Summary
Se describe un método para la generación de MLG-base condicionales mutantes precipitación usando CRISPR/Cas9 edición del genoma del falciparum del Plasmodium .
Abstract
La malaria es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Esta enfermedad, que afecta sobre todo a los que viven en regiones tropicales y subtropicales, es causada por infección con los parásitos Plasmodium . El desarrollo de medicamentos más eficaces para combatir la malaria puede acelerarse mediante la mejora de nuestra comprensión de la biología de este parásito complejo. Manipulación genética de estos parásitos es clave para entender su biología; sin embargo, el genoma de p. falciparum ha sido históricamente difícil de manipular. Recientemente, CRISPR/Cas9 edición del genoma ha sido utilizada en parásitos de la malaria, permitiendo para la proteína más fácil etiquetado, generación de caídas de proteína condicional y canceladura de los genes. La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha demostrado para ser una poderosa herramienta para avanzar en el campo de la investigación de la malaria. Aquí, describimos un método CRISPR/Cas9 para generar MLG-base de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum. Este método es altamente adaptable a otros tipos de manipulaciones genéticas, incluyendo proteína etiquetado y golpes de gracia del gene.
Introduction
La malaria es una enfermedad devastadora causada por parásitos protozoarios del género Plasmodium. P. falciparum, el parásito del paludismo humano mortal más, hace aproximadamente 445.000 muertes por año, sobre todo en niños menores de cinco1. Plasmodium parásitos tienen un ciclo de vida complicado con un vector mosquito y un hospedador vertebrado. En primer lugar los seres humanos se infectan cuando un mosquito infectado toma una comida de sangre. Luego, el parásito invade el hígado donde crece, se desarrolla y se divide por aproximadamente una semana. Después de este proceso, los parásitos se liberan en el torrente sanguíneo, donde se someten a la replicación asexual en células de sangre rojas (RBCs). Crecimiento de los parásitos en los glóbulos rojos son directamente responsables de los síntomas clínicos asociados con la malaria2.
Hasta hace poco, producción de transgénicos por p. falciparum fue un proceso laborioso, que implica varias rondas de selección de la droga que tomó muchos meses y tenían una tasa alta de fracaso. Este procedimiento desperdiciador de tiempo relieson la generación de DNA al azar rompe en la región de interés y la capacidad endógena del parásito para reparar su genoma aunque reparación homóloga3,4,5,6 . Recientemente, agrupadas regularmente otro palindrómico Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) edición del genoma ha sido exitosamente utilizada en p. falciparum7,8. La introducción de esta nueva tecnología en la investigación de la malaria ha sido fundamental para el avance de la comprensión de la biología de estos parásitos Plasmodium mortales. CRISPR/Cas9 permite la focalización específica de genes a través de guía RNAs (gRNAs) que son homólogos a los genes de interés. El gRNA/Cas9 complejo reconoce el gen por el gRNA y Cas9 introduce entonces una rotura de doble cadena, obligando a la iniciación de los mecanismos de reparación en el organismo9,10. Porque p. falciparum carece de la maquinaria para reparar roturas de DNA por unirse a final no homóloga, que utiliza mecanismos de recombinación homóloga e integra plantillas de ADN homólogas transfected para reparar el Cas9 gRNA-inducido rotura de doble cadena11,12.
Aquí, presentamos un protocolo para la generación de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum usando CRISPR/Cas9 edición del genoma. El protocolo muestra el uso de la ribozima MLG a niveles de proteína condicional precipitación de PfHsp70x (PF3D7_0831700), un acompañante exportadas por p. falciparum en host gr13,14. La ribozima MLG es activado por el tratamiento con glucosamina (que se convierte en la glucosamina-6-fosfato en las células) para hender su mRNA asociados, llevando a una reducción de la proteína14. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para utilizar otras herramientas de precipitación condicionales, como dominios de desestabilización o RNA aptámeros4,5,15. Nuestros detalles del protocolo la generación de un plásmido de reparación que consta de un ribozima de etiqueta y glmS de hemaglutinina (HA) secuencia flanqueada por secuencias de codificación son homólogas a las PfHsp70x marco abierto de lectura (ORF) y 3'-UTR. También se describe la generación de un segundo plásmido de expresión de la unidad de la gRNA. Estos dos plásmidos, junto con un tercero que conduce la expresión de Cas9, transfected en glóbulos rojos y sirve para modificar el genoma de p. falciparum parásitos. Por último, se describe una reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena)-basado en la técnica para verificar la integración de la etiqueta y glmS ribozyme. Este protocolo es altamente adaptable para la modificación o completo octavos de final de cualquier genes de p. falciparum , mejorar nuestra capacidad de generar nuevos conocimientos sobre la biología del parásito de la malaria.
