本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。
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本文内容
摘要
摘要
由人多能干细胞（hPSC）衍生的胰腺细胞是再生医学领域一种极具前景的细胞来源，也可作为研究人类发育过程的平台。逐步定向分化是生成胰腺细胞（包括胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）胰腺前体细胞）的主要方法之一，该方法可模拟体内发育过程。传统方案通常在传代后不久，利用小克隆开始诱导分化。然而，在克隆或细胞聚集体状态下，细胞容易出现异质性，这可能阻碍向PDX1+细胞的分化。本文介绍了一种将hPSC分化为PDX1+细胞的详细实验方案。该方案包含四个步骤，起始于解离后的单细胞接种。首先诱导生成SOX17+定型内胚层细胞，随后表达两种原始肠管标志物HNF1β和HNF4α，最终分化为PDX1+细胞。本方案操作简便，可能提高并稳定某些此前被发现难以有效分化为内胚层谱系或PDX1+细胞的hPSC细胞系的分化效率。
引言
胰腺主要由外分泌细胞和内分泌细胞组成，其功能障碍或负荷过重可导致多种疾病，如胰腺炎、糖尿病和胰腺癌。为了阐明胰腺疾病的发病机制，有必要分析胰腺细胞的发育过程及其功能。此外，建立细胞/组织补充疗法还需要稳定且高质量的细胞来源。由人多能干细胞（hPSC）衍生而来的胰腺细胞是实现上述目标的有前景的细胞来源，针对胰腺细胞分化的诱导方案已得到深入研究1,2,3,4。近年来，体外生成胰腺β细胞的技术取得进展，所获得的β细胞在发育过程上模拟了成人人体内β细胞的形成，并在移植至糖尿病模型小鼠后表现出治疗效果2,3。此外，通过对健康供体和1型糖尿病患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）所生成的β细胞进行分析，发现二者在包括应激状态下的功能方面并无显著差异5。而且，利用患者来源的iPSCs或携带与患者相同位点基因突变的hPSCs所诱导生成的胰腺细胞，已部分重现了相关疾病的表型特征6,7。
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方案
使用hPSCs的实验已获得京都大学医学部及医学院研究生院伦理委员会的批准。
1. 材料准备
注意：所有细胞培养用培养基和试剂均需在无菌环境中配制。使用前将基础培养基恢复至室温（RT）。分化用培养基在室温下需于6小时内使用。试剂的详细信息见材料表。
- 分化（图1A）
- 第1A阶段培养基：使用移液器将RPMI 1640培养基转移至离心管中。依次加入无血清添加剂、activin A、CHIR99021和Y-27632，使其终浓度分别为1x、100 ng/mL、3 μM和10 μM。
- 第1B阶段培养基：使用移液器将RPMI 1640培养基转移至离心管中。依次加入无血清添加剂、activin A和CHIR99021，使其终浓度分别为1x、100 ng/mL和≤1 μM。
注意：CHIR99021的浓度应低于第1A阶段培养基中的浓度；该成分的添加并非必需，但可增加细胞数量。 - 第2阶段培养基：使用移液器将改良型MEM（iMEM）培养基转移至离心管中。加入无血清添加剂和角化细胞生长因子（KGF），使其终浓度分别为0.5x和50 ng/mL。<....
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结果
hiPSCs（585A129,30）在扩增过程中会凝聚并形成均一的单层细胞（图1B），适合用于分化。未分化的hiPSCs（第0阶段）被解离后以单细胞形式在低细胞密度（1–1.5 × 105 个细胞/cm2）下重新接种。接种后1小时内，细胞即贴附于培养板并开始出现突起。第1天时，细胞增殖良好且分布均匀，覆盖培养表面面积的80–90%。在第1B阶段，由于存在死亡细胞，培养基呈现浑浊状态。清除死亡细胞对于实现高效分化至关重要，因为死亡细胞可能干扰其下方存活细胞的生存与分化。第3–4天，细胞形成具有“鹅卵石样”外观的均一单层细胞片。此时，大多数细胞停止表达未分化细胞标志物——性别决定区Y框蛋白2（SOX2），转而表达定型内胚层标志物SOX17，阳性率超过90%（图2A 和B）。大多数SOX17+细胞同时表达FOX.......
