本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞来源的肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型的实验方案。该模型是测试高胆固醇血症新疗法的重要工具。
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方法文章
利用诱导多能干细胞衍生肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
家族性高胆固醇血症（FH）大多由低密度脂蛋白受体（LDLR）基因突变引起，导致血液中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显著升高，从而增加早发性心血管疾病的风险。他汀类药物是治疗FH及其他类型高胆固醇血症的首选降脂药物，但新的治疗方法正在不断涌现，尤其是PCSK9抗体，目前正处于临床试验阶段。为了探索FH的新型治疗方法（包括新药或新剂型），我们需要合适的体内模型。然而，现有FH动物模型在脂质代谢谱方面与人类存在差异，这是当前面临的关键问题。. 为解决这一问题，我们利用FH患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）分化为肝细胞（iHeps），构建了一种人源化肝脏嵌合小鼠模型。我们采用Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-（LRG）小鼠，以避免移植的人源细胞发生免疫排斥，并可在LDLR完全缺失的背景下评估LDLR缺陷型iHeps的功能。根据人血清白蛋白染色结果，移植的FH iHeps可在LRG小鼠肝脏中重建5%-10%的肝组织。此外，移植的iHeps对降脂药物产生响应，并重现了临床观察结果：与他汀类药物相比，PCSK9抗体具有更高的疗效。因此，我们建立的人源化肝脏嵌合模型可能适用于FH新疗法的临床前评估。采用相同实验方案，也可构建针对其他FH遗传变异或对应其他遗传性肝病基因突变的人源化肝脏嵌合小鼠模型。
引言
低密度脂蛋白受体（LDLR）可捕获血液中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），从而调节肝脏中的胆固醇合成。LDLR基因突变是家族性高胆固醇血症（FH）最常见的病因1。他汀类药物传统上是治疗FH及其他类型高胆固醇血症（遗传性或获得性）的首选药物。他汀类药物通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶来降低肝脏胆固醇的合成2。此外，他汀类药物还能增加肝细胞表面LDLR的表达水平，促进血浆中LDL-C的清除。然而，他汀类药物治疗的一个主要局限在于，它们会同时诱导前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）的表达，而PCSK9是一种能够结合LDLR并促进其降解的酶3。这一效应导致许多患者对他汀类药物的反应不足甚至无反应。对这一机制的研究意外地促成了治疗高胆固醇血症的替代方法的发现。美国食品药品监督管理局（FDA）近期批准的PCSK9抗体目前已用于临床试验，其疗效和耐受性均优于他汀类药物4。PCSK9抗体的成功也意味着，在高胆固醇血症患者中，可能还存在其他调控LDLR降解通路（除PCSK9外）的治疗策略。同样，人们也致力于开发除抗体以外的新型PCSK9抑制剂，例如小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸5。
为了测试针对家族性高胆固醇血症（FH）以....
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方案
本研究中涉及动物使用的所有方法均已获得香港大学教学与研究使用活体动物委员会（CULATR）的批准。
1. 小鼠准备与表型检测
- 免疫缺陷型Ldlr基因敲除（KO）小鼠的制备。
- 使用Ldlr-/-、Rag2-/-和Il2rg-/-小鼠品系（见材料表）。
- 将Rag2-/-小鼠与Il2rg-/-小鼠杂交以获得Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠，再将Ldlr-/-小鼠与Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠杂交，以生成Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-（LRG）小鼠15。在3至4周龄时，从小鼠耳部采集基因组DNA，并通过PCR和测序确定基因型。
- 在8至12周龄时，使用雄性LR....
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结果
人类iPSCs向iHeps的定向分化
当人iPSCs达到70%融合度时，采用三步法将其分化为iHeps16 (图1 上图）。经过3天的内胚层分化后，iPSC集落变得松散并扩展至完全汇合（图1 下图）。然后，用 2nd 培养基中，肝母细胞出现并增殖。此阶段这些细胞较为密集，但边界清晰（第7天， 图1 下图）。经过17天的分化，出现具有典型六边形形态的极化诱导肝细胞（iHeps）。图1 下图）。这些iHeps表达pHH标志物，包括AAT和ALB（图2A）。此外，通过流式细胞术检测，ASGPR+ iHeps 的比例应相对较高（图2B.......
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讨论
先前在啮齿类动物中使用诱导性肝细胞（iHeps）的研究已证实，iHeps 是研究遗传性肝病的有效方法17为了进一步拓展该技术的应用，并鉴于目前的FH动物模型尚不理想，我们将FH iHeps移植到LRG小鼠体内，并证明了移植后的 LDLR +/− 或杂合子 LDLR-突变型FH iHeps可降低小鼠血浆LDL-C水平，并对降脂药物产生应答 体内.
