Summary
Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die Methode für die Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Dies ist ein einfaches und schnelles Verfahren, Genexpression während der Entwicklung zu überwachen, auch die Gewebeschnitte, angewendet werden können, Organe oder kultivierten Zellen.
Abstract
Die Escherichia coli LacZ gen, β-Galaktosidase wird weitgehend als Reporter für die Genexpression und als Tracer in Zell-Linie Studien verwendet. Die klassische histochemische Reaktion basiert auf der Hydrolyse des Substrats X-gal in Kombination mit Eisen und Eisen-Ionen, die einen unlöslichen blauen Niederschlag, das einfach produziert zu visualisieren. Daher dient β-Galaktosidase Aktivität als Marker für das Muster des Ausdrucks des Gens von Interesse, wie die Entwicklung verläuft. Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die nachfolgende Methode für Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Klärung der ganzer Embryos zur Verfügung gestellt, um X-gal-Färbung in tiefere Regionen des Embryos besser zu visualisieren. Konsistente Ergebnisse erhält man durch die Durchführung dieses Verfahrens, obwohl Optimierung der Reaktionsbedingungen benötigt wird, um die Hintergrundaktivitäten zu minimieren. Einschränkungen in der Probe sollte betrachtet werden, insbesondere im Hinblick auf die Größe des Embryos in der ganze Berg Färbung. Unser Protokoll bietet eine sensible und eine zuverlässige Methode für β-Galaktosidase-Erkennung bei der Maus-Entwicklung, die den Kryostaten Abschnitte sowie ganze Organe weiter angewendet werden kann. So, die dynamische gen Expressionsmuster während der gesamten Entwicklung mithilfe dieses Protokolls in ganzen Embryonen leicht analysiert werden können, sondern auch detaillierte Ausdruck auf zellulärer Ebene nach Paraffin-Schnitt beurteilt werden kann.
Introduction
Um spezifische gen Expressionsmuster zu beschreiben, ist die Verwendung von Reporter-Gene als Marker von Drosophila , Säugetiere von größter Bedeutung gewesen. In Experimenten mit transgenen und Knockout Tieren ist das bakterielle β-galaktosidase-Gen (LacZ) von Escherichia coli (E. Coli) eines der am weitesten verbreitete1,2,3, 4. β-Galaktosidase (β-gal) katalysiert die Hydrolyse von β-galactosiden (z. B. Laktose) in seine Monosaccharide (Glukose und Galaktose)5. Die am häufigsten verwendeten Substrat wird X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), ein Glykosid, das durch β-Galaktosidase geben Anlass zu 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole und Galactose hydrolysiert wird. Die erste ist in ein Dimer oxidiert, bei Verwendung in Kombination mit Kalium Ferri- und Ferro-Cyanid, produziert eine charakteristische unlöslich, blauer Farbe Niederschlag (Abbildung 1)6.
Das LacZ gen begonnen, als ein Reportergen vor über dreißig Jahren verwendet werden7,8. In der Regel LacZ eingefügt nachgeschaltet eine endogene Veranstalter an die Stelle der offenen Leserahmen, sodass es in Zelle und bakterielle Kultur, Zellen mit einem bestimmten Einsatz zu visualisieren sowie bei transgenen Tieren als Tracer von endogenen verwendet werden kann gen Expressionsmuster während Entwicklung9. In diesem Zusammenhang ist die Visualisierung der β-Galaktosidase Aktivität beträchtlich in Drosophila benutzt worden, um zu verstehen, die Entwicklungs- und zelluläre Prozesse aus einzelnen Zellen ganze Gewebe. Drosophila Genetik zugunsten die Generation stabile Linien, in denen eine modifizierte P-Element Konstrukt, enthält das Reportergen LacZ ist nach dem Zufallsprinzip Standorte im Genom eingefügt. So kann wenn unter dem Einfluss von Enhancer-Elemente platziert es seinen Ausdruck Gewebe gezielt, fahren, die die systematische Analyse der Expressionsmuster vieler Gene während den vergangenen zwei Jahrzehnten10erlaubt hat. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von transgenen Mäusen LacZ -gen-Expression zu überwachen auch Erkennung von Gen rekombinationsereignisse von Cre-LoxP vermittelte Rekombination und Lokalisierung der mutierten embryonalen Stammzellen Derivate in Chimären Analysen 11, erleichtert die Kontrolle des LacZ Ausdruck in bestimmten Geweben sowie wie zeitlich. Auch kann im ganzen Embryonen, Erkennung der β-Galaktosidase Aktivität differentielle Färbung Muster bei verschiedenen Intensitäten produzieren, die bequem in verschiedenen Entwicklungsstadien zu zeitliche Veränderungen in der Genexpression analysieren beobachtet werden können 8,12.
In diesem Artikel präsentieren wir ein Protokoll zur Genexpression durch X-gal visualisieren im ganzen Berg Gewebe in frühen Entwicklungsstadien von mäuseembryonen Färbung. Wir präsentieren diese histochemische Methode als eine hochempfindliche und kostengünstige Technik, die präzise Erkennung der markierten Zellen im ganzen Mount Proben oder auf zellulärer Ebene begünstigt, nachdem Paraffin Gewebe oder Embryonen eingebetteten. Die Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der Färbung im Maus-Gewebe mit dem minimalen Hintergrund im Vergleich zu anderen Methoden13.