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Protocol
Continua el cultivo de p. falciparum requiere el uso de glóbulos rojos humanos, y se utilizaron comercialmente compradas unidades de sangre que fueron despojados de todos los identificadores y anonimizada. La Junta de revisión institucional y la oficina de seguridad de la biotecnología en la Universidad de Georgia revisaron nuestros protocolos y aprobaron todos los protocolos utilizados en nuestro laboratorio.
1. elegir un gRNA secuencia
- Ir a CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) y seleccione ' Fasta Target'. En 'Target', pegar los 200 pares de bases del extremo 3' del marco de lectura abierto (ORF) de un gen y 200 pares de bases desde el inicio de 3'-UTR de la gene. En 'En', seleccione 'P. falciparum' (3 7 v3.0) y seleccione ' CRISPR/Cas9 ' bajo 'Uso'. A continuación, haga clic en ' buscar sitios de destino '.
- Seleccionar una secuencia de gRNA de las opciones presentadas, dando preferencia a la gRNA más eficiente que es la más cercana al sitio de modificación y que tiene los sitios objetivo menor.
Nota: Las secuencias gRNA potencial se identifican porque son inmediatamente aguas arriba de un motivo adyacente Protospacer (PAM), que se requiere para contratación de Cas9 al ADN. La secuencia que se clona en pMK-U6, el vector que impulsa a la expresión de gRNA, es las 20 bases inmediatamente aguas arriba del PAM. El PAM específico para S. pyogenes Cas9 es la secuencia de nucleótido NGG y no debe incluirse en la secuencia que se clona en pMK-U6.
Nota: CHOPCHOP visualmente alinea las secuencias gRNA, mostrando las mejores opciones en verde, las opciones menos ideales en ámbar y las peores opciones en rojo. CHOPCHOP da cada secuencia de gRNA una puntuación de eficiencia que se calcula utilizando los parámetros más actualizados encontrados la literatura, y predicen sitios fuera del objetivo que podrían ser reconocidos por el gRNA. Dos o tres secuencias de gRNA deba ser intentó encontrar la gRNA mejor adaptada a un gen determinado. - Comprar la secuencia gRNA y su complemento reverso como oligos purificada de electroforesis en Gel de poliacrilamida. La secuencia de gRNA usada a PfHSP70x de destino puede encontrarse en la figura 1B.
Nota: Este oligo debe incluir 15 pares de bases homólogas para el plásmido de expresión de gRNA, que son necesarios para la secuencia y la independiente de la ligadura de clonación (SLIC) en el pMK-U6 vector16.
2. clonación de la gRNA secuencia en pMK-U6
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Digerir el pMK-U6 con BtgZI.
- Recopilación de 10 μg de pMK-U6 con 5 μL de la enzima BtgZI (5.000 unidades/mL) durante 3 h a 60 ° C. Seguir el protocolo del fabricante de la enzima para condiciones de reacción.
- Después del período de incubación de 3 h, agregar un adicional 3 μL de BtgZI a la reacción para asegurar la digestión completa del plásmido. Digerir un adicional 3 h, siguiendo las instrucciones del fabricante para garantizar las condiciones de reacción correcta.
- Para purificar el pMK-U6 digerido de la reacción, utilizar un kit de limpieza PCR basada en la columna según las instrucciones del fabricante.
- Separar el ADN digerido con un gel de agarosa de 0,7% y extracto de la banda de 4.200-pares.
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Templar los oligos que contiene la secuencia de gRNA.
- Reconstituir los oligos purificada de página a una concentración de 100 μM con agua libre de nucleasa.
- Combinar 10 μL de cada oligo con 2,2 μL de 10 x tampón 2 (véase Tabla de materiales). Asegúrese de que el volumen total de reacción es 22.2 μL.
- Ejecutar el gRNA recocido programa en un termociclador: paso 1: 95 ° C, 10 minutos; Paso 2: 95 ° C, 1 s, con una reducción de temperatura de 0.6 ° C/ciclo; Paso 3: vaya al paso 2, 16 veces; Paso 4: 85 ° C, 1 min; Paso 5: 85 ° C, 1 s, con una reducción de temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Paso 6: ir al paso 5, 16 veces; Paso 7: 75 ° C, 1 min; paso 8: 75 ° C, 1 s, con una reducción de temperatura de 0.6 ° C/ciclo; Paso 9: vaya al paso 8, 16 veces. Pasos 10 a 21: Repita el procedimiento utilizado en los pasos 4-9 hasta que la temperatura alcanza los 25 ° C; Paso 22:25 ° C, 1 min.