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讨论
PDX1+ 细胞的生成包含多个步骤，因此在适当的时间点对细胞进行处理至关重要。其中，定型内胚层的诱导效率在很大程度上影响最终的诱导效率，这可能是由于其他污染谱系细胞（如中胚层和外胚层）的干扰，这些细胞可能增殖和/或分泌干扰特定分化的因子。如果在第4天（第1B阶段）SOX17+ 细胞的比例低于80%，则向 PDX1+ 细胞的有效诱导很可能受到影响。
人多能干细胞（hPSCs）的未分化状态通常以紧密排列的细胞集落或聚集体形式维持。然而，从集落或聚集体起始的分化方法可能因集落内部和边缘区域的细胞黏附程度和密度不同22，以及细胞所处细胞周期阶段不同25，而导致分化结果存在异质性。相比之下，本方法起始于解离的单细胞，使得每个单细胞的黏附状态或细胞密度相对均一。在实现单细胞水平均一化操作方面，本方法可能比从集落或聚集体培养起始的其他方法更具优势。
尽管本方.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了日本促进科学协会（JSPS）科研费（C）项目（JSPS KAKENHI 项目编号15K09385 和 18K08510）对 T.T. 的资助，以及 JSPS 研究员奖励金（JSPS KAKENHI 项目编号17J07622）对 A.K. 的资助，同时得到了日本医疗研究开发机构（AMED）研究资助项目“iPS细胞研究核心中心、再生医学实现研究网络中心”的支持，授予 K.O.。作者感谢 Peter Karagiannis 博士对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-酮基-N-氨乙基-N′-氨基己酰基二氢肉桂酰基环杷明 | 多伦多研究化学品公司 | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]-苯甲酸 | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL 锥形无菌聚丙烯离心管 | 赛默飞世尔科技 | 339652 | |
| 抗 CDX2 抗体 [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | 抗-CDX2， × 1/1000 稀释 |
| B-27 添加剂（50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | 无血清添加剂 |
| BD FACSAria II 细胞分选仪 | BD Biosciences | 用于流式细胞术 | |
| 生物医学冰箱 | SANYO | MDF-U538 | 对于 -30 °C 储存 |
| 用于TC10/TC20细胞计数仪的双通道细胞计数板 | BIO-RAD | 1450011 | 计数载玻片 |
| 细胞培养多孔板，6孔，聚苯乙烯，透明 | Greiner bio-one | 657165 | 用于分化培养/6孔板 |
| 离心 | TOMY | AX-310 | 用于细胞培养 |
| 离心 | TOMY | MX-305 | 用于 RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| 洁净台 | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | 洁净台 |
| Corning CellBIND 6 孔板 | 康宁 | 3335 | 无饲养层培养 hPSCs/6 孔板 |
| 康宁 Matrigel 基底膜基质 生长因子减量 | 康宁 | 354230 | 基底膜基质 |
| Corning Synthemax II-SC 基质 | 康宁 | 3535 | 无饲养层培养人多能干细胞/人多能干细胞用合成表面材料 |
| 冷冻切片机 | Leica | Leica CM1510 S | 用于细胞聚集体的免疫染色。 |
| Cytofix/Cytoperm 试剂盒 | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash 缓冲液为 通透/洗涤缓冲液。Cytofix/Cytoperm缓冲液为固定和通透缓冲液。 |
| Dako笔 | Dako | S2002 | 对于聚集体的免疫染色 |
| dNTP 混合液（10 mM） | 赛默飞世尔科技 | 18427-088 | 用于RT-qPCR |
| 驴抗山羊IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | 二抗， × 1/500 稀释度 |
| 驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 | 赛默飞世尔科技 | A10036 | 二抗， × 1/500 稀释度 |
| 驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | 二抗， × 1/500 稀释 |
| 驴血清 | 默克密理博 | S30 | 驴血清 |
| 不含 Ca 或 Mg 的 D-PBS(-) | Nacalai Tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 培养基 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | 无饲养层培养 hPSCs/hPSC 维持培养基 |
| Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤网 snap 盖 | 康宁 | 352235 | 5 mL 圆底聚苯乙烯管，带细胞筛 |
| 滤尖，1,000 µL | Watoson | 124-1000S | 与移液器配合使用 |
| 20 微升滤芯吸头 µL | Watoson | 124-P20S | 与移液器配合使用 |
| 200 微升滤芯吸头 µL | Watoson | 124-P200S | 与移液器配合使用 |
| 荧光显微镜 | Keyence | BZ-X700 | 用于免疫染色 |
| Forma Steri-Cycle CO2 培养箱 | Thermo Fisher Scientific | 370A | 培养箱 |
