Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Quantitative Analyse des Niveaus der Plasmamembran Verein für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierten Protein durchführen. Die Methode basiert auf die rechnerische Zersetzung der Membran und zytoplasmatischen Komponente des Signals beobachtet in Zellen mit Plasmamembran fluoreszierenden Marker gekennzeichnet.

Abstract

Diese Methode bietet einen schnellen Ansatz für die Ermittlung der Plasmamembran Partitionierung von jedem eindringmittel getaggt peripher-assoziierten Protein mit den Profilen der Fluoreszenzintensität über die Plasmamembran. Gemessenen Fluoreszenz Profile sind durch ein Modell für die Membran und Zytoplasma Fluoreszenz Verteilung entlang einer Linie, die senkrecht auf der Peripherie der Zelle angewendet ausgestattet. Dieses Modell ist aus der Fluoreszenz Intensitätswerte in Referenzzellen auszudrücken eindringmittel getaggt Marker für Zytoplasma und mit FM 4-64-mit der Bezeichnung Plasmamembran gebaut. Die Methode kann auf verschiedene Arten von Zellen und Organismen angewendet werden; Allerdings können nur die Plasmamembranen von nicht benachbarten Zellen ausgewertet werden. Diese schnelle Mikroskopie-basierte Methode eignet sich für Experimente, wo dynamische Veränderungen der Plasmamembran-assoziierten Marker erwartet werden und müssen quantifiziert werden, z.B.bei der Analyse der mutierten Versionen von Proteinen, Inhibitor Behandlungen, und signal-Transduktion Beobachtungen. Die Methode ist eine Multi-Plattform-R-Paket implementiert, die mit einem Makro ImageJ gekoppelt ist, die als eine benutzerfreundliche Oberfläche dient.

Introduction

Peripher-assoziierten Plasmamembran Proteine sind die wichtigsten Komponenten der Zelle Signalwege. Eines ihrer grundlegenden Aufgaben ist ihre transiente Plasmamembran Assoziation und Dissoziation, die wichtig für die Signalübertragung zwischen Plasmamembran und Zytoplasma ist. Plasmamembran peripher-assoziierte Proteine auf Plasmamembran durch Lipid-Anker (N-myristylierung, S-Acylation oder Prenylation) oder durch Lipid-Bindung-Domänen (Interaktion mit Phosphatidylinositol Phosphate, phosphatidic Säure, anbaubar usw.).

Plasmamembran bindenden Eigenschaften dieser Proteine können sein untersucht in Vivo, z. B.wenn ein eindringmittel getaggt Protein durch eine Site-verwiesene Mutagenese der wichtigen Aminosäuren geändert wird, oder wenn es mit verschiedenen Inhibitoren beeinflussen behandelt wird Lipid signaling. Die Verteilungen der peripheren Membranproteine, Plasma werden meist qualitativ, besonders in Fällen geprüft wenn re PROTEINVERTEILUNG offensichtlich ist. Die vorgestellte Methode ist optimal für Situationen, wenn Protein Umverteilung nur teilweise ist und quantitative Bewertung notwendig ist. Ein häufig verwendeter Ansatz Wenn Plasmamembran Vereinigung von konfokalen geschätzt wird laser scanning Mikroskopie-Bildern, wie ein Verhältnis von Fluoreszenz-Intensität an der Plasmamembran und in das Zytoplasma^1,2, ist aber nicht einfach, präzise. Fluoreszenz-Intensität in der Plasmamembran reflektieren eine Überlagerung der Plasmamembran und Zytoplasma Signal aufgrund der Lichtbeugung Merkmal für die besondere Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik und optischen Elementen verwendet³. Infolgedessen ist der zytoplasmatischen Signal auch in der Membran-Region enthalten. Aus diesem Grund kann nicht FM 4-64 Färbung Muster für eine Membran Signal Auswahl⁴als Maske verwendet werden. Darüber hinaus einfache Messungen von Membran-Signal an der Position von FM 4-64 Färbung immer systematisch maximale definiert das echte Plasmamembran Signal des peripher-assoziierten Plasmamembran Protein durch die Überlagerung der überschätzen die Membran und zytoplasmatischen Compound. Das Maximum der beobachteten Signale für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierte Proteine auch nicht zusammen mit dem Maximum der Plasmamembran Marker (d.h. FM 4-64 Styryl Farbstoff) lokalisiert, aber ist das Zytoplasma verlagert. Eine weitere Einschränkung ist, dass der FM 4-64 Emission Höhepunkt im Vergleich zu den Emission Gipfeln für grüne fluoreszierende Proteine wie GFP aufgrund der Wellenlänge-Abhängigkeit von Lichtbeugung³breiter ist.