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Inserte los oligos gRNA recocido en el plásmido BtgZI-digerido y purificaron por gel de pMK-U6.
- Combinar 100 ng de pMK-U6 digerido con 1 μL de 10 x tampón 2.1 y 3 μL de oligos de gRNA recocido. Aumentar el volumen a 9,5 μL con agua libre de nucleasa.
- Añadir 0,5 μL de polimerasa T4 e incubar la reacción a temperatura ambiente durante 2,5 min.
- Mueva la reacción del hielo e incubar durante 10 minutos.
- Inmediatamente transformar 5 μL de la reacción en competentes de e. coli según las instrucciones del proveedor de bacterias. La placa de las bacterias en placas de agar caldo de lisogenia (LB) que contiene 100 μg/mL de ampicilina.
- Permitir que las bacterias transformadas crecen a 37 ° C durante la noche, luego seleccionar colonias y extraer ADN con un kit de miniprep de plásmidos disponibles comercialmente.
3. diseño de las regiones de la homología de la plantilla de reparación
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Diseño escudo mutaciones dentro de la plantilla de homología reparación para evitar que vuelva a cortar el ADN que se integra en el genoma.
Nota: Una mutación del escudo por lo general consiste en introducir una mutación silenciosa para alterar el PAM para que Cas9 no inducirá una rotura en la plantilla de reparación. El PAM requerido para la Cas9 utilizado en este protocolo es la secuencia de nucleótidos "NGG", donde "N" es cualquier nucleótido. Si es posible, uno de los nucleótidos G cambiar una A, C o T.- Si el PAM no puede ser transformado en silencio, introducir al menos 2 mutaciones silenciosas en los 6 pares de base directamente adyacentes a la PAM7,8.
Nota: Estas mutaciones evitar el reconocimiento de la plantilla de reparación por el gRNA y evitar que vuelva a cortar el locus reparado por Cas9/gRNA complejo. Las mutaciones de escudo pueden introducirse en la región de homología amplificando el ADN con las cartillas que contienen la mutación.
- Si el PAM no puede ser transformado en silencio, introducir al menos 2 mutaciones silenciosas en los 6 pares de base directamente adyacentes a la PAM7,8.
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Amplificar la región de homología ORF de la plantilla de reparación.
- Mediante PCR, amplificación 800 pares de bases del extremo 3' del ORF del gen objetivo. Diseño de los cebadores que se utilizará para excluir el codón de este amplicón.
- Diseño de los cebadores para la inserción de este amplicón en el pHA -MLG que ha sido digerido con SacII y AfeI a través de una reacción de ligadura de ADN o SLIC16.
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Amplificar la región de homología 3'-UTR de la plantilla de reparación.
- Mediante PCR, amplificar los 800 pares de bases, inmediatamente después del codón de parada del gen objetivo. Diseño de cebadores para la inserción de este amplicón en el pHA -MLG que ha sido digerido con HindIII y NheI a través de una reacción de ligadura de ADN o SLIC16.
Nota: El alto contenido del genoma de p. falciparum puede dificultar la amplificación de regiones como NC. Un enfoque alternativo al uso de PCR está sintetizando las regiones de homología.
- Mediante PCR, amplificar los 800 pares de bases, inmediatamente después del codón de parada del gen objetivo. Diseño de cebadores para la inserción de este amplicón en el pHA -MLG que ha sido digerido con HindIII y NheI a través de una reacción de ligadura de ADN o SLIC16.
4. clonación de regiones de homología en el plásmido de reparación
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Insertar la región de homología ORF en el pHA -MLG.
- Digerir la pHA -MLG con SacII y AfeI, según instrucciones del fabricante de la enzima. Inserte el producto PCR de región de homología ORF en el plásmido digerido con SLIC16.
- Transformar en competentes de e. coli , se realiza en pasos de 2.3.4 y 2.3.5.
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Insertar la región de homología 3'-UTR en un plásmido de pHA-MLG que ya contiene la región de homología ORF (ver paso 4.1).
- Digerir el plásmido con HindIII y NheI según instrucciones del fabricante de la enzima. Inserte el amplicon de región 3'-UTR homología plásmido digerido con SLIC16.
- Transformarse en competentes de e. coli y extraer el plásmido ADN (pasos 2.3.4 y 2.3.5).