使用iHeps生成人源FH肝嵌合小鼠的方案中有三个关键步骤：
1）通过定向分化获得高质量的iHeps。鉴于不同iPSC细胞系之间存在克隆变异18，进行基因改造和移植前，应使用同基因型的iPSC细胞以确保适当的对照，并检测母细胞系的iHep分化效率。
2）正确将iHep装载入注射器中。与其他方案不同，我们使用50%细胞外基质（终浓度，v/v）重悬iHep，然后将其装载入胰岛素注射器中。我们认为细胞外基质能够保护细胞，并提供一种微.......
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披露
H.-F.T. 是由赛诺菲（Sanofi）和再生元制药公司（Regeneron Pharmaceuticals）赞助的 ODYSSEY OUTCOMES 研究的国家协调员和研究者。
致谢
本工作得到了深圳市科技计划基础研究项目（JCYJ20150331142757383）、中国科学院战略性先导科技专项（XDA16030502）、香港研究资助局主题研究计划（T12-705/11）、香港特别行政区研究资助局与国家自然科学基金委员会合作项目（N-HKU730/12 和 81261160506）、广东省自然科学基金研究团队项目（2014A030312001）、广州市科技计划项目（201607010086）以及广东省科学技术计划项目（2016B030229007 和 2017B050506007）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 40 µm 细胞滤筛 | BD | B4-VW-352340 | |
| 6孔板 | 赛默飞世尔科技 | 140675 | 细胞外基质包被 |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| 乙酰胆碱 | Sigma Aldrich | A6625 | 溶于水 |
| 抗原修复液 | IHC World | IW-1100-1L | |
| 氯化钙 | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| 细胞解离酶 | 赛默飞世尔科技 | 12604-013 | TrypLE |
| D-葡萄糖 | Sigma Aldrich | D8270 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | 赛默飞世尔科技 | 10829 | 敲除DMEM |
| DNase I | 罗氏 | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M，pH = 8.0 |
| 细胞外基质（用于细胞悬浮） | 康宁 | 354234 | Matrigel |
| 细胞外基质（用于iHep分化） | 康宁 | 354230 | Matrigel |
| 肝细胞基础培养基 | Lonza | CC-3199 | |
| 肝细胞培养基 | Lonza | CC-3198 | |
| 高脂高胆固醇饮食 | 研究饮食 | D12079B | |
| 人激活素A | Peprotech | 120-14E | |
| 人肝细胞生长因子 | Peprotech | 100-39 | |
| 人iPSC维持培养基 | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| 人抑瘤素M | Peprotech | 300-10 | |
| 氯胺酮 10% | Alfasan | N/A | |
| L-谷氨酰胺 | 赛默飞世尔科技 | 35050 | |
| LDL-C 检测试剂盒 | WAKO | 993-00404 和 993-00504 | |
| 镁 氯化物 | VWR | P25108 | MgCl₂2 |
| 美洛昔康 | 勃林格殷格翰 | NADA 141-213 | |
| 磷酸二氢钾 | USB | S20227 | KH2PO4 |
| 非必需氨基酸 | 赛默飞世尔科技 | 11140 | |
| PBS | 通用电气 | SH30256.02 | 无钙无镁 |
| PCSK9 抗体 | 赛诺菲与再生元制药 | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| 苯巴比妥 | Alfamedic 公司 | 013003 | |
| 去甲肾上腺素 | RBI | P-133 | 溶于水 |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| 聚维酮碘 | Mundipharma | 聚维酮碘 | |
| 重组小鼠 Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK抑制剂Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | 赛默飞世尔科技 | 21875 | |
| 血清替代物 | 赛默飞世尔科技 | 10828 | |
| 硅胶涂层培养皿 | 道康宁 | Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒 | |
| 辛伐他汀 | 默克·夏普 &安进与默沙东 | ZOCOR | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO₃3 |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | 赛默飞世尔科技 | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | 溶于DMSO |
| 2% 赛拉嗪 | Alfasan | N/A | |
| <强>β-巯基乙醇 | 赛默飞世尔科技 | 31350 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>抗体 | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | 圣克鲁斯 | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>小鼠 | |||
| Il2rg-/- | 杰克逊实验室 | 003174 | |
| Ldlr-/- | 杰克逊实验室 | 002077 | |
| Rag2-/- | 杰克逊实验室 | 008449 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>设备 | |||
| 自动细胞计数仪 | Invitrogen | 库尔斯 | |
| γ射线辐照仪 | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| 胰岛素注射器 | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | 模型 8/30 | |
| 载玻片扫描系统 | Leica biosystems | Aperio ScanScope 系统 | |
| 滑动式切片机 | Leica biosystems | RM2125RT | |
| 体视显微镜 | 尼康 | SMZ800 | |
| 组织处理系统 | Leica biosystems | ASP200S | |
| 血管环张力测定仪 | DMT | 610M | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>软件 | |||
| 数字切片浏览软件 | Leica | Aperio ImageScope 版本 12.3.2 | |
| Image J | 美国国立卫生研究院 | 版本 1.51e | |
| 图像处理软件 | Adobe | Photoshop CC 版本 2015 | |
| 显微镜成像软件 | 卡尔·蔡司 | AxioVision LE 版本 4.7 |
参考文献
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al.
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