In die hier beschriebene Methode ist das tagged Protein-Signal durch zwei empirische Funktionen beschreiben einer hypothetischen Verteilung der Plasmamembran und Zytoplasma Signal bzw. ausgestattet. Dieses Signal Zersetzung ist auf lineare Fluoreszenz Profile angewendet, die an der Zelloberfläche senkrecht zur Plasmamembran in Quellbilder, gelten die regulären, Zweikanal-konfokale Abschnitte fluoreszent-markierte Protein zum Ausdruck zu bringen sind Zellen mit FM 4-64 Farbstoff gekennzeichnet.

Die erste Funktion, die für die Montage verwendet beschreibt eine Beugung eines Zytoplasma-Signals auf dem Zellenrand. Es wird von zuvor erworbenen Fluoreszenz Profile erhalten, die in den Zellen, die mit dem Ausdruck eines Zytoplasma Protein Markers markiert durch die gleichen Chromophor als Plasmamembran peripher-assoziierten Protein des Interesses gemessen wurden. Die zweite Funktion beschreibt eine Beugung der Plasmamembran Signal ist die Fluoreszenz von FM 4-64 abgeleitet. Dieses Signal wird zunächst von einer Gaußschen Funktion angenähert, der für eine ungefähre Modellierung von Lichtbeugung eine Punktquelle verwendet wird. Zweitens ist dieses Modell, gültig für rote FM 4-64 Emission mathematisch in der Form umgewandelt, die relevant für einer Emissionswellenlänge von den Chromophor verwendet für die Kennzeichnung von peripher-assoziierte Proteine auf der Plasmamembran von Interesse sind. Beide Funktionen werden durch die maximale Intensität und der Mittelwert von 10 % der höchsten Werte für FM 4-64 und zytoplasmatischen Proteinen Signal bzw. normalisiert. Durch dieses Signal Zersetzung (nicht-lineare mindestens quadratisch Anpassungsmethode) können das Verhältnis der Plasmamembran und Zytoplasma Bruchteil des untersuchten Proteins leicht und genau geschätzt werden. Die realen physische Dimension des berechneten Partitionierungs-Koeffizienten ist im Bereich von Mikrometer, weil zytoplasmatischen Volumenkonzentration mit oberflächenkonzentration auf der Plasmamembran verglichen wird. Es definiert den Abstand zwischen der Plasmamembran Cytoplasma, innerhalb derer die gleiche Menge an Proteinen im angrenzenden Bereich der Plasmamembran lokalisiert ist. Dieser Wert entspricht der Partitionierung Koeffizient K₂ eingeführt, zuvor⁵. Die Methode ist sehr schnell, erfordert nur einzelne konfokale Abschnitte aufgenommen mit Routine konfokale Laser-scanning-Mikroskop, und es ist rechnerisch nicht anspruchsvoll. Der Kern der Analyse in einen tragbaren R-Paket implementiert wurde und eine zusätzliche ImageJ-Makro wurde geschrieben, um grafische Benutzeroberfläche zum Starten der Analysis über die intuitive Dialoge. Software und ausführliche Beschreibung der Methode (früher veröffentlichten⁶) finden Sie unter http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Die Methode eignet sich für isolierte Zellen, Protoplasten und Geweben, wo die Plasmamembran der einzelnen Zellen deutlich unterscheidbar ist, mit dem Ausdruck ein eindringmittel getaggt Konstrukt der peripher-assoziierten Protein untersucht. Ein Chromophor kompatibel mit FM 4-64 Färbung verwendet werden muss. FM 4-64 gibt rote Fluoreszenz; Daher kann untersuchten Proteins durch ein Fluoreszenz-Protein mit blauen, grünen oder gelben Emission (z. B.GFP, GFP, YFP) markiert werden. Stabile Transformation von biologischem Material wird empfohlen, weil dadurch weniger künstliche und mehr reproduzierbare Beobachtungen der PROTEINVERTEILUNG. Es ist notwendig, dass die untersuchten Proteine eine relativ homogene zytoplasmatischen Verteilung hat. Die Lokalisation eines Proteins in das endoplasmatische Retikulum oder ein weiteres Fach der intrazellulären Membran kann künstliche Ergebnissen führen.