5. precipitar el ADN para transfección
- Añadir 40 μg de pMK-U6 pUF1 Cas9 y pHA -MLG DNA (de un total de 120 μg de DNA) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.
- Añadir 1/10 del volumen de DNA de 3 M acetato de sodio en agua (pH 5,2) al tubo y se mezcla bien con un vortex (por ejemplo, si el volumen en el paso 5.1 fue de 100 μL, añadir 10 μL de acetato de sodio).
- Añadir 2,5 veces el volumen de etanol al 100% al tubo y se mezcla bien con un vortex durante al menos 30 s (por ejemplo, si el volumen de 5.1 fue de 100 μL, Añadir 250 μL de etanol al 100%).
- Coloque el tubo en hielo o a-20 ° C por 30 minutos.
- Centrifugar el tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
- Retire con cuidado el sobrenadante del tubo. No molestes a la pelotilla.
- Añadir 3 veces el volumen de etanol al 70% al tubo y mezclar brevemente mediante un vortex (e.g., si el volumen de 5.1 fue de 100 μL, añadir 300 μL de etanol al 70%).
- Centrifugar el tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
Nota: Este paso debe realizarse en condiciones estériles en un gabinete de seguridad biológica. - Retire con cuidado el sobrenadante del tubo. No molestes a la pelotilla. Deje el tubo abierto y permitir la pelotilla secar al aire durante 15 minutos.
- Almacenar el ADN precipitado a-20 ° C hasta que se necesite para la transfección.
6. aislar humanos glóbulos rojos de la sangre entera en preparación para transfección
- Sangre fresca alícuota en tubos cónicos estériles de 50 mL (aproximadamente 25 mL por tubo).
- Centrifugar los tubos a 1.088 x g durante 12 min, con frenos de centrifugar a 4.
- Aspirar el sobrenadante y buffy la chaqueta. Resuspender el precipitado de RBC, con un volumen igual de RPMI incompleto.
Nota: RPMI incompleto es preparado por suplir RPMI 1640 con 10.32 timidina μM, 110.2 hipoxantina μM, piruvato de sodio 1 m m, bicarbonato de sodio de 30 mM, 5 mM HEPES, 11,1 mM de glucosa y gentamicina de 0.02% (v/v). - Repita los pasos 6.2-6.3 dos veces. Después del último lavado, resuspender los eritrocitos en un volumen igual de RPMI incompleto y almacenar los tubos a 4 º C.
7. transferencia de glóbulos rojos con lo plásmidos CRISPR/Cas9 (a realizarse asépticamente)
Nota: Los cultivos de p. falciparum se mantienen como se describe en otros informes17. Mantener todos los cultivos a 37 ° C en 3% de O2, 3% CO2y 94% N2 a menos que se indique lo contrario. Cuando se usa la sangre de este protocolo, se refiere a los glóbulos rojos puros preparados en el paso 6. La sangre no debe ser mayor de 6 semanas, como por lo general hay una disminución en la proliferación del parásito en sangre mayores. Los siguientes pasos describen la cargando glóbulos rojos con la DNA y adición de una cultura del parásito a las células transfected. Otros protocolos de la transfección establecido son compatibles con la transferencia de estas construcciones18,19.
- Preparar un buffer de x cytomix 1 en agua (120 mM de KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 m m K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6). Filtro-esterilizar el búfer utilizando un filtro de 0,22 μm.
- Añadir 380 μL de la cytomix de 1 x al ADN precipitado en el paso 5 y agitar para disolver. Permitir que el ADN disolver en el cytomix 1 x durante 10 minutos, Vortex cada 3 min 10 s.
- En un tubo cónico de 15 mL estéril, mezclar 300 μL de glóbulos rojos (hematocrito de 50%, desde el paso 6) en el RPMI incompleto con 4 mL de 1 x cytomix.
- Centrifugue los hematíes de paso 7.3 en 870 x g durante 3 min y luego retire el sobrenadante de la pelotilla de RBC.
- Resuspender el pellet de RBC con la mezcla DNA/cytomix en el paso 6.2 y la transferencia a una cubeta de electroporación de 0,2 cm.
- Electroporate los hematíes mediante las siguientes condiciones: 0,32 925 μF en kV, capacidad para "Gran capacidad" y la resistencia se establece en "Infinito".
- Después de la electroporación, transferir el contenido de la cubeta a una 15 mL cónico que contiene 5 mL de RPMI completo (cRPMI). Centrifugar el tubo a 870 x g durante 3 min a 20 ° C y luego decantar el sobrenadante.