| HNF-1β 抗体（C-20） | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | 抗HNF1β, × 1/200 稀释度 |
| HNF-4α 抗体（H-171） | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | 抗HNF4α, × 1/200 稀释度 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | 用于细胞核染色， × 1/200 稀释度 |
| 人胰腺总RNA | Ambion | AM7954 | 用于 RT-qPCR |
| 人PDX-1/IPF1抗体 | R&D Systems | AF2419 | 抗PDX1，山羊IgG， × 1/200 稀释度 |
| 人类 SOX17 抗体 | R&D Systems | AF1924 | 抗SOX17， × 1/200 稀释度 |
| 改良的MEM锌选项培养基 | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| 培养箱 | Cosmo Bio | 10DO | 用于类器官的免疫染色 |
| 乳胶检查手套 | Adachi | ||
| MAS包被的载玻片 | Matsunami Glass | 83-1881 | 用于细胞聚集体的免疫染色 |
| MicroAmp 快速 96 孔反应板 | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | 用于 RT-qPCR |
| 显微镜 | Olympus | CKX41N-31PHP | 用于细胞培养 |
| 微量离心管 | Watoson | 131-515CS | |
| 单克隆抗-α甲胎蛋白 | SIGMA | A8452 | 抗AFP， × 1/200 稀释度 |
| Nanodrop 8000 | 赛默飞世尔科技 | 用于RT-qPCR | |
| 寡核苷酸dT | FASMAC | 定制寡核苷酸 | 用于RT-qPCR的序列是 "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| 多聚甲醛，粉末 | Nacalai Tesque | 26126-54 | PFA，固定剂，用DPBS稀释 |
| 药品冷藏箱 | SANYO | MPR-514 | 4 对于 °C 储存 |
| PIPETMAN P | GILSON | 移液器 | |
| 重组人KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| 重组人Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| 重组人/小鼠/大鼠 Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace（100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | 用于RT-qPCR |
| 无RNase的DNase试剂盒（50） | QIAGEN | 79254 | 用于RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | 用于RT-qPCR |
| 含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基 | Nacalai Tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| 实时密封膜 | Takara | NJ500 | 用于 RT-qPCR |
| 10 mL 血清移液管 | Costar/Corning | 4488 | 用于细胞培养 |
| 25 mL 移液管 | Costar/Corning | 4489 | 用于细胞培养 |
| 5 mL 血清移液管 | Costar/Corning | 4487 | 用于细胞培养 |
| Sox2 (D6D9) XP 兔单克隆抗体 | 细胞信号传导 | 3579S | 抗SOX2， × 1/200 稀释 |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 用于RT-qPCR | |
| 蔗糖 | Nacalai Tesque | 30406-25 | 用于类器官的免疫染色 |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820B | 用于 RT-qPCR |
| TC20全自动细胞计数仪 | BIO-RAD | 1450101J1 | 自动细胞计数仪 |
| Tissue-Tek OCT 化合物 4583 | Sakura Finetek | 4583 | 对于类胚体的免疫染色 |
| Tissue-Tek Cryomold 模具/适配器 | Sakura Finetek | 4566 | 用于细胞聚集体的免疫染色 |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| 台盼蓝 | BIO-RAD | 1450021 | |
| 超低温冰箱 | SANYO | MDF-U33V | 对于 -80 °C 储存 |
| UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0 | 赛默飞世尔科技 | 15575-038 | 用 DPBS 稀释，配制 0.5 mM EDTA |
| Veriti 温控循环仪 | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 用于 RT-qPCR | |
| Y-27632 | 和光 | 251-00514 |
参考文献
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vi....
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重印与许可
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