycket av gener i OPCs från en tidigare publikation18. Denna strategi kan vara begränsad eftersom uttryckt gener i OPCs kan kontrolleras genom andra mekanismer än Olig2 transkription faktorn bindande. Dessutom Olig2 transkriptionsfaktor kan binda till en genens reglerande region men genen kan ha låg gen uttryck nivå på grund av möjliga hämmande mekanismer eller bristen på samarbete faktorer krävs för transkription av gener.
ChIP-seq är en metod som används för att identifiera genome-wide DNA bindande platser av transkriptionsfaktorer och andra proteiner. Dock genom analys av samtidig förekomst av transkriptionsfaktorer fann forskarna att transkriptionsfaktorer tenderar att associera med andra proteiner som bildar samreglerande moduler33. Detta innebär vissa bindningar mellan transkriptionell faktorer och genomiskt DNA avslöjade av ChIP-seq är indirekt och bryggade av andra proteiner. Därför, för att uppnå mer meningsfulla resultat forskare bör studera mer än en transkriptionsfaktor samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
JQW, XD, RCDD och YY stöddes av bidrag från de nationella institut för hälsa NS088353 av R01; NIH bevilja 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie fond-Memorial Hermann stiftelsen; UTHealth hjärnan initiativ och CTSA UL1 TR000371; och ett bidrag från University of Texas System neurovetenskap och Neurotechnology Research Institute (Grant nr 362469).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