Nota: cRPMI se prepara por el método mismo como RPMI incompleto con la adición de albúmina de suero bovino 0.25% (p/v) ricos en lípidos. - Resuspender el precipitado en 4 mL de cRPMI y la transferencia de un bien en una placa de cultivo de tejidos bien 6. Añadir 400 μL de una cultura alto-esquizonte (7 – 10% esquizonte parasitemia es ideal) para los hematíes transfected.
Nota: Parasitemia se define como el porcentaje de glóbulos rojos infectados por el parásito. - Al día siguiente, lave la cultura con 4 mL de cRPMI. Centrifugar el cultivo a 870 x g durante 3 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender el cultivo en 4 mL de cRPMI.
- 48 h después de terminar paso 7.6, lave la cultura con 4 mL de cRPMI. Luego Resuspender la cultura en cRPMI que contiene 1 μM DSM1 seleccionar para el plásmido Cas9.
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Continuar el lavado las culturas cada día con cRPMI hasta que los parásitos no son visibles por frotis de sangre. Después de este punto, sustituir el medio de cultivo con cRPMI fresco y 1 μM DSM1 cada 48 h.
- Para hacer la sangre manchar, Pipetear 150 μL de cultivo en un tubo de centrífuga de 0.6 mL. Sedimenten las células por centrifugación a 1.700 x g durante 30 s.
- Aspirar apagado el sobrenadante. Utilice una pipeta para transferir las células concentradas a un portaobjetos de vidrio. Con un segundo portaobjetos de vidrio en un ángulo de 45° a la primera diapositiva, frotis de la gota de sangre. Mancha la diapositiva usando un kit de tinción comercialmente disponible según protocolo del fabricante.
- Ver los parásitos con un 100 X objetivo de inmersión de aceite.
- Comenzando 5 días post-transfección (paso 7.6), retirar 2 mL del cultivo con hematíes suspendidas en el medio de cultivo. Añadir back 2 mL de medio fresco (cRPMI plus 1 μM DSM1) y sangre en el 2% de hematocrito. Añadir sangre fresca de esta manera una vez a la semana hasta parásitos vuelven a aparecer, según lo determinado por frotis de sangre fina (paso 7.11).
Nota: Si la integración es exitosa, parásitos generalmente reaparecen en la cultura por la transfección después de un mes. - Una vez que resurgir de parásitos, eliminar la presión de drogas DSM1. Alternativamente, quitar presión de drogas después de parásitos han sido clonados hacia fuera.
8. control de parásitos para la integración de la plantilla de reparación
- Cuando los parásitos son visibles otra vez por frotis de sangre fina, aislar ADN de la cultura con un kit adecuado.
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Uso de PCR para amplificar la región modificada del genoma para determinar si el locus específico se ha modificado con éxito y si el locus de tipo salvaje no modificado (indicativo de parásitos de tipo salvaje) es detectable.
- Para detectar parásitos que han integrado la plantilla de la reparación, utilice un primer avance que se encuentra al principio del ORF, fuera de la región de homología clonados. Utilizar una cartilla reversa que se encuentra en el 3'-UTR.
Nota: Como esta amplificación incluye las secuencias de las etiquetas HA y glmS ribozyme, amplicones de parásitos integrados será más de la misma región amplificada en parásitos de tipo salvaje.
- Para detectar parásitos que han integrado la plantilla de la reparación, utilice un primer avance que se encuentra al principio del ORF, fuera de la región de homología clonados. Utilizar una cartilla reversa que se encuentra en el 3'-UTR.
9. clonación parásitos limitando la dilución
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Realizar diluciones seriadas de la cultura de parásito del paso 7.13 para alcanzar una concentración final de 0,5 μL de parásitos/200. Añadir 200 μL de la cultura diluida en los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos.
Nota: Debido a parasitemia se define como el porcentaje de glóbulos rojos infectados y el hematocrito también es un número definido (2%), el número de parásitos por unidad de volumen se infiere fácilmente.- Preparar 1 mL de cultivo en cRPMI al 5% parasitemia y un 2% de hematocrito (en estos niveles de parasitemia y hematocrito, la cultura contiene 1 x 107 parásitos/mL).
- Diluir esta cultura 1: 100 con cRPMI. Otra vez diluido 1: 100 con cRPMI.
- Diluir 1: 400. Realizar esta dilución mediante la adición de 62.5 μL de cultivo a 25 mL de cRPMI y 1 mL de sangre. Resultados de esta dilución en la concentración de 0,5 μL de parásitos/200.
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Mantenga la placa de clonación hasta que los parásitos son detectables en los pozos.