Darüber hinaus muss das gleiche biologische Material mit dem Ausdruck eines zytoplasmatischen Markers für den Vergleich verwendet werden. Zellen können durch eine kostenlose Chomophore (das gleiche wie für periphere Protein tagging, z. B.kostenlose GLP) oder tagged Proteins des Interesses mit abgeschafft Membran-Bindungskapazität umgewandelt werden. Membran-Bindungskapazität kann, z. B. durch Trimmen der Membran-bindende Domäne oder Site-verwiesene Mutagenese der wichtigen Aminosäure Essigreiniger (z.B. Websites für N-myristylierung, S-Acylation, oder Prenylation, etc.) abgeschafft werden.

Für die konfokale scanning-Mikroskopie müssen Zellen durch eine Membran-Marker wie FM 4-64 Farbstoff gekennzeichnet sein. Wenn FM 4-64 Färbung nicht für das untersuchte Material (wegen störenden Autofluoreszenz, schlechte Farbstoff eindringen, etc.) geeignet ist, können die Plasmamembran, z. B. durch integrale Plasmamembran Protein markiert, eine entsprechende Chomophore (beschriftet werden mCherry, RFP, etc.). Es ist wichtig, dass die Markierung vernachlässigbar Lokalisierung in die intrazellulären Membran Fächer (Endomembranes) hat.

Arbeiten mit festen Proben und Antikörper kann fixierbar analogen FM 4-64FX oder Plasmamembran Kennzeichnung durch Antikörper gegen ein geeignetes Ziel verwendet werden. In diesem Fall ist es wichtig, die Ergebnisse sehr sorgfältig ausgewertet werden, da Fixierung Verfahren zum selektiven Verlust von Proteinen aus dem Zytoplasma und der Plasmamembran führen können.

Protocol

1. Vorbereitung von biologischem Material

1. Bereiten Sie biologisches Material, mit dem Ausdruck des eindringmittel tagged Proteins von Interesse sowie eine cytoplasmatische Markierung vor. Folgen Sie den Anweisungen in der Einleitung erwähnt.

(2) konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

1. Das Material vorbereitet in Abschnitt 1 mit FM 4-64 Farbstoff⁷Fleck.
   1. Wenden Sie eine Färbung Protokoll, die für das untersuchte Material geeignet ist. Färben Sie für BY-2 tabakzellen 200 μl Zellsuspension mit 0,2 μl 10 mm FM 4-64 Lösung in Dimethylsulfoxide.
      Hinweis: Die typische Färbung Konzentration von FM 4-64 Farbstoff geht 10 μM mit 10 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxide. Verwenden Sie die niedrigste Konzentration von FM 4-64 für richtige Färbung und inkubieren Sie Zellen auf Eis (FM 4-64 und niedrige Temperatur können Plasmamembran Eigenschaften beeinflussen) nicht. Fahren Sie mit Beobachtung konfokalen Mikroskopie sofort verwenden. Das Intervall zwischen der Färbung und die Bildaufnahme sollte nicht länger als 10 Minuten sein; Andernfalls wirkt Endozytose des Farbstoffs der FM 4-64 Färbung.
   2. Verarbeiten Sie mehrere Proben nacheinander zu, und keine Flecken Sie, die Proben zu Beginn des Experiments.
2. Erfassen eines Konfokalen Querdurchmesser pro Zelle.
   1. Legen Sie eine sequenzielle Zweikanal-Scannen für den Chromophor als Protein-Tag (der erste Kanal muss) und FM 4-64 (der zweite Kanal muss) verwendet. Legen Sie eine höhere optische Auflösung (10 – 20 px/μm). Ein Beispiel-Setup: 63 X Öl Immersion Ziel, NA 1.3, Bildgröße 1.024 x 1.024 px. Sicherstellen Sie, dass die Plasmamembran Ebene senkrecht auf die konfokale Schnittebene in der aufgenommenen Bilder.
   2. Mindestens 20 Zellen pro Probe müssen genügend Daten für die statistische Auswertung zu erfassen (abhängig von der Signal-Variabilität in verarbeiteten Materials).