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Protocol
Alle experimentelle Verfahren wurden vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) und der Comunidad Autónoma de Madrid gewährleisten minimalen Tierleid genehmigt.
1. Sammlung von Embryonen von schwangeren Mäusen (von E8.5 bis E12.5)
- Schwangere Mäusen durch zervikale Dislokation oder CO2 -Inhalation zu opfern. Am Tag der ersten beobachtet vaginalen Stecker galt embryonalen Tag 0,5 (E0.5).
- Legen Sie das Tier in der Rückenlage auf das Saugkissen und reinigen Sie die Bauchhaut der Maus mit 70 % Ethanol.
Hinweis: Sterilität ist in den folgenden Schritten nicht erforderlich. - Kneifen Sie und heben Sie die Bauchhaut mit Maus-Zahn-Pinzette.
- Machen Sie einen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke, 2 bis 4 cm vertikal über der Mittellinie des Bauches mit einer chirurgischen Schere.
- Setzen Sie den Bauch und entfernen Sie die uterine Hörner von der Mutter mit Zange schneiden Blutgefäße entlang der inneren Krümmung des Uterus mit Chirurgische Schere.
- Entfernen Sie die Zeichenfolge von Embryonen und überträgt es auf einer Petrischale auf Eis mit 10 mL eiskaltes 0,01 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung pH-Wert 7,4 (PBS).
- Die Embryonen aus der Gebärmutter unter einem Stereomikroskop in einer Petrischale mit 10 mL frisches eiskaltem PBS sorgfältig zu sezieren. Fassen Sie die muskelwand mit Uhrmacher Pinzette die Fruchtblase aussetzen und dann reißen Sie die amniotische Membrane um die eingeschlossenen Embryo und der Dottersack mit den Spitzen der Zange zu entfernen.
- Sammle die stellt Embryonen von schwangeren Mäusen in frühen Stadien (von E8.5 bis E12.5) (Abbildung 2).
- Transfer der Embryonen nach ein frisches Gericht mit 10 mL kalten 1 X PBS mit gebogenen Pinzette oder für sehr kleine Embryonen (E8.5-E9.5), Kunststoff Transfer Pipetten verwenden, um die Proben ohne Embryo Schaden nehmen.
- Vor dem Start der Fixierung nehmen Sie eine embryonale Probe in einem Microcentrifuge Schlauch für die Genotypisierung indem Sie schneiden ein kleines Stück des Embryos oder die amniotische Membrane in die kleinste Embryonen (von E8.5 bis E9.5) mit der Uhrmacher Pinzette.
Hinweis: LacZ Genotypisierung wird bestimmt durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Primer: vorwärts, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; umkehren, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.
2. Fixierung von Mäuseembryonen
- Übertragen Sie jeder Embryo in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer runden Basis, enthält 1 mL 1 X PBS.
Hinweis: Führen Sie alle Schritte im Protokoll dieser Röhren unter Rühren mit einem rollenden Shaker. - Waschen Sie die Embryonen mit 1 X PBS-Puffer für 1 min bei Raumtemperatur, das restliche Blut zu beseitigen. Einsatz Kunststoff Transfer Pipetten, Flüssigkeiten in den Rohren zu ändern.
- Befestigen Sie den Embryo in 1 mL 0,125 % Glutaraldehyd auf Eis.
Hinweis: Die Zeit der Befestigung hängt von der Größe des Embryos: 20 min für E8.5-E9.5 Embryonen, 30 min für E10.5 Embryonen und 1 h für E12.5 Embryonen. - Entfernen Sie das Fixiermittel zu und waschen Sie die Embryonen in 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur vor der Verarbeitung der Probenmaterials für X-gal-Färbung.
(3) ganze Mount β-Galaktosidase Histochemie von Mäuseembryonen
- Bereiten Sie X-Gal spülen Puffer und X-Gal-Färbelösung vor Beginn des Verfahrens (siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein Wildtyp (WT) stellt Embryonen als Negativkontrollen für die enzymatische Reaktion.
- Inkubieren Sie die Embryonen im X-Gal spülen Puffer für 10 min bei Raumtemperatur (Abbildung 2).
- Inkubieren Sie die Embryonen in X-Gal-Färbelösung 2 h über Nacht bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden. Überwachen Sie die Farbreaktion in regelmäßigen Abständen über einen sezierenden Mikroskop bis ausreichender Intensität der Blaufärbung ohne den Hintergrund des Embryos beobachtet wird. Halten Sie den pH-Wert der Lösung zwischen 8 und 9, Hintergrund während der ganzen Färbung zu reduzieren. Wenn die Färbelösung Licht zu drehen beginnt, ersetzen sie durch frisches Substrat-Lösung, die enzymatische Reaktion zu verlängern.
- Die Reaktion zu stoppen, wenn das gewünschte Signal entsteht durch Waschen Embryonen in einem Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur.
- Transferieren Sie die gefärbte Embryonen zu 1 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) zu beheben, neu für 1 h bei 4 ° c über Nacht
Hinweis: Embryonen können gespeichert werden, bei 4 % PFA/PBS für längere Zeit bei 4 ° C oder für Schnitt sofort verarbeitet werden können. Dieser endgültige Fixierung-Schritt ist entscheidend für den langfristigen Erhalt des Musters Färbung. - Waschen Sie die Embryonen in 1 mL 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur.