- Cada 48 h, sustituir el medio de la placa de 96 pozos con medio fresco.
- Una vez por semana, a partir de 5 días después del inicio de la placa de clonación (paso 9.1), saque 100 μL de cada pocillo y añadir espalda 100 μL de medio fresco + sangre (2% hematocrito).
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Identificar cualquier pozos que contienen parásitos.
- Coloque la placa de 96 pocillos en un ángulo de 45° por aproximadamente 20 min, permitiendo que la sangre colocar en un ángulo dentro de la placa.
- Coloque la placa de 96 pozos en una caja de luz. Tenga en cuenta que los pozos que contienen parásitos contienen los medios de comunicación que es amarillo en color, en comparación con los medios de comunicación rosa de pozos libres de parásitos, debido a la acidificación del medio por los parásitos.
- Con una pipeta serológica, mover el contenido de los pocillos que contienen el parásito a una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos para permitir la expansión de la parasitemia.
- Mediante análisis de PCR como se describe en el paso 8, compruebe estas líneas clonales parásito para su correcta integración.
10. precipitación de la proteína por el tratamiento de parásitos con glucosamina y confirmación por análisis de Western Blot
- Preparar una solución stock GlcN (glucosamina) de 0,5 M, que puede ser almacenada a-20 ° C.
- Añadir GlcN a las culturas de parásito de MLG y permitirles crecer en presencia de GlcN.
Nota: La concentración final y el momento de GlcN tratamiento depende de la línea de experimento y parásito. GlcN puede impactar el crecimiento del parásito, por lo que la cepa de parásito de los padres debe ser expuesta a una gama de GlcN concentraciones para determinar su sensibilidad al compuesto. A menudo, una concentración de 2.0-7.5 mM GlcN es usado13,14,20. - Aislar las muestras de proteína de los parásitos tratados GlcN13.
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Utilizar muestras de proteínas para análisis de western blot para detectar reducciones en la proteína13.
- Utilizar un anticuerpo anti-HA según las instrucciones del fabricante para detectar la proteína HA-GLM-etiquetadas. Comparar una banda de HA a un control de carga, como PfEF1α.
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Representative Results
Figura 1muestra un esquema de lo plásmidos utilizados en este método, así como un ejemplo de una mutación de escudo. Como un ejemplo de cómo identificar parásitos mutantes después de transfección, resultados de PCRs para comprobar la integración de la construcción HA -MLG se muestran en la figura 2. Una imagen representativa de una clonación de la placa se muestra en la figura 3 para demostrar el cambio de color del medio en presencia de parásitos. Los resultados de un análisis de la inmunofluorescencia y western blot experimentos se muestran en la figura 4 para demostrar la funcionalidad de la etiqueta HA y MLG-basado en la reducción de proteínas en los parásitos. Figura 5 muestra la incapacidad de armas corta homología en los productos PCR para modificar el genoma del parásito y obtener a mutantes viables.
Figura 1: Resumen de nuestro enfoque de tres plásmidos CRISPR/Cas9 y ejemplos de una mutación de oligo y escudo de gRNA. (A) esquema de vacío pHA-MLG y pMK-U6 se muestra con los sitios de la enzima de restricción utilizados para la clonación. También se muestra pHA-MLG y pMK-U6 después de los brazos de homología y gRNA secuencias han sido clonadas en ellos, respectivamente. Por último, se muestra Cas9 pUF1. yDHOD = Dihidrofolato reductasa de la levadura, el marcador de resistencia a DSM1. (B) se muestra el oligo forward utilizada para clonar la secuencia de gRNA PfHsp70x en pMK-U6, con la secuencia de gRNA en letras mayúsculas y los brazos de la homología de pMK-U6 es necesarios para la clonación en minúsculas (arriba). El objetivo de genomic de la gRNA PfHsp70x se muestra como el PAM aguas abajo, en rojo (medio). La mutación de escudo en la gRNA PfHsp70x PAM aparece en rojo (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema de la modificación del genoma CRISPR/Cas9 usando pHA-MLG y una estrategia para confirmar la integración de. (A) Cas9, guiado a un locus genómico por un gRNA, induce una rotura de doble hebra en el ADN. El parásito repara el daño a través de doble cruce homólogo reparación, usando el plásmido pHA-MLG como plantilla e introduciendo la secuencia HA-MLG en el genoma. La prueba de (B) una PCR para identificar la correcta integración de la secuencia HA-MLG. Usando las cartillas P1 y P2, los 3' ORF de mutantes de tipo PfHsp70x y PfHsp70x -MLG son amplificados13. El amplicon