3. erforderliche Softwareinstallation

1. Installieren Sie Fidschi ImageJ Verteilung⁸und das gewünschte Makro peripheren.
   1. Herunterladen Sie Software von der Website https://fiji.sc/#download und installieren Sie sie nach dem Auspacken.
   2. Starten Sie Fidschi durch Doppelklick auf die Datei "ImageJ(.exe)" in das entpackte Verzeichnis "Fiji.app".
   3. Ein Makro "peripheren" von der folgenden Website herunterladen:
      http://kfrserver.Natur.cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.IJM.
   4. Wählen Sie in Fidschi, Plugins | Makros | Installieren... im Haupt-Menü und geben Sie den Pfad auf die heruntergeladene Datei "Peripheral_.ijm."
      Hinweis: Zwei neue Tools des installierten Makros "peripheren" erscheint in der Symbolleiste Fidschi: "Nehmen Sie Profil Tool" und "Peripheren Protein-Menü".
2. Installieren Sie die R-Projekt Software⁹und benötigten Pakete.
   1. Folgen Sie den Anweisungen auf der Website https://cloud.r-project.org/ für R-Projekt Installation.
      Hinweis: Die gesamte Analyse wird in Fidschi durchgeführt werden. Die R-Software wird nur intern aufgerufen werden durch das Fidschi-Makro "peripheren" während der Berechnung.
   2. R-GUI ausführen, wählen Sie -Pakete | Installieren Sie Pakete... im Hauptmenü und geben Sie den nächsten Repository und Paket "ggplot2" für die Installation.
      Hinweis: Alternativ zum R Befehlszeilen eingeben: install.packages("ggplot2").
   3. Das Ziel eine periphere R-Paket herunter: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Durch die Auswahl Pakete zu installieren | Installieren Sie Pakete aus lokalen Dateien....
      Hinweis: Alternativ geben Sie auf der Befehlszeile R diesen Befehl nur:
      install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", Repo = NULL, Typ = "Quelle").

