Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, wie eine Nähe Ligation Assay (PLA) verwenden, um MST1/MST2 Heterodimerization in festen Zellen mit hoher Empfindlichkeit zu visualisieren.

Zusammenfassung

Regulierte Protein-Protein-Interaktionen sind ein leitendes Prinzip für viele Signalisierung Veranstaltungen, und die Erkennung solcher Ereignisse ist ein wichtiges Element für das Verständnis, wie solche Wege organisiert sind und wie sie funktionieren. Es gibt viele Methoden, um Protein-Protein-Interaktionen in den Zellen zu erkennen, aber relativ wenige können verwendet werden, um Interaktionen zwischen endogenen Proteinen zu erkennen. Eine solche Methode, Nähe Ligatur Assay (PLA), hat mehrere Vorteile, seine Verwendung zu empfehlen. Im Vergleich zu anderen gängigen Methoden der Proteinprotein Interaktionsanalyse, PLA hat relativ hohe Sensitivität und Spezifität, mit minimalen Zelle Manipulation und im Protokoll beschriebenen erfolgen kann, erfordert nur zwei gezielt Antikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten (zB., von Mäusen und Kaninchen) und eine spezielle Reagenzien: eine Reihe von sekundären Antikörper, die kovalent verknüpfte spezifischer Oligonukleotide sind, wenn in unmittelbarer Nähe zueinander gebracht, erstellen ein amplifiable Plattform für in Situ PCR oder rollenden Kreis Verstärkung. In diesem Vortrag zeigen wir, wie die PLA-Technik, um Änderungen in MST1 und MST2 Nähe in festen Zellen visualisieren anwenden. Die Technik in diesem Manuskript beschrieben gilt vor allem für die Analyse der Zelle Studien.

Einleitung

Störung der MST1/Hippo-Signal wurde mit Entwicklungsstörungen und Karzinogenese¹verbunden. Bei Säugetieren, die Kinasen MST1 und MST2 aktivieren (phosphorylieren) MOB1 und LATS1/2, von denen die letztere dann phosphorylates und inaktiviert die transkriptionelle Coaktivator ja-assoziierten Protein (YAP)². In seiner aktiven Form (unphosphorylated) hat YAP Onkogenen Aktivität, Verbesserung der Transkription von Genen Zelle Verbreitung; umgekehrt, wenn YAP durch den Hippo-Weg inaktiviert, Zellproliferation wird unterdrückt und Apoptose gefördert³. In Geweben MST1 und MST2 gibt es hauptsächlich als akt....

Protokoll

1. Vorbereitung der Lösungen

1. Bereiten Sie Fixativ Lösung: 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer. Nehmen Sie für 10 mL, 2,5 mL 16 % PFA und 7,5 mL 1 X PBS.
   Gefahren: PFA ist in geringen Dosen krebserregend. Dämpfe und Hautkontakt sind gefährlich. Shop bei-20 ° C.
2. Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung: 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer. Fügen Sie für 100 mL der Lösung 100 µL Triton x-100 in 100 mL 1 X PBS hinzu. Lagerung bei Raumtemperatur (RT).
3. Waschpuffer vorbereiten: 1 X TBST. Nehmen Sie für 1 L 100 mL 10 X TBS, dH₂O 890 mL und 10 mL Tween 20 (10 %).
4. Bereiten Sie blockierende Lösung als....

Ergebnisse

Wir verwendet die PLA-Assay, um die Interaktion zwischen MST1 und MST2 in HEK-293 und Royal zu testen. Die Zellen wurden behoben, permeabilized und befleckt mit verschiedenen Antikörpern, gefolgt von in Situ Verstärkung nach dem PLA-Protokoll (Abbildung 1). Um das Niveau der MST1/MST2 Heterodimerization zu dokumentieren, wurden Zellen mit MST1 und MST2 Antikörper (Abb. 1A, 1 C und 1 G) gebeizt. Als Posit.......

Diskussion

Wir fanden es nützlich, Kammer Objektträger für dieses Experiment zu verwenden, wie es sehr praktisch zum Experiment mit mehreren (14-16) Zelllinien durchführen ist und es keine Notwendigkeit gibt, die Probe jedes Mal während der Mikroskopie Analyse ändern. Ein paar Komplikationen auftreten, wie ein erhöhtes Risiko für Cross-Kontamination mit Antikörpern. Daher empfehlen wir waschen jeden gut einzeln anstatt Kanope Coplin, trotz der erhöhten während des Experiments. Darüber hinaus Entfernen von Silikon-Einlage ist eine h.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Objektträger	Thermo Fisher Scientific	178599	16 Well, Glasobjektträger
PLA-Sonde Anti-Maus Minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	Enthält 1x Blockierungslösung, 1x Antikörper Verdünnungsmittel
PLA Sonde Anti-Kaninchen PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	Enthält 1x Blockierungslösung, 1x Antikörper Diluent
Wash Buffers, Flurescence	Sigma-Aldrich	DUO82049	Enthält Waschpuffer A und Waschpuffer B
Eindeckmedium mit DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
Detektionsreagenzien Rot	Sigma-Aldrich	DUO92008	Enthält 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlifikationsrot, 1x Polymerase
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antikörper	Zellsignalisierung	9102S
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)	Zelle Signalweg	5726s	pERK Antikörper
MST2 Antikörper	Cell Signaling	3952s
Krs-2 (RJ-5)	Santa Cruz	sc-100449	MST1 Antikörper
16% Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie sciences	15710	Verdünnung auf 4% PFA in PBS zur Fixierlösung
Triton x100	Fisher BioReagents	BP 151-500	Zur Aufbereitung von 0,1 % Triton x-100 in 1xPBS für die Permeabilisierungslösung
Konfokale Mikroskopie	Leica TCS SP8, 63x		Bildanalyse mit der ImageJ-Software