- Option 1: Deaktivieren Sie Embryonen durch Eintauchen in eine Reihe von Lösungen mit steigenden Konzentrationen des Glycerins (20 %, 40 %, 60 % und 80 % Glycerin in 1 X PBS) für 1 h bei Raumtemperatur in jeder Lösung.
Hinweis: Waschen Embryonen in 80 % Glycerin für längere Zeit, sogar Tage, bis sie gelöscht werden, und dann Sie sie in 80 % Glycerin bei 4 ° C bei diesem Schritt (Abbildung 2 speichern). Eine sehr kleine Menge von Natrium-azid Ora Kristall von Thymol hinzufügen die Embryonen, die bei 4 ° C in Glycerin oder 1 X gespeichert wird PBS empfohlen, um Schimmelbildung zu verhindern. Nach der Reinigung, können ganze Berg Embryonen verwendet werden, für das Fotografieren (Schritt 4). - Option 2: Prozess Embryonen für Paraffin einbetten und Schneiden mit einem Mikrotom (Abbildung 2). Dokumentieren Sie das Muster des Ausdrucks im ganzen gefärbten Embryonen vor schneiden (Schritte 4 und 5).
4. Fotografie der ganze Berg Embryonen
- Ganzen Berg gebeizt Embryonen vor dem Schneiden zu fotografieren, übertragen Sie sie auf einer Petrischale vorbereitet mit einer Grundfläche von verfestigt 1-2 % Agarose in 1 X PBS.
- Decken Sie den Embryo komplett mit 10 mL 1 X PBS in der Agarose-beschichtete Gerichte, Dehydrierung und Reflexion beim Fotografieren durch die Flüssigkeit zu verhindern.
- Den Embryo mitten in 1 X PBS mit Pinzette zu orientieren. Machen Sie für ältere Embryonen (E10.5-E12.5) ein kleines Loch in der Agarose mit Zangen, platzieren und positionieren Sie die Probe innerhalb es in verschiedenen Winkeln und der frei schwebenden beim Fotografieren zu vermeiden.
- Legen Sie die Schale auf der Bühne Stereomikroskop mit übertragen (unter Stufe) Licht. Wechsel zwischen "dunkel-Feld" und "Hellfeld" Anpassungen, legen Sie die gewünschte Beleuchtung beim Fotografieren und die Lichtdurchlässigkeit der Probe zu optimieren.
Hinweis: Verwenden Sie Fiber optic Beleuchtung für späteren Zeitpunkt Embryonen Reflexion an der Oberfläche des Embryos zu vermeiden. Beim Fotografieren von gerodeter Embryos das gleiche Verfahren aber übertragen Sie sie auf einer Petrischale mit 100 % Glycerin und tauche sie ein vollständig.
(5) Paraffin einbetten und Schneiden von X-gal gebeizt Embryonen
- Paraffin Wachs einbetten
- Entfernen Sie die X-gal gebeizt Embryonen von 4 ° C (Schritt 3.5) zu und waschen Sie sie mit 1 mL 1 X PBS dreimal um die Überschreitung des fixiermittels zu beseitigen.
- Übertragen Sie jedes Embryo eine Histologie-Kassette mit Pinzette.
- Legen Sie die Kassetten mit den Embryonen in ein Becherglas und dann austrocknen, indem man sie durch eine abgestufte Ethanol-Reihe bei Raumtemperatur: 70 % Ethanol, einmal für 30 min; 96 % Ethanol, zweimal für jeweils 30 min.; 100 % Ethanol, zweimal für jeweils 30 min..
Hinweis: Embryonen können für eine unbestimmte Zeit bei 4 ° C bis der Dehydrierung beginnen in 70 % igem Ethanol gespeichert werden. - Inkubieren Sie die ganze Kassette in Isopropanol für 30 min bei Raumtemperatur.
- Übertragen Sie durch die Verwendung einer Pinzette die Kassetten zu einem Glas Färbung Trog mit vorgewärmten Isopropanol und im Ofen bei 60 ° C für 30 min lassen.
- Legen Sie die Kassetten in ein neues Glas Färbung Trog mit einer Mischung aus 50 % Isopropanol / 50 % Paraffinwachs geschmolzen und für 4 h in einem 60 ° C Ofen verlassen.
- Inkubieren Sie die Kassetten mit den Embryonen mit zwei Änderungen von geschmolzenem Paraffinwachs, 30 min bei 60 ° C.
- Am Ende des letzten Paraffin waschen Öffnen der Kassette und jedes Embryo eine separate Gewebe einbetten Form, um die Probe unter einem Stereomikroskop zu übertragen.
- Füllen Sie den Brunnen mit geschmolzenem Paraffinwachs bei 60 ° C. Verwenden Sie beheizte Zangen halten das Wachs geschmolzen und vorsichtig den Embryo in der Form orientieren.
Hinweis: Die korrekte Ausrichtung der Probe ist ein entscheidender Schritt für den Embryo in der gewünschten Fläche schneiden. - Bevor Paraffin in der Kokille erstarrt, legen Sie eine Kassette ohne Deckel oben auf dem Block und füllen Sie es mit geschmolzenem Paraffinwachs. Lassen Sie das restliche Wachs Abkühlen bis über Nacht bei Raumtemperatur erstarrt.
- Sobald das Paraffin vollständig erstarrt ist, entfernen Sie den massiven Block aus der Form und speichern Sie der Paraffin-Blöcke bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C bis14-Schnitt.