de MLG PfHsp70x es más de tipo salvaje debido a la inserción de la secuencia HA-MLG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: identificación de los pozos que contienen parásitos en una placa de 96 pocillos clonación. (A) la placa de 96 pozos se encuentra en un ángulo de 45 ° por aproximadamente 20 minutos para permitir que la sangre para colocar en un ángulo de la placa. (B) el pozo de la izquierda contiene una cultura parásito, indicada por el color amarillo del medio en comparación con el medio rosa del parásito libre en el derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: un análisis de la inmunofluorescencia muestra el HA-etiquetado correcto de PfHsp70x y Western Blot muestra reducción de niveles de proteína de PfHsp70x durante el tratamiento con glucosamina. (A) PfHsp70x -MLG parásitos fueron fijados y teñidos con DAPI (marcador del núcleo) y anticuerpos frente a HA y MAHRP1 (membrana asociados histidina Rich Protein 1, un marcador de proteína de exportación para el anfitrión RBC)13. (B) PfHsp70x -MLG parásitos fueron tratados con glucosamina de 7,5 mM, y lisados de todo parásito fueron utilizados para Western Blot análisis13. La membrana fue sondada con anticuerpos para HA y PfEF1α como una carga de control13. Como era de esperar, tratamiento de glucosamina resultó en una reducción de la proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: utilizando secuencias de homología corta para reparación. (A) representación esquemática mostrando octavos de final de GFP en B7 parásitos21. B7 los parásitos son un derivado de la 3 de 7 en la que II Plasmepsin se ha etiquetado con GFP. Productos PCR que contiene 50, 75 o 100 pares de regiones de homología GFP que flanquean un cassette de resistencia blasticidin S (etiquetado como "marcador"), junto con pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, un plásmido de expresión Cas9 y una gRNA GFP, fueron transfectadas en B7 parásitos. Cada transfección se llevó a cabo dos veces. DSM1 drogas presión fue aplicada 2 días post-transfección. (B) se muestra aquí son las pruebas de PCR en la DNA aislada de parásitos transfected 5 días post-transfección y transfección después de 2 meses. Cebadores utilizados para probar la integración de los cassettes de resistencia BSD producirá un producto 584-pares para parásitos parentales B7 y un producto de 2020-par de parásitos que han integrado el marcador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La implementación de CRISPR/Cas9 en p. falciparum tiene tanto aumentó la eficacia de y redujeron la cantidad de tiempo necesario para modificar el genoma del parásito, en comparación con los métodos anteriores de manipulación genética. Este protocolo integral esboza los pasos necesarios para la generación de mutantes condicionales utilizando CRISPR/Cas9 en p. falciparum. Mientras que el método está orientado específicamente para la generación de mutantes deMLG HA -, esta estrategia puede adaptarse para una variedad de necesidades, incluyendo la selección de genes, golpes de gracia del gene y la introducción de mutaciones puntuales.
Un primer paso crítico en este protocolo es la selección de una secuencia de gRNA. Al seleccionar un gRNA, hay varios puntos a considerar como donde se encuentra el gRNA, cuán eficiente es y si tiene el potencial para efectos off-target. La secuencia de gRNA debe ser lo más cercana posible al sitio de modificación, idealmente dentro de 200 pares de bases. Esto disminuye la probabilidad de que los parásitos utilizando la plantilla de reparación para arreglar su genoma sin integrar la etiqueta. La herramienta que se utiliza aquí para localizar la gRNA era un servicio gratuito en línea, llamado CHOPCHOP22. Otra herramienta online, CRISPR patógenos eucariotas guía herramienta de diseño de ARN/ADN (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), también puede ser usado23. EuPaGDT proporciona una caracterización adicional de gRNA secuencias, incluyendo predicción de golpes fuera de objetivo y potenciales problemas que pueden evitar la transcripción de la gRNA. EuPaGDT también tiene herramientas para procesamiento por lotes de gRNAs a múltiples genes o genomas enteros. El gRNA seleccionada debe ser aquella que se sienta más cercano al sitio de modificación con la máxima eficiencia y mínima objetivo hits. Una importante limitación de CRISPR/Cas9 gene edición que puede surgir es la incapacidad para diseñar una gRNA conveniente dirigir el gen de interés. En tales casos, puede necesitarse un enfoque de ensayo y error, usando múltiples secuencias de gRNA óptimo hasta que encuentre la mejor opción, y gene exitosa edición ha ocurrido.