(4) Bildanalyse in Fidschi

1. Die konfokale Bilder der zytoplasmatischen Marker zu verarbeiten.
   1. Importieren Sie die Bilder nach Fidschi mit Plugins | Bio-Formate | Bio-Formate Importeur Fidschi im Menü mit den Standardeinstellungen.
   2. Überprüfen Sie, ob der Bio-Formate-Importeur die Bild-Kalibrierung richtig erkannt. Die Bild-Dimension im oberen linken Feld Bild Informationsfenster angezeigt muss die Originalmaße Bild entsprechen.
   3. Nicht ordnungsgemäß kalibriert behandeln Bilder mit den falschen Abmessungen individuell, z. B.durch die Einstellung der richtigen Parameter im Dialogfenster analysieren | Legen Sie Maßstab... Fidschi im Menü: füllen Sie die Breite des Bildes in Pixel in das Feld " Abstand in Pixel " und die wirkliche Breite in der entsprechenden Längeneinheit im Feld Abstand bekannt ).
      Hinweis: Wenn die Leica LCS LEI-Dateien nicht ordnungsgemäß kalibriert sind, folgen Sie Schritt 4.2.1.
2. Führen Sie das Import-Optionen Makro für eine Analyse-Set-up. Das Makro aktivieren, indem Sie eine der drei Möglichkeiten: Wählen Sie Plugins | Makros | Import-Optionen [f1] in Fidschi-Hauptmenü, wählen Sie das gleiche Element nach Klicken auf das Menü Werkzeug Peripheren Protein Menüoder drücken Sie die Tastatur-Abkürzung F1. Legen Sie den Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.
   1. Lösen Sie bei der Leica LCS LEI Format unsachgemäße Kalibrierung durch Leica.lei Bilder Kontrollkästchen aktivieren. Diese Option importiert ordnungsgemäß die Bildabmessungen aus der Datei mit der Endung "Lei".
   2. Definieren Sie den entsprechenden Wert im Feld Gaussian blur Radius (px). Dies beeinflusst Bild glätten und Lärm-Reduzierung. Ein niedriger Wert (1 px) ist ausreichend und verursacht keine Verluste Bild Informationen.
   3. Legen Sie einen Wert im Feld Profil Linienbreite (px). Eine dickere Linie verursacht höhere Glättung der Profilkurven. Ein Standardwert 10 wird px empfohlen.
   4. Legen Sie einen Bildtitel Analyse durch die Definition von "Probe Trennzeichen" und "Exportierte Elemente."
      Hinweis: Ein Bildtitel (Dateinamen ohne Erweiterung, z. B.: "Experiment-1_line-02_cell-11") wird um die Charaktere, die im Feld "Sample Trennzeichen" aufgeführt aufgeteilt werden (z.B.: "-_") in einer Reihe von Elementen ("Experiment", "1"," "Linie", "02", "Zelle" und "11") als Gruppierung Faktoren (Probe, Zelle, Zeile oder Behandlung Identität) in der folgenden Analyse verwendet werden können. Definieren Sie, welche Elemente verwendet werden, durch Eingabe ihrer Sequenznummer ("0" für das erste Element) in den eingereichten "Exportiert Elemente." Verwenden Sie Leerzeichen getrennte Format, z. B."3 5." In diesem Beispiel werden "02" und "11" bezeichnet als Gruppierung Faktoren namens "Fac_0" und "Fac_1." Darüber hinaus wird die Identität der einzelnen Messungen werden als bezeichnet "Ich" Faktor.
   5. Alternativ halten Sie die Probe Trennzeichen leer und geben Sie 0 in die exportierte Elemente , wenn die Vollbild-Titel beibehalten werden kann.
   6. Überprüfen Sie auf dem Windows-Betriebssystem, ob der Pfad zu den R-Software korrekt erkannt im Feld Pfad zum R.exewerden. Andernfalls geben Sie den vollständigen Pfad zu der Datei R.exe in das System (z.B."C:\Program Files\R\bin\R.exe").
   7. Klicken Sie auf "OK". Überprüfen Sie den Titel im nächsten Dialogfenster analysieren und klicken Sie auf "OK" oder wieder zurücksetzen.
      Hinweis: Alle Bilder werden automatisch geglättet und schließlich neu kalibriert werden. Eine Liste der alle exportierten Gruppierung Faktoren wird im Ergebnisfenster angezeigt.
3. Führen Sie eine lineare Auswahl über die Plasmamembran-Region in die bearbeiteten Bilder und Messen Sie die Fluoreszenz-Profile zu.
   1. Wählen Sie das Fidschi-Werkzeug gerade Linie von der Fidschi-Symbolleiste. Klicken Sie auf das Bild und ziehen Sie eine Linie in der Plasmamembran-Region. Die Zeile sollte muss in den Extrazellulärraum beginnen und senkrecht auf der Plasmamembran. Wählen Sie Regionen mit einer dickeren und homogenere Schicht der kortikalen Zytoplasma. Die optimale Länge der linearen Auswahl ist 5-10 μm.
   2. Laufen Sie die Profil-Makro zu nehmen , indem analoge Methode wie im Schritt 4.2 (Kürzel "X") oder in der Fidschi-Symbolleiste auf Profil Tool nehmen . Die automatische Messung der Fluoreszenz-Profile in beiden Kanälen erfolgt und die Daten werden im Ergebnisfenster angezeigt.
   3. Wenn mit der Taste "X" benutzerunfreundlich gilt, die Makro-Quelldatei Peripheral_.ijm im Text-Editor zu öffnen, ersetzen Sie das "X"-Symbol in der Zeile "Makro"Take Profil [X]"{" mit einem günstigeren Symbol (, wird nicht verwendet, in der Umgebung der Fidschi-Inseln als eine aktive Tastatur-Abkürzung) und speichern Sie die Datei. Installieren Sie das Makro (Schritt 3.1.4) und starten Sie die Analyse aus dem Bildimport.
   4. Nehmen Sie nach einzelsignal Variabilität repräsentative Zahlen der Profile für jede Zelle.
   5. Sichern Sie die Daten per Datei | Ziel speichern unter.... Verwenden Sie immer die Erweiterung "Csv"; Es ist notwendig für die richtige Datenformat.
4. Führen Sie die Plot-Profil-Daten-Makro (Abkürzung F5) für die grafische Visualisierung der gemessenen Profile. Legen Sie den Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.
   1. Halten Sie das Kontrollkästchen Gebrauch Filtern nach Eingabedaten? abgewählt.
   2. Geben Sie an, ob die Handlung von aktuellen Daten im Ergebnisfenster, aus einem einzigen CSV-Datei oder aus CSV-Dateien in einem angegebenen Verzeichnis durch Klicken auf das entsprechende Optionsfeld erstellt werden soll.
      Hinweis: Wenn der Plot aus den jüngsten Ergebnissen erstellt, Daten werden zuerst gespeichert werden (Dialogfeld "Speichern unter... " wird automatisch aktiviert).
   3. Geben Sie an welche Gruppierung Faktoren für das Plotten durch Aktivieren der entsprechenden Kontrollkästchen verwendet werden. Wählen Sie den Faktor "i.", wenn alle Profile in einzigartige Grundstücke angezeigt werden soll. Halten Sie die Kontrollkästchen nicht ausgewählt ist, sollten alle Daten von auf einem einzigen Grundstück dargestellt.
      Achtung: Auswählen eines Faktors Gruppierung, die nicht in den verarbeiteten Ergebnisse Ursachen Fehler während der Ploterstellung vorhanden ist.
