새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

요약

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

초록

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs)은 암과 같은 인간의 질병의 개시 그리고 진행 성 메커니즘에 새로운 생물 학적 통찰력을 공개에 매우 중요 합니다. 유전자 변형 및 조건부 녹아웃 쥐 유전자 overexpression 자주 사용 되었습니다 또는 특정 조직 또는 세포 제거에 비보유형. 그러나, 생식 마우스 모델 생성 시간과 비용이 많이 드는 수 있습니다. 최근 발전 기술과 DNA 플라스 미드 바이러스 성 감염에 의해 제공의 타당성을 편집 진에 여러 장기에 대 한 비 생식 autochthonous 마우스 암 모델의 빠른 생성을 활성화 했습니다. 방광 액세스, 취재는 urothelium glycosaminoglycan 계층의 존재 때문에 바이러스 성 벡터에 대 한 어려운 되었습니다 기관 이다. 여기, 우리가 마우스 방광 urothelium 비보에 플라스 미드 DNA의 효율적인 배달에 대 한 실험실에서 개발 된 새로운 방법을 설명 합니다. PCAG-GFP DNA 플라스 미드의 intravesical 주입 및 수술 노출된 방광의 electroporation를 통해 우리는 DNA 플라스 미드 방광 urothelial 셀 과도 식으로 구체적으로 전달 될 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 방법은 overexpression 및 마우스 방광에 유전자의 최저 신속 하 고 편리한 방법 이며 방광 암 및 다른 비뇨기과 질환의 GEMMs를 건물에 적용할 수 있습니다.

서론

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 동물 개발, 유전자 기능에서 vivo에서및 질병 진행^1,2의 메커니즘에 대 한 우리의 지식을 확장에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 생식 GEMMs는 전통적으로 두 가지 방법으로 개발 됩니다. 첫 번째 pseudopregnant 여성에 zygotes의 이식 뒤 DNA 플라스 미드의 pronuclear를 주입 하 여 유전자 변형 생쥐의 창조 이다. 다른 노크-아웃/노크-에서 생쥐 배아 줄기 세포에서 동종 재결합에 의해의 생성 및 키메라의 개발 이다. 특정 조직 또는 세포 유형의 관심 있는 유전자의 조건부 녹아웃 포함 여러 세대에 대 한 Cre flox 사이트와 대립 유전자 조작된 유전자의 번 식을 한다. 전체 프로세스는 비싸고 시간이 많이 걸리는, 목표는 조직 특히 여러 유전자를 대상으로 하는 경우에 특히 될 수 있습니다. 최근, 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 같은 유전자 편집 기술 학위 암^{3, 모델링에 대 한 조직의 특정 유전 변경 유도를 쥐의 여러 장기에 적용 된 4,}

프로토콜

여기에서 설명한 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 캘리포니아 대학 산타 크루즈의 지침에 따라 수행 했다.

1. 플라스 미드 및 도구 준비

1. 각 방광 transfect에 대 한 DNA 플라스 미드 (1 µ g / µ L)의 적어도 20 µ L를 준비 합니다.
2. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 플라스 미드 솔루션의 20 µ L을 Trypan 블루의 1 µ L를 추가 합니다. 잘 섞어 피 펫입니다.
3. 압력솥에 모든 수술 장비 및 작업 영역 70% 에탄올으로 소독. 자주 수술 기구와 장갑 70% 에탄올 스프레이 또는 무 균 상태를 유지 하기 위해 다음 단계를 수행할 때 유리 구슬 소독 기를 사용.

2. 동물 anaesthetizing

1. 테이블 상단 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize isoflurane와 동물. O₂ 탱크를 켜고 1 L/min에 산소 유량을 조정.
2. 유도 실에서 성인 여성 C57BL/6J 마우스를 놓습니다. 설정 하 고 유도 3 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다. 마우스 선제 무 통 유도 챔버에서 마우스의 제거....

결과

설명 하기 위해 방광 urothelium로 유전자 배달의 성공, 우리 electroporation pCAG GFP¹⁵ 플라스 미드 사용. 20 µ L 플라스 미드 및 Trypan 블루 솔루션의 요도 통해 주입 했다 그리고 5 전기 펄스 관리 되었다. 48 h 후 마우스 방광을 해 부 하 고 부정적인 electroporation 보여주었다 (그림 1A) GFP 신호를 받아야 하지 않았다 방광을 제어 하는 반면 해 부 형광 현미경 GFP 형광의 패치를 관찰. 우리 면역 형광 염색 sectioned 방광 조직 cytokeratin (CK) 5, CK18의 수행 될 때 GFP 항 체, 우리는 찾았지만 GFP 우산, 중간, 존재 하 고 기저 세포 신호는 근육 안에 레이어 (그림 1B), 그리고 플라스 미드는 urothelium에 배.......

토론

Electroporation 세포 막 침투성을 강화 하 고 유전자 electrotransfer¹⁶에 대 한 강력한 기술 이다. Electroporation에 의해 생활 설치류에 유전자 배달 신경 생물학 분야^{17,,1819,20,21}에 자주 사용 되었습니다. 다른 많은 기관에 그것의 잠재적인 응용 프로그램 광범위 하 게 탐험 하지는. 우리의 지식, 우리의 여기 설명 된 방법은 방광 urothelium electroporation에 의해 성공적인 유전자 배달의 첫 번째 보고서입니다. 그것은 아 데 노 바이러스/lentivirus 기반 감염 방법에 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, electroporat.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD 1mL TB 주사기	Fisher	148232E
부프레노르핀	시그마	B9275-50MG
Dumont 핀셋	Roboz Surgical Instr	RS-5005	수술 전 70% 에탄올 치료
ECM830 SQ Wave Electroporator	하버드 장치	450052
Exel International 일회용 Safelet I.V. 카테터	피셔 Scientific	14-841-21	24G, 길이 2.11cm, 외경 0.045cm
초미세 마이크로 해부 가위	Roboz Surgical Instr	RS-5135	수술 전 70% 에탄올 치료
Isoflurane	Vet one	501017
K& H 작은 동물을 위한 가열 휴식 매트, 9 x 12인치	Amazon	n/a	열 매트를 종이 타월로 덮으십시오
안과 연고	Fisher	NC0849514
PBS, pH7.4	Life Technologies	10010049
Pipet tips 200 µ L	USA Scientific	1111-0206
피펫 팁, 유니버설 핏; 0.1 to 10 &마이크로; L	Fisher	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
플라스미드 CAG-GFP	Addgene	16664
백금 핀셋 5mm	하버드 장치	450489	5mm 직경
가위	Roboz Surgical Instr	RS-5880	치료 수술 전 70% 에탄올
스트링 코드	아마존	n/a	Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm 가죽 재봉 스티치 플랫 왁스 실 스트링 코드
테이프, 스카치	피셔	19047257
Therio-gel 수의학 윤활제	PBS 동물 건강	353-736
Trypan Blue Stain	Life Technologies	15250061
V-1 테이블 탑 시스템 마취	VetEquip	901806
Vicryl 바이올렛 봉합사 18" FS-2 절단 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens 포비돈 요오드 10%	Walgreens	953982
상처 클립	Fisher	018045
상처 클립 애플리어	Fisher	01804