- Paraffin-Schnitt
- Richten Sie das Blade am Mikrotom und 5-7 µm Dicke eingerichtet. 5.2.2. kühlen Sie paraffinblock auf dem Eis ab und schneiden Sie es um einen Würfel oder eine Pyramide zu produzieren.
- Das Mikrotom-Inhaber zuordnen Sie den Block mithilfe eine kleine Menge geschmolzenes Wachs.
- Die Block für den optimalen Schnitt zu orientieren. Abschnitt der Paraffin-Blöcke in 5-7 µm dicke Scheiben bei Raumtemperatur mit standard Mikrotom.
- Mit einem feinen Pinsel, legen Sie die Abschnitte in einem Wasserbad bei Raumtemperatur für Manipulation und Scheiben auswählen.
- Abschnitte aus dem Wasserbad mit einem Mikroskop-Objektträger abholen und in einem Wasserbad bei 42 ° C für stretching überführen.
- Abschnitte aus dem Wasserbad nehmen und vorsichtig auf Adhäsion Objektträger legen.
- Trocknen Sie die Folien auch in einem Ofen bei 37 ° C über Nacht zu den Abschnitten vollständig einzuhalten, andernfalls können sie verloren gehen während der Färbung.
Hinweis: Bewahren Sie die Folien bei 4 ° C bis Färbung Verfahren ab.
- 4.wenn und X-Gal-gefärbten Paraffin Abschnitte Gegenfärbung
- Legen Sie die Folien auf einem Objektträger Tablett in einem Ofen bei 60 ° C für mindestens 45 Minuten, das Paraffinwachs flüssiger zu machen.
- Übertragen Sie die Folien auf einem Gestell und Glas Färbung Gerichte verwenden, um die folgenden Schritte ausführen: Tauchen Sie die Zahnstange in die färbeküvetten mit Alkoholen der abnehmenden Konzentrationen für komplette Paraffin entfernen und Hydratation des Gewebes: Isopropanol für 5 min bei 60 ° C; Isopropanol für 3 min; 100 % Ethanol für 2 min; 96 % Ethanol für 1 min; 70 % Ethanol für 1 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie Abschnitte in destilliertem Wasser zweimal, um sicherzustellen, dass es keine Alkohol-Rückstände gibt.
- Gegenfärbung Abschnitte mit einem Fleck (z.B. Nuclear-schnell rot-Lösung) für 5 min (in der Regel zwischen 3-8 min) bei Raumtemperatur (Abbildung 2).
Hinweis: Diese Färbung hilft, um allgemeine Gewebestruktur in den Abschnitten zu offenbaren. - Nach dem Färben, waschen Sie die Folien in destilliertem Wasser für 1 min und überprüfen Sie Abschnitt Färbung im Mikroskop zu.
Hinweis: Wenn die gewünschte Färbung zu schwach ist, Abschnitte gegenfärbung wieder für eine längere Zeit. - Abschnitte in der folgenden Serie mit steigenden Konzentrationen von Ethanol zu entwässern: zwei Wäschen in 95 % igem Ethanol für 2 min, zwei wäscht in 100 % igem Ethanol für 2 min, und um zu vermeiden, löst die blaue Farbe ausfällt, nur eine schnelle Wäsche in Xylol.
- Entfernen Sie die Folien aus dem Rack eins nach dem anderen, und legen Sie sie auf ein Stück Papier. Dann schieben Sie Mount und Deckglas mit einem synthetischen, dauerhafte Montage Medium.
Hinweis: Xylol Produkt ist ein brennbarer deren Dämpfe ärgerlich und schädlich für die menschliche Gesundheit und für Wasserorganismen sind. Es muss innerhalb einer Kapuze manipuliert werden und erfordert den Einsatz der richtigen Schutzausrüstung.
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Representative Results
Hier zeigen wir die Ergebnisse aus der Anwendung der standard-Protokoll für die β-Galaktosidase histochemische Reaktion mit X-gal als das Substrat im ganzen mausembryonen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Mithilfe dieses Protokolls untersuchen wir Membran Typ 4-Matrix-Metalloproteinase (Mt4-Mmp) Ausdruck in unterschiedlichen embryonalen Entwicklungsstadien (E9.5, E11.5 und E12.5) mit Mt4-Mmp mutierte Mäuse, die die LacZ-Reporter unter der Kontrolle der endogenen Ausdrücken Mt4-Mmp Promotor (Abbildung 3, Abbildung 4und Abbildung 5)9,15. Mt4-Mmp ist eine Endopeptidase, die an der Zellmembran durch einen Glycophosphatidyl-Inositol-Anker (GPI) angebunden ist. Mt4-Mmp in mehreren menschlichen Krebserkrankungen erkannt wurde, und wurde um das Fortschreiten des Tumorwachstums im Zusammenhang mit, zwar Informationen über seine proteolytische Aktivität gegen extrazelluläre Matrix Komponenten bisher sehr begrenzt. Darüber hinaus wurde fast nichts über die Rolle und Ausdruck der Mt4-Mmp während der Embryonalentwicklung9,16berichtet.
Wildtyp (WT), Mt4-MmpLacZ / + heterozygot (HT) und Knockout (KO) stellt Embryonen werden parallel für das X-gal-Färbung-Protokoll (Abbildung 2) verarbeitet. Mehrere Steuerelemente müssen bei der Färbung, die Besonderheit des Verfahrens zu validieren enthalten sein. So WT Embryonen werden als negative Kontrollen für die histochemische Reaktion verwendet und dienen zur Überwachung von unspezifischen X-gal Kennzeichnung (siehe Abb. 3A-D und Abbildung 4A-C). Zur Vermeidung von unspezifischen Hintergrund ist auch der pH-Wert des X-Gal-Färbelösung zwischen 8 und 9 über die gesamte Färbung einzuhalten. In Abbildung 3Esind β-gal-positiven Zellen im ganzen Berg HT Embryonen in den Somiten und das intersomitic Gefäßsystem Stadium der E9.5 visualisiert. Um die genaue Lage der gefärbten Zellen zu melden, Embryo-Schnitt ist jedoch erforderlich, unter dem Mikroskop zu visualisieren berichtet Genexpression in Gewebeschnitten mit zellulären Auflösung. In diesem Fall sind LacZ-positiven Zellen in den Somiten, der dorsalen Aorta, das intersomitic Gefäßsystem sowie die perineuralen vaskulären Plexus in Gewebeschnitten (Pfeile in Abbildung 3F-H) gefunden. Diese Ergebnisse korrelieren mit dem Ausdrucksmuster für Mt4-Mmp in diese Maus embryonalen Phase9darauf hinweist, dass diese Technik leicht reproduzierbare und zuverlässige gemeldet. Wie erwartet, sind β-gal Tätigkeit höher in die KO-Embryonen im Vergleich zu den HT aufgrund des Vorhandenseins von zwei Kopien des LacZ-Reporter-Gens (Abbildung 3I-L). Jedoch nur HT LacZ / + Embryonen sollte analysiert werden, in Studien der Gen-Expression-Muster und KO-Gewebe wird als ein Proof of Concept verwendet, um die Machbarkeit der Methode seit aufgrund des Fehlens des gezielten Gens von Interesse zeigen, β-gal-positiven Zellen können ungewöhnlich in der letzteren gelegen.
Bei der Durchführung dieses Protokolls ältere Embryonen (von E10.5 bis E12.5) sind nicht durchscheinend, und daher sind die sichtbarste X-gal gebeizt Regionen nah an der Oberfläche. So ist ein alternative Schritt dieser Methode Embryonen durch Waschungen in Lösungen mit steigenden Konzentrationen von Glycerin zu löschen. In Abbildung 4die E12.5 LacZ-gefärbten Embryonen zeigte sich unter Beibehaltung der X-gal-Färbung, ermöglicht es uns, tiefer fotografieren Regionen des Embryos im Stereomikroskop gebeizt. Wie bereits berichtet in diesem embryonalen Stadium wurde die Kennzeichnung in verschiedene Regionen des Gehirns, die Glieder, die Follikel Vibrissa und die Spitze der Rute9lokalisiert. Allerdings will man eine zelluläre Auflösung zu erhalten, sollten Embryonen in Paraffin eingebettet, geschnitten und mikroskopisch untersucht.
In Abbildung 5wurde Immunohistochemistry mit Anti-β-gal-Antikörper verwendet, um zu bestätigen, dass die Expression von Mt4-Mmp mittels Reporter LacZ Färbung beobachtet. So wurden β-gal-positiven Zellen erkannt in den Pool der motoneurone des Rückenmarks bei E11.5 Maus mithilfe beider Ansätze, die die Besonderheit des Protokolls hier berichtet (Abbildung 5A, B) bestätigt.
Abbildung 1 . Schematische Darstellung der E. Coli LacZ Reporter gen Kodierung für die β-Galaktosidase und histochemische Reaktion, die durch dieses Enzym katalysiert. In der traditionellen Färbung hydrolysiert die β-Galaktosidase das Substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal), 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Anschließend wird dieses Zwischenprodukt oxidiert, wodurch Dimerisierung und Bildung des Endproduktes blau gefärbten (5, 5'-Dibromo-4, 4'-Dichlor-Indigo). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Das Diagramm zeigt die wichtigsten Schritte des standard-Protokolls für den Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase. Mausembryonen erhoben und verarbeitet für ganze Berg X-gal-Färbung. Nachdem die histochemische Färbung nach dem Protokoll durchgeführt, können ganze Berg Embryonen werden (Option 1) mit Waschungen in Lösungen mit steigenden Konzentrationen des Glycerins gelöscht und anschließend in ein Stereomikroskop fotografiert, oder (Option 2) eingebettet in Paraffin, geschnitten und counterstained. Abkürzungen: RT, Raumtemperatur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . X-gal-Färbung des E9.5 WT und Mt4-MmpLacZ / + ganze-Mount Embryonen und Gewebeschnitte. Mithilfe der standard X-gal histochemische Assays wurden transgene Embryonen tragen das LacZ-gen unter der Kontrolle von Mt4-Mmp Promoter für β-gal Aktivität analysiert. WT (A), HT (E) und KO (ich) E9.5 ganze Berg Embryonen wurden für den Nachweis des β-Galaktosidase Ausdrucks verarbeitet. Paraffin-Abschnitte gewonnenen Embryonen auf der Ebene des Rückenmarks ermöglichen Visualisierung der Färbung mit zellulären Auflösung. Wie erwartet, β-gal-positiven Zellen fehlten in WT-Abschnitten (B-D), während die Intensität der Etikettierung in der KO (J-L) im Vergleich zu den HT Gewebeschnitte (F-H) höher war. Querschnitte durch das Neuralrohr offenbaren β-gal-Aktivität in den Entwicklungsländern Somiten, dorsalen Aorta und der perineuralen vaskulären Plexus. Abkürzungen: da, dorsalen Aorta; FLB, Vorderbein Knospe; h, Herz; m, mittelhirnes; NT, Chorda; OTV, Ohrenoperationen Vesikel; OV, Optik Vesikel; PNVP, Perineural vaskulären Plexus; s, Somiten; t, Telencephalon. Skalieren Sie Bars: 500 μm (A, E, ich); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); 20 μm (D, H, L). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Mikrofotos von WT und HT X-gal gebeizt mausembryonen am E12.5 vor (A, D) und nach (B, C, E, F) clearing mit Waschungen in erhöhte Glycerin. Wie erwartet, WT Embryonen zeigen kein Reporter LacZ Ausdruck (A-C) während Kennzeichnung erkannt wurde in den Gliedmaßen (weiße Pfeilspitzen), das Primordium der Follikel Vibrissa (weißer Pfeil), die Schwanzspitze (schwarzer Pfeil) und Gehirn des Mt4-MmpLacZ / + Embryonen in dieser Stufe (D-F)9. (E, F) Nach der Reinigung in Glycerin, Embryonen wurde transluzent und Kennzeichnung kann leichter in tiefere Regionen des Embryos, visualisiert werden, wie in der mittelhirnes und Telencephalon (weisse Pfeile in F) gezeigt. Maßstab: 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Histochemische und immunhistochemische Nachweis von β-Galaktosidase. (A) X-gal-Färbung (in blau) zeigt den Ausdruck der Mt4-Mmp in den Pool der motoneurone in einem Paraffin-Abschnitt des Rückenmarks im embryonalen Stadium E11.5. (B) Immunhistochemie mit Anti-β-gal-Antikörpern (in rot) bestätigt die Expression von Mt4-Mmp in der motoneurone des Rückenmarks im gleichen embryonalen Stadium in Kryostaten Abschnitten. Abkürzungen: fp, Bodenplatte; MN, motoneurone; Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1. Rezepte und Lösungen für dieses Protokoll erforderlich. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Das E. Coli LacZ gen hat als Reporter im Studium der Gen-Expression-Muster aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und einfache Erkennung verbreitet. Dieses Protokoll beschreibt eine klassische Methode zur Erkennung von β-gal Ausdruck basiert auf einer enzymatischen Reaktion, das einfach und schnell sowie kostengünstig durchführen. Diese Methode kann auch ohne große Änderungen im ganzen Berg Embryonen, intakt Organe, Kryostat Gewebeschnitte oder kultivierten Zellen angewendet werden.
Genaue Anwendung dieser Methode ergibt sich eine robuste und interpretierbare Färbung. Gleichzeitige Prüfungen und bestätigende Folgeschritte sind jedoch dringend empfohlen. In diesem Zusammenhang dieses Protokolls erfolgt parallel in Wildtyp stellt Embryonen als Negativkontrollen, die dazu dienen, unspezifische X-gal-Färbung zu überwachen. Darüber hinaus Ausdruck Daten erhalten, wenn mit β-gal-Färbung von Western-Blot und quantitative-PCR (Q-PCR) bestätigt wird Analyse oder durch β-gal Immunohistochemistry (Abbildung 5), die mit anderen Antikörpern kombiniert auch ermöglicht die Identifizierung von spezifischen Zelltypen LacZ9zum Ausdruck zu bringen. Fixierung-Schritte müssen in Betracht gezogen werden, um die enzymatische Aktivität der β-Galaktosidase zu bewahren und Hintergrund während der Färbung zu minimieren. So müssen Embryonen in Glutaraldehyd, verleiht die konsistente und zuverlässige Ergebnisse im Vergleich zu Paraformaldehyd Fixierung17behoben werden. Außerdem Fixierzeit ist entscheidend und sollte für jede embryonalen Phase empirisch ermittelt werden, da übermäßige Fixierung β-Galaktosidase Aktivität reduzieren kann. In diesem Zusammenhang können ganze Berg Embryonen durch Eintauchen oder Perfusion je nach embryonalen Stadium und. behoben werden Transcardial Perfusion ist daher empfohlen, für Embryonen älter als E14.5 und postnatale Exemplare um sicherzustellen, dass das Fixiermittel alle Regionen der Probe erreicht. Kleinere Embryonen (von E8.5 bis E12.5) festgesetzten eintauchen und direkt für Versicherungsjahren X-gal verarbeitet werden können (Abbildung 2) Färbung. Es sollte erwähnt werden, dass X-gal Färbung von mäuseembryonen jünger als E14.5 als die ganze Halterung durchgeführt werden können. In diesem Fall sind gefärbte Zellen dicht an der Oberfläche leicht mittels β-gal-Färbung nachgewiesen. Trotzdem kann es vorkommen, dass tiefere Beschriftung verschwommen erscheint oder sogar Farbstoff nicht das Gewebe, vor allem in älteren Embryonen dringt. In diesem Fall entweder Organe oder Gewebe Erwachsener Mäuse kann seziert, X-gal gebeizt und unter einem Stereomikroskop visualisiert. Strukturierendes und mikroskopische Untersuchung der gefärbten Gewebe von Interesse ist jedoch besser geeignet (Abbildung 2).