   4. Geben Sie den Dateinamen beim Speichern von einem Grundstück im Feld Output-Datei-Präfix und definieren Sie die Handlung Bildabmessungen in Grundstück hohe und Breite Plot-Dateien.
      Hinweis: Die daraus resultierende Handlung wird in einem Quell-Daten-Verzeichnis als eine PNG-Datei gespeichert werden.
   5. Wählen Sie die PDF-Ausgabe? Kontrollkästchen, wenn eine zusätzliche PDF-Ausgabe kann produziert werden.
   6. Klicken Sie auf "OK". Geben Sie den Pfad zum Speichern der Ergebnisse oder schließlich für Daten importieren Sie im nächsten Dialogfenster. Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" in den Dialogfenstern zeigen die durchgeführten R-Code.
      Hinweis: Die Handlung wird in einem neuen Bildfenster geöffnet werden und die R Analyseausgabe werden in Text-Fenster aufgelistet.
5. Laufen Sie die Profil Filterung Setup Makro (Abkürzung F2) haben einige gezeichneten profile übermäßige Signale im extrazellulären Raum (für das tagged Protein) oder in den intrazellulären Raum (für das FM 4-64-Signal). Folgen Sie durch die Einstellung der Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.
   Hinweis: Filter ermöglicht die Entfernung von schlechten Profile nach der maximal zulässigen Intensität Schwelle an angegebenen X-Koordinaten.
   1. Für jeden Kanal inmitten der entsprechenden Intensität Schwellenwerts die Datei Messungen mit einem übermäßigen extrazelluläre (intrazellulären) Signal zu entfernen. Geben Sie der Region, wo die Intensität Schwelle angewendet wird, in das Feld an X-Koordinaten zu senken (größer).
   2. Führen Sie die Plot-Makro der Profil-Daten (Schritt 4.4) erneut mit dem Kontrollkästchen Gebrauch Filtern nach Eingabedaten? ausgewählt; sicherstellen Sie, dass alle aberranten Profile erfolgreich entfernt wurden. Ansonsten, verbessern Sie die Filterparameter (Schritt 4.5.1).
6. Führen Sie das Makro erstellen Modell (Abkürzung F3) erstellen ein Modell der Plasmamembran und die Zytoplasma-Fluoreszenz-Verteilung anhand der Kalibrierdaten. Folgen Sie durch die Einstellung der Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.
   1. Angeben, wenn die Eingabedaten gefilterten (Schritt 4.5) durch die Wahl sein sollte die Nutzung Filtern nach Eingabedaten? Kontrollkästchen.
   2. Geben Sie die Quelldaten analogisch wie in Schritt 4.4.2.
   3. Geben Sie ein Intervall an dem das Modell wird vorhergesagt werden, per Definition von "Start", "beenden" und "Schritt" Werte in μm.
      Hinweis: Alle Profilmessungen sollte länger als das angegebene Intervall.
   4. Geben Sie die Wellenlängen der Fluoreszenz Anregung und Emission Maxima von der Chromophore in die entsprechenden Felder verwendet. Stellen Sie den Standardeinstellungen für GLP und FM 4-64-Kombination.
      Hinweis: "GLP" kennzeichnet den Chromophor verwendet für das Protein tagging (GFP, GFP, YFP, etc.) und "FM4" der Chromophor für eine Plasmamembran Färbung (in der Regel FM 4-64) verwendet.
   5. Geben Sie die Ausgabe-Datei-Präfix -Feld. Das Präfix wird für eine resultierende Modell wie die RData Datei ein Quellverzeichnis Daten speichern verwendet werden.
   6. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Grundstück Modell? Wenn die grafische Ausgabe erforderlich ist. Die Handlung wird gespeichert als die PNG-Datei sowie die PDF-Datei Wenn der PDF-Ausgabe? Kontrollkästchen aktiviert ist.
   7. Klicken Sie auf "OK". Geben Sie den Eingang oder Ausgang Wege im nächsten Dialogfenster und die Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" im Dialogfenster zeigt die durchgeführten R-Code.
      Hinweis: Die Handlung von der modellierten zytoplasmatischen und Membran Verbindung der peripher-assoziierten Protein Fluoreszenz werden in das neue Bildfenster angezeigt, und die R Analyseausgabe werden im Text-Fenster aufgelistet.
7. Die Bilder der Zellen mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses zu verarbeiten.
   1. Importieren Sie die Bilder analog wie in Schritt 4.1.
   2. Richten Sie die Analyse analog wie in Schritt 4.2. Die Glättung und Linie Breite sollten identisch sein.
   3. Messen Sie die Profile analog wie in Schritt 4.3.
   4. Überprüfen Sie die Richtigkeit der Profile durch Plotten (Schritt 4.4) und legen Sie die Filterung (Schritt 4.5) auf Wunsch.
8. Führen Sie das berechnen Verteilung Makro (Abkürzung F4) für die Berechnung der ein Protein Partitionierung zwischen der Plasmamembran und im Zytoplasma. Folgen Sie der Parametereinstellung im Dialogfenster aufgerufene Makro.
   1. Analogisch mit dem vorherigen Schritt (Schritt 4.4), angeben der Datenquelle Filterung und Dateinamen Präfix.
   2. Geben Sie an, ob das Modell für Protein-Verteilung-Berechnung aus den letzten Modell-Berechnung in der letzten Instanz des "Peripheren" Makros auf Fidschi (select-Kontrollkästchen Aktuelle Ergebnisse) oder die RData (geladen wird Kontrollkästchen Sie aktivieren Sie das- "aus Datei").
   3. Halten Sie das Kontrollkästchen Ergebnisse mit größer als passives Variabilität entfernen aktiviert, wenn ein Ergebnis-Filterung gewünscht wird. Geben Sie den Schwellenwert der maximale zulässige residual Variabilität, die durch das Signal Zersetzung der einzelnen Profilmessung unerklärliche werden kann. Zum Beispiel: 0.200 der Wert gibt an, dass alle Messungen mit unerklärlichen Variabilität höher als 20 % der Gesamtvariabilität der Fluoreszenzintensität im Profil werden verworfen.
   4. Wählen Sie Probe Gruppierung Faktoren, die für Box-Plot erstellen (Schritt 4.4) verwendet werden dürfen.
   5. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen PDF-Ausgabe? für das Boxplot als PDF-Datei speichern.
   6. Klicken Sie auf "OK", geben Sie den Eingang oder Ausgang Wege und die Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" im Dialogfenster zeigt die durchgeführten R-Code.
      Hinweis: Boxplot der peripher-assoziierten Protein Aufteilung zwischen der Plasmamembran und Zytoplasma wird in einem neuen Bildfenster angezeigt werden, und die R Analyseausgabe werden in Text-Fenster aufgelistet.
   7. Für Fremdbearbeitung, speichern Sie die Ergebnisse im Fenster Ergebnisse über Datei angezeigt | Ziel speichern unter... in das Menü "Fenster".