Otro factor importante a considerar al generar a mutantes de p. falciparum usando CRISPR/Cas9 es la longitud de las regiones de homología en la plantilla de reparación. Este protocolo se recomienda que las regiones de homología deben ser de aproximadamente 800 pares de bases cada uno, pero también hemos tenido éxito en el uso de numeración 500 pares de bases3de regiones más pequeñas. Modificación exitosa del genoma usando CRISPR/Cas9 y homología corta brazos productos de PCR se han utilizado también en otros parásitos protozoos como Toxoplasma gondii y Trichomonas vaginalis24,25. Hemos probado la viabilidad de utilizar pequeños brazos de homología en los productos PCR (50, 75 o 100 pares de bases) por intentar nocaut GFP en B7 parásitos usando una resistencia de blasticidin cassette21. Vimos algunos integración del cassette de resistencia blasticidin en 5 días post transfección; sin embargo, estos parásitos se recuperaron nunca de transfección. Seleccionamos para el plásmido Cas9 expresar usando DSM1 para estos transfecciones. Un método de selección diferente, como tratar las culturas transfected con blasticidin S solo o en combinación con DSM1, puede mejorar las posibilidades de parásitos reapareciendo cuando utilizar regiones de homología cortas para la reparación de los saltos de Cas9 gRNA-inducido. En este caso, no seleccionamos con blasticidin S puesto que queríamos probar si armas de homología corta podrían ser utilizados en casos donde un cassette de resistencia de la droga no está siendo integrado en el genoma, como cuando una proteína es ser etiquetada.
Los componentes básicos de CRISPR/Cas9 gene edición discuten son la endonucleasa Cas9, la gRNA y la plantilla de reparación. Describimos un acercamiento de tres plásmidos para introducir estos componentes en los parásitos, donde Cas9, la gRNA y la plantilla de reparación se encuentran en plásmidos separados. Además de este enfoque, nuestro laboratorio ha sido exitosa en el uso de un enfoque de dos plásmidos que expresión Cas9 y gRNA son conducidas por un único plásmido y la plantilla de reparación se encuentra en un segundo plásmido3. Enfoques de dos plásmidos similares también han sido empleados con éxito por otros laboratorios para generar mutantes7,8,26,27,28,29 Además, varios laboratorios están utilizando una cepa de Plasmodium (NF54attB) que expresa constitutivamente Cas9 y una polimerasa del RNA T7 a la expresión de la unidad de gRNAs30. En este caso, un único plásmido que contiene la plantilla de la reparación y la gRNA son transfectados en NF54attB parásitos31,32. Finalmente, se ha utilizado un enfoque libre de plásmido utilizando una ribonucleoproteína purificada de gRNA Cas9 complejo introducir mutaciones en el genoma, como bien33. El éxito de estos diferentes enfoques muestra la flexibilidad de los métodos en que los investigadores pueden introducir componentes Cas9/gRNA en el parásito.
Por último, la elección de la presión de la droga para aplicar a los parásitos transfected puede ser alterada, según constructos utilizados. Aquí, mostramos exitosa generación de mutantes seleccionando transitoriamente para el plásmido Cas9 expresando con DSM1 hasta parásitos vuelven a aparecer. Para generar parásitos de octavos de final de PfHsp70x, pfhsp70x fue reemplazado por el gen de la reductasa de dihidrofolato humanos y parásitos fueron entonces seleccionados usando WR9921013. El recientemente descrito sistema precipitación Tet-PfDOZI se basa en la integración de un plásmido que contiene un gen de resistencia de blasticidin S, permitiendo para la selección de parásitos utilizando blasticidin S15,31.
En general, CRISPR/Cas9 gene edición de p. falciparum ha demostrado para ser una poderosa herramienta en la investigación de la malaria, y el protocolo aquí detalles de los métodos para la generación de mutantes condicionales de precipitación3,7,8 , 13 , 20 , 28. este protocolo es altamente adaptable a los intereses de la investigación individual.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Muthugapatti Kandasamy en el centro de microscopia Biomédica de Universidad de Georgia (UGA) para asistencia técnica y Juan Jose Lopez-Rubio por compartir la plásmidos pUF1 Cas9 y pL6. Este trabajo fue apoyado por premios de la Fundación de arcos D.W.C. y H.M.K., otorga fondos de inicio UGA a V.M., subvenciones de la Fundación marcha de Dimes (Premio de investigación de albahaca o ' Connor arrancador erudito) a V.M. y nos institutos nacionales de salud (R00AI099156 y R01AI130139) a V.M. y (T32AI060546) a H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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