Trotz des Protokolls Effizienz kann Färbung, ganze Embryonen und Erkennung lästig sein. Zum Beispiel, die Niere, Hoden, sekretorischen Drüsen enthalten Nebenhoden und Magen-Darm-Trakt hohe Mengen an endogenen sauren β-Galaktosidase18 , die mit der Interpretation der Ergebnisse durch Hintergrundaktivität stören können. Aus diesem Grund sollte die histochemische Reaktion unter leicht alkalischen pH-Bedingungen (pH 8-9) in der Färbung, da β-Galaktosidase E. Coli einen optimale pH-Wert von 7,3 hat durchgeführt werden. Dies hilft, Hintergrund deutlich zu reduzieren und zu Gunsten der bakteriellen β-Galaktosidase Aktivität19,20,21,22. Anzumerken ist, dass lange Zeit Färbung Versauerung der X-gal Färbelösung, begünstigt einen erhöhte Hintergrund führen kann. Darüber hinaus die Aktivität der β-Galaktosidase unter Inkubation Temperaturen über 50 ° C, aber nicht unter 42 ° c verloren In unseren Händen Inkubation mit X-gal Substrat besser funktioniert als über Nacht bei 37 ° C. Nach der Färbung und vor dem Post-Fixierung Schritt ist es wichtig, alle X-gal Reaktion Material abwaschen so sorgfältig und so schnell wie möglich um Ausscheidungen aus der histochemische Reaktion zu beseitigen, die im Abschnitt Gewebe abgeschieden werden können.
Wie hier gezeigt, ist es wichtig für die Herstellung der Gewebe durchscheinend unter Beibehaltung der X-gal Färbung und Gewebe Histologie, clearing Embryonen in Glycerin. So die Embryonen werden klar und Kennzeichnung in tieferen Regionen unter dem Stereomikroskop visualisiert werden. Jedoch um die genaue Lage der gefärbten Zellen zu analysieren, der Probe-Schnitt ist erforderlich, und Clearing ist daher nicht notwendig. In diesem Fall können durch folgende Empfehlungen gemäß der Methode Proben werden sorgfältig paraffin eingebettete und geschnitten. Bei der Einbettung dehydriert Ethanol Gewebe muss in einer Mischung aus Isopropanol-Paraffin getaucht werden. Isopropanol wird zugunsten den Ersatz von Ethanol in der Probe und die Einbettung in Paraffin23Gewebe zu erleichtern verwendet. In einigen Protokollen ist Xylol statt Isopropanol für den gleichen Zweck verwendet. Dennoch stellt die Verwendung von Xylol Nachteile im Vergleich zu Isopropanol, wie z. B. die Schrumpfung und Verhärtung der Probe durch die Entfernung von Gewebe Lipide24 und das toxikologische Profil wie eine brennbare und reizend Produkt25. Orangen Öl basierenden Clearing Agenten sind eine der sichersten Alternativen, Xylol, da sie schnelles löschen ohne die Toxizität von Xylol sowie ausgezeichnete Gewebe Struktur Erhaltung26erlauben. Auch sollte wenn Xylol, dieser Teil des Protokolls auf Maximum, gesenkt, da X-gal-Färbung diffundieren kann und19verloren. Nach dem Schneiden, gegenfärbung mit Farbstoffen (z.B. nukleare schnell rot) wird empfohlen zur Erleichterung der histologischen Identifizierung Zellen zum Ausdruck zu bringen. Diese Färbeverfahren ist schnell, erfordert nur einen Schritt, und sein Rosa aussehen bietet guten Kontrast mit dem blau gefärbten X-gal Niederschlag. Diese gegenfärbung ist jedoch nur geeignet für den Einsatz bei nichtwässrigen Montage Medien (z. B. DPX).
Diese klassische Methode ist geeignet für den Nachweis von β-Galaktosidase Aktivität seit X-gal in Kombination mit Kalium Ferro - und ferricyanid erzeugt einen charakteristischen blauen Niederschlag, die nicht verblasst oder Bleichmittel leicht, wenn gut gebaut, kann man sogar unter dem sezierenden Mikroskop erkannt werden. Es gibt andere Modifikationen des ursprünglichen Protokolls. Mit Hilfe der vorhandenen Substrate wie Lachs-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) oder Bluo-gal (5-Bromo-3-Indolyl-β-D-Galactopyranoside)13,19 , oder ersetzen die klassische X-gal/FeCN für Tetrazoliumsalz Salze Empfindlichkeit der Erkennung13,19erheblich verbessern können. Dies empfiehlt sich vor allem um hohe Empfindlichkeit geringe Expression Ebenen der Protein- und mRNA-Material zu ermöglichen. Jedoch wenn zu lange verwendet, kann eine dieser Maßnahmen führen zu hohen Hintergrundwerten und so sorgfältige Verwaltung der Bedingungen wird immer empfohlen, besonders wenn man bedenkt, dass längere Inkubationszeit Perioden können erleichtern, unspezifische Färbung aufgrund endogene β-Galaktosidase Aktivität13,27. Über Letzteres ist es immer ratsam mit dreiwertigem Kaliumsalze um die Zuverlässigkeit der Technik zu optimieren und Fehler vermeiden.
Eine wichtige Einschränkung dieser Methode ist, dass die klassische X-gal-Färbeverfahren einen unlöslichen blauen Niederschlag produziert, die leicht erkannt werden, durch Lichtmikroskopie aber erlaubt nicht Co Lokalisierungs-Arbeiten von Leuchtstofflampen oder konfokalen Mikroskopie im Gewebe Abschnitte. Eine Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden wäre, Antikörper gegen β-gal verwenden (siehe Abbildung 5) kombiniert mit Immunodetection für einen bestimmten Zelltyp. Jedoch wenn der Ausdruck Niveaus niedrig sind oder hoch Hintergrund Immunolabeling es schwierig machen kann, zu erkennen ob die Reporter-gen in einer bestimmten Zelle drückt. Insbesondere wurde eine neue Technik berichtet, konfokale Bilder in hoher Qualität anhand der Fluoreszenzemission produziert von X-gal überstürzten28zu erhalten. Darüber hinaus ist diese Methode ist kompatibel mit Immunfluoreszenz und X-gal-positiven Zellen28eindeutig identifizieren kann. Enzymatische Reporter wie das LacZ gen bieten den Vorteil des Seins empfindlicher als fluoreszierende, der bemerkenswert beim beschriften, ist wenn Ausdruck besonders niedrig sind. In diesem Zusammenhang ist die gegenwärtige Technik ideal für die Erkennung von MicroRNA29, daher erlauben sowohl qualitative Bewertung der die Expressionsmuster und Quantifizierung der Ausdruck Niveaus nachgewiesen worden. Doppelte Färbung wird verwendet, um β-gal Aktivität und mRNA Präsenz über in Situ Hybridisierung-Techniken zu erkennen, die sehr nützliche Informationen um das Expressionsmuster von endogenen Genen zu untersuchen, während β-gal Überwachungstätigkeit in der gleichen Probe zur Verfügung stellen können 30. dennoch möglicherweise beide β-gal-Fleck und in Situ Hybridisierung Erkennung Reaktionen während der doppelten Färbung Farbe Inkompatibilität angezeigt. Ein passenderes Substrat, wie S-gal, die Wahl wird in speziell optimierten Methoden30empfohlen.
Dieses vielseitige Methode wurde ausgiebig zur Genfunktion im Rahmen der Entwicklungsbiologie zu untersuchen. So wurde das LacZ-gen für die Analyse von Gen Expressionsmuster während der Embryonalentwicklung angenommen durch klopfen sie in eine gezielte gen-Locus. LacZ ist eine gemeinsame Reporter-gen für das Studium GUS wirkenden regulatorische Elemente (Enhancer) beteiligt, Regie Genexpression in eingeschränkten Regionen des Embryos, die Informationen über die Transkription Aktivität der Förderer der Interesse31 ,32,33. Auch ist es häufig verwendet bei der Erkennung von genetischen Rekombination Veranstaltungen durch Cre-vermittelten Rekombination LoxP-Websites, die eignet sich besonders für den Nachweis von embryonalen Stammzellen Derivate in Zelle Schicksal Zuordnung Experimente oder Zelltransplantaten. Gen-Trap Mutagenese in embryonale Stammzellen produziert abgeschnittene Proteine verschmolzen zu β-gal, die Bewertung der promotoraktivität unter physiologischen Bedingungen34zulässt. Für all diese Ansätze Huhn Transgene Tiere LacZ tragen und mit dem Ausdruck bakterielle β-Galaktosidase in Ratte35,36, erzeugt wurden37,38, Xenopus39 oder Zebrafisch40. Bisher wurde diese Technik in Drosophila verwendet, um die Visualisierung der Genexpression räumlich und zeitlich verbessern wegen der Verwendbarkeit der induzierbaren gen Expressionssysteme und Gewebe und zellspezifische p-LacZ Markierungslinien41 ,10. Es ist erwähnenswert, dass abgesehen von diesen vielen Anwendungen mit transgenen und Knockout Tieren LacZ-Reporter-gen im gesamten Gewebe verwendet worden ist sowie kultivierten Zellen, die Rolle der Gene bei der Krankheit in der biomedizinischen Forschung vorherzusagen. Ein einschlägiges Beispiel für Letzteres ist die Studie des Alterungsprozesses zu Reaktionen auf Stress, Tumor Unterdrückung oder Entwicklung. Alternde Zellen sind leicht zu erkennen, in Situ und in-Vivo aufgrund ihrer charakteristischen Überexpression und Anhäufung von endogenen lysosomale Beta-Galaktosidase42,43. Β-Galaktosidase wird daher als ein alternde Biomarker in quantitativen Assays in Krebs kultiviert44Zellen verwendet.
Zusammenfassend lässt sich sagen beschreiben wir ein machbar und optimierte Verfahren um einfache Erkennung von β-Galactoside Aktivität in embryonalem Gewebe Maus zu erleichtern. Das vorliegende Verfahren erlaubt Modifikationen basierend auf das Gewebe ausgewählt und das Substrat verwendet. Diese vielseitige und kostengünstige Methode mit entsprechenden Kontrollen ist daher besonders geeignet für den Einsatz mit ganzen mausembryonen sowie auf histologischen Dünnschliffe.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierendes finanzielles Interesse haben.
Acknowledgments
Wir möchten die histopathologische Service für ihre technische Unterstützung an das Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) bedanken. Wir danken auch Dr. Motoharu Seiki freundlicherweise die Mt4-MmpLacZ -Mäuse und Dr. Alicia G. Arroyo für unser Projekt zu unterstützen und ihre kritische Lektüre des Manuskripts. Wir wünschen Peter Bonney für Korrekturlesen dieses Artikels danken. Diese Arbeit wurde von Universidad Europea de Madrid durch ein Stipendium (# 2017UEM01), C.S.C unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
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