Representative Results

DREPP¹⁰ ist ein anlagenspezifischen peripher-assoziierten Plasmamembran-Protein, das einhergeht mit der Plasmamembran über eine N-myristylierung und eine elektrostatische Wechselwirkung mit Phosphatidylinositol Phosphate^{11, 12}. DREPP wurde als Bestandteil des Kalzium-Signalisierung Maschinen in der Pflanzenzelle beschrieben und auch interagiert mit dem Zytoskelett^13,14. Im vorgestellten Experiment der Wildtyp Tabak DREPP2 und seine nicht-Myristoylated mutierte Version (ersetzt durch Ala Gly2) waren GFP-Tag⁶ und in Tabak BY-2 Aussetzung Zellen¹⁵ unter der CaMV-35 s Promoter¹⁶angegeben. Die Plasmamembran Partitionierung dieser Proteine wurden in 3-Tag-alt (3 Tage nach Verdünnung) gemessen, FM 4-64-Label (8 µM) Zell-Kulturen⁶ mit (Abbildung 1A) und ohne (Abbildung 1 b) die Zugabe von Phosphoinositide 3-Kinase Wortmannin (10 µM)¹⁷, nach dem Protokoll beschriebenen Inhibitor. Die beschnittene Version DREPP2(Δ1-23) fehlt der Plasmamembran bindende Domäne⁶ diente als Zytoplasma Marker für Fluoreszenz-Verteilung-Modellbau (Abbildung 1).

Berechnet die Quadratwurzel umgewandelt wurden (der positive Wert entsprechend dem niedrigsten negativen Wert wurde hinzugefügt, auf dieselben Daten nur positive Daten abzurufen), und Daten von zwei-Wege-ANOVA in R⁹getestet wurden. Die Auswirkungen der Mutation und Inhibitor Behandlung waren hochsignifikant (p < 2,2 x 10^-16 ***). Alle Gruppen wurden verglichen mit Tukey HSD Test; alle Gruppen unterschieden sich signifikant mit Ausnahme von DREPP2 von Wortmannin und unbehandelten DREPP2(G2A) (Abbildung 1) behandelt.

Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Plasmamembran Vereinigung der Tabak DREPP2 Protein ist das Ergebnis eines N-myristylierung und elektrostatische Wechselwirkung, welche kooperativ funktionieren. Nur die gegenseitige Beeinflussung der N-myristylierung Site Mutation und Wortmannin Behandlung verursacht eine vollständige Dissoziation des DREPP2 Proteins aus der Plasmamembran. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit bereits veröffentlichten Daten⁶.

Abbildung 1 : Wirkung der Mutation in der N-myristylierung Website und Wortmannin Behandlung auf die Plasmamembran Partitionierung der peripher-assoziierten Plasmamembran Protein DREPP, die in einem Signalweg in der Pflanzenzelle Kalzium beteiligt ist. (A) mediale konfokale Abschnitte von BY-2 tabakzellen mit dem Ausdruck der Wildtyp-Form DREPP2-GFP und das mutierte form DREPP2 (Gly2Ala)-GLP (grün-Kanal). Zellen wurden beschriftet mit FM 4-64 Farbstoff (Magenta-Kanal), Skala bar 10 µm. (B) die gleichen Zell-Linie wurde von 10 µM behandelt Wortmannin (WM). (C) Zellen zytoplasmatischen Marker DREPP2(Δ1-23) zum Ausdruck zu bringen. (D) die geschätzte Plasmamembran Partitionierung für alle Proben. Die Bedeutung beider Effekte wurde von zwei-Wege-ANOVA getestet (p < 2,2 x 10^-16 *** in beiden Fällen; die ursprünglichen Daten wurden Quadratwurzel umgewandelt). Buchstaben geben Gruppen, die nicht signifikant verschieden von einander wie von der Tukey HSD Test bestimmt sind. Schnurrhaare von den BOXPLOTS zeigen 95 %-Konfidenzintervall. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die hier beschriebene Methode erzeugt eine genauere Schätzung der Plasmamembran Partitionierung für peripher verbunden Proteine, die im Vergleich zu anderen Ansätzen basiert auf der Messung der Fluoreszenz-Intensität-⁵. Die wesentliche Verbesserung dieser Methode ist, dass die Lichtbeugung und Überlagerung von der Plasmamembran und zytoplasmatischen Signale berücksichtigt. Obwohl diese Methodenergebnisse im Zusammenhang mit Ergebnissen einer einfachen Methode, basierend auf dem Vergleich der Fluoreszenzintensität an der Membran-Position mit dem Durchschnitt zytoplasmatischen Signal (wie zuvor⁶dargestellt), der große Vorteil dieser neuartigen Methode ist die Bestimmung der verbleibenden Variabilität (unerklärliche durch Signal Zersetzung), die erlaubt die Schätzung der Relevanz der Ergebnisse, vor allem, wo die Plasmamembran Signal niedriger als der zytoplasmatischen Signal ist. Das beschriebene Verfahren ist auch robuster, das Signal-Rausch, weil die Berechnung der Protein Partitionierung nicht auf nur einen Punkt beruht.

Die Analyse erfordert nur Zweikanal-konfokale Einzelbilder. Im Gegensatz zu FRAP Ansätze¹⁸ basierend auf Messungen von Proteindynamik Diffusion in längere Zeitfenster gilt das beschriebene Verfahren mehr für dynamische in-Vivo -Ansätze, wenn schnelle Bildakquisition eine entscheidende Voraussetzung ( ist z.B., Signal Transduction Entdeckungen, hemmende Assays). Das Verfahren eignet sich für den Erhalt der schnell großer Mengen an Daten, die für die statistische Auswertung ausreichen.

Die Methode beschränkt sich auf nur einer einzigen Membran. Die Analyse der Signale von zwei eng benachbarten Membranen der benachbarten Zellen wird derzeit nicht unterstützt. In diesem Fall ist das Signal-Fitting, anspruchsvoller mit einem höheren Risiko von Artefakten.

Jedoch die Analyse wurde ursprünglich für die Pflanze Aussetzung Zellen¹⁵und für Analysen von anderen Zelltypen sowie angewandt werden. Pollenschläuche und Wurzelhaare sind potenziell sehr gute Ziele dieser Methode in Pflanzenbiologie. Externe Membranen der Epidermiszellen der Pflanze können nach einer vorherigen Überprüfung analysiert werden, dass die Zellwände durch FM 4-64 nicht beschriftet sind und nicht störende Autofluoreszenz aufweisen. Protiste Zellen, die frei von störenden Autofluoreszenz, Hefezellen, Pilzzellen sowie tierischen Zellen mit glatten Plasmamembran können mit der beschriebenen Methode analysiert werden; Allerdings kann nicht für Tierzellen die Analyse der PROTEINVERTEILUNG an der Vorderkante des fibroblastenzellen oder an der Bürste Grenze der Epithelzellen möglich. Durch die flexible Analyseeinstellungen markiert FM 4-64 Färbung durch andere Plasmamembran Visualisierung Ansätze, wie z. B. eindringmittel ersetzt werden kann Proteine. Mit Vorsicht kann die Methode für feste Zellen verwendet werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer