Summary
Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.
Abstract
Adım adım bir protokol filtreleme için gama-aminobütirik maddeler ve birleşimler bu el yazması hediye asit yazın (GABAA) reseptörleri ve kimliği roman moleküller preklinik deneyleri bir vitro rekombinant üzerinden aktif doğru kullanımı farmakolojik etkileri kemirgen beyin dilimleri yerel reseptörleri, takımı. Reseptör benzodiazepin sitesinde bağlayıcı bileşikler için radioligand bağlama deneyleri hücre zarlarında büyük GABAA alt türlerini ifade üzerinde geliştirme oluşur bir birincil ekranı ayarlamak için ilk adımdır. O zaman, kemirgen ve insan GABAA reseptörleri Xenopus yumurta veya HEK 293 hücreleri Contegra ifade yararlanarak, elektrofizyolojik deneyleri içinde farklı reseptör fizyolojik özelliklerini keşfetmeye mümkün mü alt türlerini ve tanımlanan bileşiklerin farmakolojik özellikleri. Xenopus oosit sistemi burada, yumurta ve onların mikroenjeksiyon ile iki elektrot gerilimi kelepçeler kullanılarak farmakolojik karakterizasyonu kadar farklı mRNA izolasyonu ile başlayan sunulacaktır. Son olarak, kemirgen beyin dilimler halinde yapılan kayıtları ikincil bir fizyolojik test etkinliği iyi tanımlanmış bir nöronal devre onların yerli reseptörleri, moleküllerin değerlendirmek için kullanılan açıklanacaktır. Hücre dışı kayıtları birden çok nöron nüfus yanıt-e doğru kullanma içinde ilaç uygulama ile birlikte gösterilen.
Introduction
Burada, aktif bileşikler keşfi için protokolleri GABAA reseptörleri Fizyoloji ve farmakoloji bağlama mevcut. Ara roman molekülleri GABAA reseptörleri için belirli, burası tanımlamak için çok önemli, kesin olarak mümkün, alt türü faiz ve özgüllük yeni tanımlanan bileşiklerin değerlendirilmesi (Örneğin, incelenmek üzere, Rudolph görmek ve Knoflach1veya Sieghart2). İlaç keşif ve ulaşılması gereken adımları tipik bir yoldaki Şekil 1' de gösterilmiştir.
Bağlama deneyleri olmuştur ve hala büyük ölçüde ilaç keşfi ilk aşama olarak kullanılır. GABAA reseptörleri söz konusu olduğunda, onlar nerede uyuşturucu tedavi amaçlı yararlı ve güvenli bağlamak benzodiazepin bağlama siteye reseptör bağlamak bileşenleri tanımlamak için optimize edilmiştir. Fluorometrik görüntüleme plaka okuyucu (FLIPR) membran potansiyeli kırmızı boya tabanlı deneyleri3, kullanarak diğer teknikleri, bileşiklerin onların istenmeyen yan etki profili nedeniyle daha az tercih başka sitelere bağlamak barbitüratlar gibi algılamak. Buna ek olarak, kullanılan boyar maddeler doğrudan GABAA reseptörleri, böylece bu deneyleri ilaç bulma4için yarar sorgulama etkinleştirebilirsiniz. Deneyleri bağlama yalnızca belirli bir bileşik belirli reseptör sınıfbağlayabilirsiniz kanıt sağlayabilir. İn vitro deneyleri ile hücre zarlarında seçici insan GABAA α5β3γ2 reseptör ligandlar tanımlamak için kullanılır. İnsan GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ve α3β3γ2 reseptörleri ifade geçici transfected HEK293 hücre zarlarında bu deneyleri için hazırlamak için kullanılır. Ligandlar etkisini membran reseptörleri ([3H] flumazenil bağlama bir inhibisyonu) bağlı [3H] flumazenil mercek ölçerek algılanır. Bu teknik büyük avantajı bileşik bağlama benzeşme reseptör ilgi, hızlı ve verimli belirlenmesi faiz reseptör sağlanan olduğunu.
Fonksiyonel çalışmalar bileşiklerin fonksiyonel etkinlik değerlendirmek ve fizyolojik ve farmakolojik bir açıklama reseptörleri bileşiklerin bağlama neden mekanizmaları teklif etmek gereklidir. Bugün, fonksiyonelA GABA reseptörleri pseudosymmetry iyonik gözenek ve derlemesinden sonucu beş özdeş alt birimleri tarafından kurulmuş bir eksen çevresinde beş alt birimleri Meclisi sonucu İyi tanınan biridir. GABAA reseptörleri çoğu iki veya daha fazla farklı alt birimleri oluşur. Büyük beyin GABAA reseptör, örneğin, bir stoichiometry 2, 2 ve 1 α1, B2 ve γ2 altbirimden sırasıyla oluşan5,6. Xenopus yumurta veya HEK293 hücreleri gibi bir ana bilgisayar sistemi rekonstitüsyon hızla reseptörlerinin farmakolojik özellikleri keşfetme imkanı sunuyor.
Bileşiklerin farmakolojik özellikleri sonra beyin dilimleri7ekstraselüler kayıtları ile incelenmiştir. Bu yöntem bileşikleri etkisi neurotransmission bir keşif ve kapaklı ifade sistemlerinde yerel reseptörleri genel düzeyde belirlenen bileşikler fonksiyonel etkileri onaylamak için etkili bir yol sağlar nöronal ortamı. GABAergic neurotransmission Ayrıca moleküler düzeyde inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs)8bileşiklerin etkisi ölçülerek tespit edilebilir. Ama burada kullanılan ve bütün hücreli yama kelepçe kayıtları Beyin dilimleri içinde temel protokolü daha ayrıntılı ve daha düşük işlem hacmi verim.
Son olarak, güçlü ve zayıf yönlerini α5β3γ2 seçici ligandlar tanımlanması için kullanılan cascade eleme vitro farklı teknikleri ve içsel sınırlamaları perspektif içinde ele alınmıştır. Bu eser uzman ve farklı vitro yaklaşımlar ile birlikte yararlı bir daha gözden geçirme bu ligand kapılı iyon kanalları yeni modülatörler keşfi mücadele için kullanılanA GABA reseptörlerinin alanında uzman sağlamalıdır.
Protocol
Xenopus laevis yer alan ve Cenevre Kanton hayvan kurallarına göre ele.
1. Radioligand bağlama
-
Tahlil plaka hazırlanması
- 1, 5 L 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl ve 15 mM Tris ile tahlil tamponunun hazırlamak; HCl ile pH 7.4 için ayarlayın.
- 50.76 µM (Örneğin, 5 µL bileşik 980 µL tahlil arabellekte bir microcentrifuge tüp içine 10 mm), test edilecek bileşikler hazırlayın. Mix onları iyi bir girdap makine 2 – 5 s için yüksek hızda kullanarak.
- Başvuru bileşik flumazenil öncesi bir seyreltme bileşik (10 mM) pipetting 1 µL tarafından tahlil arabellek 1.970 µL için hazır olun. Mix onları iyi bir girdap makine 2 – 5 s için yüksek hızda kullanarak.
- [3H] flumazenil hisse senedi çözüm 4 4 ° C'de tahlil arabelleği ile seyreltik nM 50 mL polipropilen tüp içinde.
- Pipet 50 µL/iyi tahlil arabelleği sütun 1 ve 3 – 11 / 96-şey Mikroplaka Şekil 2' de gösterilen plaka düzeninde gösterildiği gibi içine.
- 50.76 µM seyreltilmiş bileşiklerin 73.2 µL pipet (bkz. Adım 1.1.2) plaka 12 sütuna.
- Geometrik bir ilerleme üzerinde 9 adımları kullanarak her bileşim, seyreltik (1E-10 -1E-06 M), bir 23.12 µL transfer hacmi ve dolgu sütun 3 – 11. Seyreltme iyice karıştırın. İpucu her seyreltme sonra değiştirin.
-
Hücre zarları sulandırmak
- Daha önce bir HEK293 overexpressing insan GABAA reseptör izole hücre zarlarında çözülme (0,025-0,15 mg/mL), oda sıcaklığında (RT) 80 mL elde edilir ve süspansiyon tahlil arabellek 4 ° C'de transfer
- Membran çözüm hala 4 ° C'de 30-40 s 10.000-12.000 rpm'de için bir doku homogenizer ile resuspend.
-
Diazepam non-spesifik bağlantısını (NSB) denetimi için sulandırmak
- 4 mM diazepam hisse senedi çözüm ile 5 ml 40 µM bir konsantrasyon için tahlil arabelleği sulandırmak.
-
Reaksiyonu başlatmak
- 4 nM [3H] flumazenil 50 µL 96-şey plaka her kuyuya pipet ve bir buzlu su kabında tutun.
- GABAA reseptör alt türü membranlar hazırlık 0,5 mg/mL bir protein konsantrasyonu için 100 µL ekleyin.
- 50 µL 40 µM diazepam 2 sütuna pipet.
- Buz üzerinde 1 h plaka kuluçkaya.
- Her şey bir 96-iyi filtre plaka sonraki membran ayırma ve radyoaktivite ölçümü için tahlil arabelleği 50 µL ekleyin ve reaksiyon sonra durdurmak.
-
Tepki bırak
- 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 ile çamaşır tampon hazırlayın.
- 96-şey hücre hasat kullanarak çözüm filtre. 3 tabak yıkama x 300 µL buz gibi çamaşır arabelleği iyi ücret ile.
- Alt kısmında bir plastik film ile plaka mühür ve mercek sıvı için kokteyl 40 µL eklemek her sayma mercek iyi ve % 70 etanol ile silin.
- En az 1 h plaka RT. yavaşça salla RT, en az bir saat için stand izin
- (BGBM) radyoaktivite plaka bir mercek tezgahın üzerine yerleştirerek ölçmek. Bir şey başına 3 min için ölçme izin.
-
Veri Analizi
- Non-spesifik bağlama (NSB) ve toplam bağlama (TB) de çoğaltır veya örneklerin triplicates gelince 8 için Ortalama çoğaltır belirlemek. % Özel bağlayıcı (SB) aşağıdaki denklemi göre her örnek ortalamasını hesaplamak:
Burada,
Toplam SB NSB demekeksi demek TB =. - Apsis % SB karşı koordine içinde içinde inhibitör konsantrasyonlarının arsa. Tek site Yarışması analiz denklemi kullanarak verileri sığdırmak:
Burada,
y = SB, %
A = y, minimum
B y, maksimum =
C = IC50,
X = rakip bileşim, konsantrasyon günlük10
D eğri (Hill katsayısı) eğimi =. - Yarım maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50), kullanarak bağlama benzeşim (Ki) hesaplamak ilgili membranlar9ve konsantrasyon [3H] [3H] flumazenil ayrışma sabiti (Kd) Flumazenil tahlil göre aşağıdaki verileri kullanarak denklemi:
- Non-spesifik bağlama (NSB) ve toplam bağlama (TB) de çoğaltır veya örneklerin triplicates gelince 8 için Ortalama çoğaltır belirlemek. % Özel bağlayıcı (SB) aşağıdaki denklemi göre her örnek ortalamasını hesaplamak:
2. reseptör ifade ve kayıtları Xenopus yumurta içinde
- Hasat yumurtalık ve oosit hazırlanması
- 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O ve 0,41 mM CaCl2.6H2O, pH 7.4 ile steril Barth çözüm hazırlamak , 100 birim/mL ile penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL amfoterisin b desteklenmiş
- 1 x OR2 orta boy (hiçbir CaCl2) hazırlamak 88,5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, pH 7.4 ile.
- Kurban bir Xenopus Laevis soğutmalı (150 mg/L, pH 7.4 ayarlanmış bir konsantrasyon), Tricaine methanesulfonate ve sodyum bikarbonat (300 mg/L) 20 dk için derin anestezi tarafından kadın işten çıkarma tarafından takip.
- Yumurtalıklar temiz makas ve forseps ile hızla hasat ve 40 mL 1 x Barth çözüm ve antibiyotikler/antimycotic ile dolu 2 Petri yemekler (10 cm) koyun.
- 2 hafta 4 ° C'de Barth çözümde Disosiye olmayan yumurtalık saklamak
- Ayrılma için temiz bir tıraş bıçağı ile Yumurtalık küçük kesirler (1-2 cm3) kesme ve onları CaCl2 (OR2-noCaCl2) olmadan OR2 orta 50 ml % 0,2 collagenase içeren kuluçkaya (tip ı) 100 mL spinner 17-19 ° c şişesi 4 – 5 h. manyetik Bar doğrula için yavaş bir ajitasyon ile yaklaşık 3-5 cm yukarısında yumurta kırma önlemek için spinner balonun altındaki yer.
- 4 – 5 h sonra yumurtalar çoğunu kendi folikül serbest doğrulayın (yani, onlar yüzmek çevresinde tek tek). Onları yıkamak 5 x 1.8 mM CaCl2ile desteklenmiş OR2 200 mL ile.
- Yumurta Petri-yemekleri (10 cm) Barth çözüm ve antibiyotikler/antimycotics dolu ve en az bir gecede 17 ° c cDNA veya mRNA enjeksiyon önce tutmak defolliculated aktarın.
- Ertesi gün, bir dürbün, bir açık ve farklı hayvan karşı bitkisel pole (hayvan pole karşı açık sarı için bitkisel pole için koyu kahverengi) sunan bir sağlıklı yumurta altında seçin. Temiz Pasteur pipetler kullanın ve yumurtalar teker teker steril konik 96-enjeksiyon iyi tabak atın.
Not: Özel bir bakıma mRNA enjeksiyonlar için yumurta yerleşimini gereklidir; Oysa cDNA enjeksiyonlar için yumurta ile hayvan yukarı bakacak şekilde Kutbu yönlendirmek için vazgeçilmezdir.
- mRNA veya cDNA otomatik enjeksiyon
- Önerilen yönergeleri izleyerek bir ticari olarak mevcut kit kullanarak mRNA'ların sentez. Aletleri ve tablo RNase ile temiz ve uygun koruyucu eldiven giymek.
Not: İyi bir ifade vermeye belirleyici kalitesidir mRNA ve enjeksiyon işlemi sırasında mRNA yıkımı önlemek için vazgeçilmezdir. - Piyasada bulunan bir seti kullanarak cDNAs hazırlamak ve istediğiniz miktarı 0,2 µg/µL bir konsantrasyon, bidistilled suda çözülür.
- 10-50 nL 0.2 µg/µL veya 10 nL cDNA çözüm 0,02 – 0,2 değişen bir konsantrasyon, konsantrasyon, mRNA çözümün enjekte µg/µL, tercihen 95 yumurta gruplar halinde.
- Membran için gerektiren birden çok alt birimleri (yani, heteromeric α1β2γ2 GABAA reseptörleri), protein karışımı karşılık gelen mRNA'ların veya istenen oranında cDNAs (yani, 1:1:1 veya 1:10:1).
- Oosit 17 ° c Isı şok proteinleri ifade tarafından yumurta önlemek için tutmak; Mikroplaka ısı kontrollü depolama alanında depolar.
- 0.1-1000 adlı OR2 bağlama tahlil pozitif test edildi test bileşikleri dağıtılması µM elektrofizyolojik kayıtlar için ve onları bir 96-şey düz dipli Polipropilen tabak içinde atmayın.
- Önerilen yönergeleri izleyerek bir ticari olarak mevcut kit kullanarak mRNA'ların sentez. Aletleri ve tablo RNase ile temiz ve uygun koruyucu eldiven giymek.
- Plazmid ifade için
- Kılavuzlarına bakteriyel T7 veya T6 promotors ile mRNA sentezi için piyasada kitleri izleyin ve bir çözüm 20 µL 0,2 µg/RNase free suda µL olun.
- En az 20 µL cDNA ifade 0.2 µg/µL bidistilled suda, genellikle ökaryot ifade vektör içeren bir çözüm hazırlamak.
- Mikroenjeksiyon oosit ve görsel kalite olarak
- 10-50 nL plazmid içeren çözüm enjekte (bkz. Adım 2.3.1 veya 2.3.2) cam mikro-enjeksiyon iğne 100 µm arasında değişen bir uç çapı ile oluşturulmuş bir basınç Fırlatma sistemi ya bir otomatik enjeksiyon sistemi ile donatılmış bir micromanipulator üzerinde.
Not: burada açıklanan örnekte, toplu halde 95 cDNA veya mRNA ile kullanıma uygun otomatik bir sistem ile yumurtalar enjekte edilir. - Enjeksiyon iğne 1 µL % 1 metilen mavisi gibi bir boya ile doldurun ve standart prosedür (cDNA için çekirdek veya mRNA için sitoplazmada) kullanarak yumurta enjekte.
- Yaklaşık 1 dakika kaynar suda için enjekte yumurta atın. Yumurtalar bir dürbün altında bir tıraş bıçağı ile ikiye böldüm.
Not: Boya Şekil 3'Eenjeksiyon hassas bir gözlem izin, gösterildiği gibi lokalize kalır.
- 10-50 nL plazmid içeren çözüm enjekte (bkz. Adım 2.3.1 veya 2.3.2) cam mikro-enjeksiyon iğne 100 µm arasında değişen bir uç çapı ile oluşturulmuş bir basınç Fırlatma sistemi ya bir otomatik enjeksiyon sistemi ile donatılmış bir micromanipulator üzerinde.
- İki elektrot gerilimi kelepçe kayıtları
- Şekil 4' te gösterilen prensibi kullanır otomatik sistem üzerinde yumurta içeren iyi tabak koyun.
Not: Şekil 5' te gösterilen yama kelepçe sistemi aksine, hücre gerçek membran potansiyelini gerilim elektrot tarafından okunur. - Örneğin, Şekil 6 ' da konsantrasyon etkinlik ilişkisi tayini için resimli düzenine sahip simge tabanlı arabirimi kullanılarak otomatik kayıt sistemi programınız.
- Şekil 4' te gösterilen prensibi kullanır otomatik sistem üzerinde yumurta içeren iyi tabak koyun.
- Eğri uydurma
- Resimli konsantrasyon harekete geçirmek eğrisi kullanarak uygun yazılımı kullanarak sonuçları analiz, geçerli genlik agonist konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak arsa.
- Daha sonra formu ampirik Hill denklemde ile donatılmış olabilir sigmoidal eğri uyun:
Burada,
Yuyarılmış akım, kısmını =
EC %50 50 harekete geçirmek için konsantrasyon =
x = bileşik toplama
nH = Hill katsayısı veya belirgin cooperativity. - Bir birlik akımları hücreler bir dizi elde edilen verileri çözümlemek için en yüksek konsantrasyonu, değeri kaydedilen her yanıt karşı genliği bölerek normalize.
- Ortalama ve standart hataları belirlemek ve size mevcut yazılım kullanarak eğri uydurma farkındayız.
3. elektrofizyolojik kayıtlar Beyin dilimleri
Not: Hipokampal sıçan dilimleri ulusal ve kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak hazırlanır.
-
Hippocampus dilimleri hazırlanması
- Diseksiyon yapay beyin-omurilik sıvısı (dACSF) 124 mM NaCl 124, 2.5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glikoz ve 4 mM ile hazırlamak % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile şişe benzin saccharose.
- Kayıt yapay beyin-omurilik sıvısı (rACSF) 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3ve 10 mM glikoz ile hazırlamak % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile şişe zehirledi.
- % 2.5 isoflurane ve saf oksijen karışımı kullanarak fareler anestezi ve onları başını kesmek.
- Orta hat makas güzel bir ikili ile takip kafa derisi kesilmiş. Kafatasının orta çizgi boyunca temel doku zarar vermeden kes. Cımbızla kafatasını ve beyin kepçe için iyi bir spatula kullanın.
- Gazla dACSF çözüm RT, beyin koyun ve sol hipokampal oluşumu iyi bir spatula ile incelemek.
- Enine dilimler (400 µm kalınlığında) hipokampüs orta kısmından bir doku helikopter ile kesin ve kayıt odasına bir boyama fırça kullanımı ile aktarabilirsiniz. RT, dilimler için 45 dk korumak.
- Dilimleri ile 35 ° c gassed rACSF sıvı ve 1,5 mL/dk. hızında % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile çözüm kabarcık.
Not: Bu adımdan sonra dilimler elektrofizyolojik deneyler için hazır olur.
-
Tek nüfus spike kayıt
- Bir beyin dilim mikroskop monte edilmiş odanın içine yerleştirin.
- 3 mL/dk ile rACSF oranında dilim sıvı.
- Borosilikat cam micropipette direnci ~ 2 MΩ sahip pipet çektirme ile çek.
Not: Bu micropipette kayıt elektrot kullanılır ve elektrikle amplifikatör için bağlı. - Micropipette 2 M NaCl içeren bir çözüm ile doldurun ve amplifikatör pipet yuvasına yerleştirin.
- Kayıt micropipette doğru micromanipulator kullanarak hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki stratum pyramidale yerleştirin.
Not: Konum şematik Şekil 7' de temsil edilir. - Bir yalıtılmış bipolar platin/iridyum Elektrot tutucu sol micromanipulator üzerine yerleştirin.
Not: Bu elektrot uyarılması elektrot kullanılır ve uyarıcı jeneratörü elektrikle bağlı. - Stimülasyon elektrot Schaffer de¤erler doğru micromanipulator kullanarak hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki yerleştirin.
Not: Konum şematik Şekil 7' de temsil edilir. - Geçerli nabzı uyarıcı Oluşturucu'yu kullanmamanızı stimülasyon elektrot her 30 teslim s (100 µs süreleri 10 µA başlayarak) ve bir nüfus artışı (PS) görünene kadar yavaş yavaş stimülasyon gücünü artırmak.
- Elde edilebilir en yüksek genlik % 45'i için karşılık gelen bir PS uyandırmak için uyarıcı güç ayarlayın. PSs 2.4 KHz filtre ve 20 KHz sinyal amplifikatör kullanarak sayısallaştırılmış.
-
Çifte darbe inhibisyon
- Beyin dilimleri (adım 3.1) hazırlamak ve daha önce açıklandığı gibi devam edin (adımları 3.2.1–3.2.7).
- İki geçerli bakliyat (100 µs süreleri 20 ms aralığında) stimülasyon elektrot için her 30 teslim uyarıcı Oluşturucu'yu kullanmamanızı s. Maksimum genlik % 45'i için karşılık gelen bir PS uyandırmak için uyarıcı güç ayarlayın.
-
Test bileşik
- Dilutions benzin ACSF test edilecek bileşiklerin yapmak böylece DMSO değil 0,1 daha yüksek son konsantrasyonu.
- DMSO bileşik çözüm daha aynı konsantrasyonu, kontrol çözümü ekleyin.
- (Adım 3.2) tek bir kayıt veya eşleştirilmiş-darbe (adım 3.3) PS Schaffer teminat elektrodlar tarafından uyarılmış her 30 s en az 30 dk için. PS şekli bu temel dönemde kararlı olmalıdır.
- Bir ölçek ile benzin rACSF test edilmesi için bahçedeki sabit bir konsantrasyon içeren hazır olun.
- Bu çözümle hipokampal dilim hala tek veya eşleştirilmiş-nabız PS kaydederken sıvı
- Bileşik etkisi kurtarma gazla rACSF bileşik olmadan dilimle ventriküler tarafından değerlendirmek.
Not: geri dönüşümlü etkileri için PS bileşik uygulamadan temel dönemde gözlenen ilk şekli döner.
-
Veri Analizi
- Ortalama PS izlemeler sırasında 4 veri analiz yazılımı kullanarak bloklarını deneyde kaydetti.
- Ortalama izlemeler PS genlikleri ölçmek.
- 10 dk bir bileşik ventriküler daha önce kaydedilen temel değerler yüzdesi olarak genlikleri normalleştirmek.
- ± Sem demek gibi verileri hızlı
Representative Results
Bağlama:
Vitro tahlil hücre zarlarında ile seçici insan GABAA α5β3γ2 reseptör ligandlar reseptörleri içeren BZD allosteric yerinde γ2 bağlama tanımlamak için kullanılır. İnsan GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ve α3β3γ2 reseptörleri ifade geçici transfected HEK293 hücre zarı bu tahlil için hazırlamak için kullanılır. Potansiyel ligandlar etkisini membran reseptörleri ([3H] flumazenil bağlama bir inhibisyonu) bağlı [3H] flumazenil mercek ölçerek algılanır. Deplasman bağlama eğrileri sonra RO4938581 ile örnekte olduğu gibi belirli bir GABAA reseptör için bileşiklerin seçicilik değerlendirmek için oluşturulan (Şekil 8). Şekil 9 bağlama tahlil kullanarak oluşturulan α5 seçici GABAA reseptör negatif allosteric modülatör, RO49385819, da dahil olmak üzere birkaç başvuru bileşikleri profil özetler.
Kayıtları Xenopus yumurta:
GABAA reseptörleri α5β3γ2 birimlerinden gibi ifade güçlü akıntılar yanıt GABA pozlama olarak verir. Tipik gerilim kelepçe kayıtları elde edilen insan α5β3γ2 yanıt kısa GABA bakliyat olarak ifade bir yumurta içinde (30 s) 300 µM arasında değişen Şekil 6' da gösterilmiştir. Bu deneyde, GABA farklı konsantrasyonları 96-şey plaka bertaraf edildi ve yanıtları hücrenin belirli bir kuyuda hareket ettirerek uyarılmış. GABA iyice hücre merkezi perfüzyon odasına dönen ve karşılık gelen peristaltik pompa etkinleştirerek bir perfüzyon kontrol çözümü uygulamak yıkandı. Konsantrasyon harekete geçirmek eğrisi belirlenmesi için kullanılan program sıralaması Şekil 6'Agösterilmektedir. Tam otomatik olarak yürütülen, bu veriler hem kalite Xenopus yumurta elde edilebilir kayıtları göstermek ve bir kaç gün sonra mRNA enjeksiyon reseptör ifade yüksek düzeyde elde. Farklı reseptör kombinasyonları yapılan deneylerde, bir dizi GABA reseptörleri yarısı etkinleştirmek için gereken konsantrasyon EC50s verim. EC50's değerleri bir örümcek grafikteki bir arsa Şekil 10' da gösterildiği gibi reseptör özellikleri hızlı bir karşılaştırma ve alt birim kompozisyon etkisi sağlar.
Bir negatif veya pozitif allosteric modülatör (NAM veya PAM) etkisini incelemek için ilk denetim ve daha sonra modülatör huzurunda bir agonist (GABA) test darbe tarafından uyarılmış yanıt karşılaştırmak gereklidir. Böyle bir deneme yapmak için verimli bir deneysel protokol Şekil 11' de gösterilmiştir. Hücre yanıt GABA bir başvuru konsantrasyon için öncelikle belirlenir ve sıra aynı GABA konsantrasyon uygulayarak ve daha sonra ortak bir uygulama GABA artı modülatör tarafından yinelenir. İki üst üste tepkilerin bir komplo bu örnekte işaretli bir inhibisyon modülatör varlığı ile neden ortaya koymaktadır. Bir miktar modülatör etkisi kolayca yanıt oranını kontrol modülatör karşı huzurunda uyarılmış ve sonuçları bir ısı Arsa şeklinde çizilebilir hesaplayarak elde edilir. Şekil 12 ' de gösterilen veri kayıtları için 96 bileşikler elde edilen üç veri kümelerinin karşılık gelen ısı Arsa göstermektedir.
Yeterince aktif bileşikler kimlik, bu moleküller diğer reseptör kombinasyonları etkin olup olmadığını değerlendirmek için vazgeçilmezdir. GABAA reseptör durumunda 19 genler için farklı alt birimleri kodlama tespit edilmiştir ve bu fonksiyonel bir reseptör (bkz: Knoflach, Hernandez ve Bertrand10 için bir multimeric Meclisi farklı alt birimleri neden olabilir bilinmektedir bir gözden geçirme için). Birden çok alt birimleri ve kombinasyonları verim reseptör geniş bir repertuar bu subtypes rağmen çok sayıda sayaç tarama yapılması için gerektirebilir, bu kez ilk üzerinde odaklanmaya mümkündür en bol olan, GABAA söz konusu olduğunda sunucu_anabilgisayar_adı reseptörleri, α1β2γ2 kompozisyon. İfade ile kafa kafaya yapılan deneylerde, örneğin, α5β3γ2 ve α1β2γ2 yumurta aynı toplu bir iyi karşılaştırılması ilgili belirli bir molekül verim. Α5β3γ2 ve α1β2γ2 için üç hücrelerindeki elde edilen tipik sonuçları α5β3γ2 adlı bir molekül Tercihli pozitif modülasyon göstermektedir Şekil 13, gösterilir.
Şekil 11 ' de gösterildiği Deneysel protokol PAM etkinlik karakterizasyonu için uygundur. Bu protokol için Sınanan giderek artan konsantrasyonları, agonist ile birlikte uygulanan bileşiktir. Birden çok uygulama aynı hücreyi neden olası toplu etkileri önlemek için yeni ve saf hücre her veri noktası için ölçülür. Yanıt genliği ölçüsü agonist yalnız kayıt ve PAM veya NAM efekti quantifies bir oranı bileşik uygulama sırasında verir. Α1β2γ2 ve α5β3γ2 diazepam için elde edilen tipik sonuçlar Şekil 14' te, yaklaşık olarak da bu reseptör arada 10 kat daha yüksek α5β3γ2 belirgin bir duyarlılığını ortaya gösterilir. Yayımlanan veri11ile iyi ilişki içinde bu değerlerdir. Benzodiazepin sitesi γ2 ve onun bitişik α alt birim12-14arasında arayüz tarafından oluşturulan düşünülmektedir gibi α5β3γ2 duyarlılığını γ2-α1 üzerinde γ2-α5 için tercihli diazepam ilgi gösteriyor. Farklı reseptör kombinasyonları ile verimli bir işlevsel karakterizasyonu kombine ifade etme olasılığını belirleyicileri PAM özellikleri ve onların dolaylı fizyolojik ve farmakolojik etkileri için keşfetmek için birden fazla yol açmaktadır.
Hipokampal Beyin dilimleri:
Sıçan hipokampal Beyin dilimleri ile deneyler vitro deneyleri yerel reseptör modelindeki tanımlanan bileşiklerin farmakolojik profil doğrulamak için yapılmaktadır. Hipokampüs piramidal hücrelerde ifade baskın GABAA reseptör alt türlerinden α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 ve α5β2/3γ2, hangi tüm benzodiazepin (BDZs)15tarafından modüle vardır. Çifte darbe inhibisyon hipokampal devre uyarılabilirlik iki eşli elektriksel uyaranlar 20 ms ayrı teslim ikinci yanıtta değişiklik test ederek ortaya çıkarabilir bir örnektir. İkinci yanıt piramit hücre katmanı16-18innerve interneurons GABAergic geribildirim nedeniyle değişimdir. Denetim durum, Şekil 7' de gösterildiği gibi iki eşli uyaranların ikinci yanıt nedeniyle GABAergic inhibisyonu engellenir. Bu inhibisyon dilim β-CCM ile ventriküler tarafından küçüldüğünde seçici NAM, iki eşli uyaranların ikinci yanıt çok daha az bir ölçüde engellenir. Bu deneysel bir paradigma bileşikleri α5 alt birimi içeren bir GABAA reseptör için seçici duyarlıdır.
Resim 1 : Strateji eleme. Tipik bir uyuşturucu yolu eleme içinde belirli bir hedef için büyük Kütüphaneler bileşiklerin ekranlı yüksek üretilen iş tarama ile başlar. Kurşun aday kimlik, tıbbi Kimya çalışmaları başlar. Bu aşama süresince, kimyagerler çalışma ve molekülleri rafine hedef seçicilik, beyin alellerle, istikrar, Bozulması vb çok önemli bu aşamada gibi istenen kriterleri karşılamak için yapısal bir değişiklik yaparak bu esastır kimyasal değişimleri molekül özellikleri değiştirmiş değil değerlendirmek ve iyileştirmek için en iyi aday için. Aşağıdaki adım tanımlamaktır işlevsel ama tahlil kalsiyum floresans gibi diğer yöntemleri gibi birkaç umut verici maddeler ve birleşimler ve emanet, hoşgörü, dahil sonraki adımlar için getirmek vb Not o Elektrofizyoloji gösterilir deneyleri veya voltaj duyarlı boya, alternatif olarak kullanılabilir. Bu ikinci yöntemler de yüksek üretilen iş deneyleri içinde olarak bir ikame bağlama deneyleri için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : 96-iyi yerleşimini deneyler bağlama için kullanılan kaplama. Sütun 1 Toplam bağlama ölçüleri ve sütun 2 non-spesifik bağlama ölçümler için kullanılır. Satır A-H her bileşim çiftleri içinde artan konsantrasyonları (sütun 3 – 12), 4 farklı bileşikler ile doldurulur (Yani, bileşik 1 satır A ve E, bileşik 2 satır B ve F, vb) farklı renk düzeniyle temsil etti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Otomatik bir sistem kullanarak mikroenjeksiyon. (A) A kesin XYZ sistem, hangi faiz, plazmid içeren sıvı ile dolu bir cam enjeksiyon iğne otomatik olarak dürttü yumurta. (B) Bu panel hangi (C) yumurta otomatik olarak enjekte edilir 96-şey Konik-alt plaka gösterir. (D) Bu panel enjeksiyon ilke göstermektedir. Nükleer enjeksiyon için iğne Masası'nda Bgösterildiği oosit çekirdek, biraz daha derin nüfuz eder. İğne çekirdeği sonra içine kapanık (bkz: panelini C) enjeksiyon önce (bkz: panelini D). (Enjeksiyon, iğne kalitesini değerlendirmek için,E) bir boya ile dolu olabilir ve "pişmiş" yumurta yarım kesilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Otomatik iki gerilim-kelepçe elektrot prensip. Prensip sıvı içinde perfüzyon uygulamak yerine hazırlık kuyular arasında hareket temel alır. (A) panelinin sol tarafındaki temsil eden iki elektrot ve hazırlık bir örnekten hareket sırasında çevresinde sıvı bir damlacık korur küçük sepet Xenopus oosit kayıt sağlayan düzenleme diğerine. Sepet ve iki elektrot yerleştirilir oosit resmini sağ tarafında görüntülenir. (B) Bu panel "ters" Elektrofizyoloji ilke kayıt şematik gösterimi gösterir. (C) Bu panel kayıt masaya yumurta, bileşik plaka ve yıkama istasyonu eğilim gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Karşı yama kelepçe kayıt iki elektrot gerilimi kelepçe. Yumurta (sol panelde) için kayıt tipik iki elektrot gerilimi kelepçe bir hücre satırı (doğru kapı aynası) için kullanılan düzeltme eki kelepçe yapılandırma karşılaştırılır. Boyutu yaklaşık 20 µm olan hücreleri yaklaşık 1 mm çapında karşı olan yumurtalar arasındaki farka dikkat edin. İki elektrot gerilimi kelepçe, oosit membran potansiyelini ortaya çıkarmak için istenen holding voltaj karşılaştırılır ve sinyal fark geçerli elektrot enjekte edilir. Yama kelepçe kayıt düzeltme eki kelepçe elektrot ihmal edilebilir karşı membran direnç dirençtir ve bu nedenle, gerilim tarafından amfi dayatılan sadakatle için hücre zarı19besleniyor, kabul edilir. Resmi bir teta tüp () iki kanal ile bir yandan, bir kontrol çözümü ve, öte yandan, uyuşturucu20,21içeren çözüm ile doldurulur bir sıvı filaman perfüzyon göstermektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Konsantrasyon harekete geçirmek ilişki insan α5β3γ2 reseptörleri de. (A) sıra otomatik sistem simgeleri bir dizi oluşur ve konsantrasyon harekete geçirmek ilişki tespiti için deneysel protokol ayarlar kontrolü. Adımlar 1-3, bu Masası'nda gösterildiği gibi sistem oosit plaka ölçüm sepet içine yükler. 2. adımda kaçak akım ölçülür ve bu değeri aşacak istediğiniz ölçütü, hücrenin otomatik olarak değiştirilir (adım 3). Bir istikrar süre sonrasında (adım 4), oosit başvuru GABA toplama ölçülen (adım 5-8) yanıttır. Akımları 1 µA büyük görüntüleme yumurta sonraki ölçüm için tutulur. Adımda 11 – 13, hücre GABAA farklı konsantrasyonları tarafından meydan ve kendisi konsantrasyonları (adım 14) istenilen sayıda ve hücreleri (adım 15) işlem yinelenir. (B) Bu panel gösterir kısa GABA uygulamaları bir dizi tarafından uyarılmış tipik akımları (30 s) sipariş büyüyen uygulanan. Bileşik uygulama zamanlaması çubuklarla gösterilir. (C) A Arsa tepe içe geçerli GABA konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak devamlı bir eğri oluşturacak, bir EC50 11 µM ve bir tepe ile ampirik Hill denklemi tarafından kolayca monte konsantrasyon harekete geçirmek eğrisi verimleri 1.3 katsayısı. 8 hücrelerde kaydedilen akımları maksimal uyarılmış yanıt için bir birlik için normalleştirilmiş. Çubuklar ortalama standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : β-CCM, GABAA NAM eşleştirilmiş-nabız inhibisyon hipokampal dilimleri içinde azaltır. (A) Bu panel gösterir bir sıçan hipokampal dilim şematik gösterimi. CA1 piramidal nöronların dendritik arborization CA3 piramit hücre aksonlar projede kaynaklanan Schaffer de¤erler (Sch C). Mikropipetler nüfus sivri (PS) kaydetmek için stratum pyramidale (str pyramidale) ve alan eksitatör postsinaptik potansiyeller (epsp) dendritik kayıtları için stratum radiatum (str radiatum) yerleştirildi. Stimülasyon elektrot içinde Schaffer de¤erler yerleştirildi. (B) Bu panel aynı uyarıcı elektrot bir 20 ms aralıklarla uygulanan eşli uyaranlara tarafından uyarılmış PSs gösterir. İkinci uyarana (PS2) nüfus yanıt yanıt ilk uyarana (PS1) daha küçük genlik biridir. (C) PSs Devamsızlık (siyah bar) ve β-CCM, bir seçici GABAA reseptör NAM (yeşil bar) varlığı kaydedildi. Β-CCM ikinci PS2 genliği kısmen herhangi bir besleme ileri GABAergic inhibisyon bloke ederek gelişmiş. Çubuklar ortalama standart hatasını gösterir ve *** veri bir p ile son derece önemli < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: tipik bağlama sonuçlar elde bir rekabet (inhibisyon veya yer değiştirme) tahlil. Deplasman bağlama eğrileri hangi IC50 ve kı belirlenebilir üzerinden oluşturulur. IC%50 50'sini radioligand özel bağlayıcı yerinden rakip bir ligand konsantrasyonu ve kı (inhibisyon sabit bir ilaç için) reseptörleri % 50'si yok radioligand Eğer işgal ederler bir rakip ligand konsantrasyonu hazır bulundu. Ki Cheng-Prusoff denklemi kullanarak IC50 hesaplanır:
Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9 : Rekabetçi deplasman bağlama ligandlar büyük GABAA reseptör alt türlerinden bağlama ile gerçekleştirilen. Benzeşim (nM) [3H] flumazenil bağlama tahlil kullanılarak ölçüldü ve membran HEK293 hücrelerden geçici farklı insan GABAA reseptör alt birim kombinasyonları ile transfected. Çubuk grafik gösterimi için en düşük Ki, α5β3γ2 reseptörleri ile bileşik RO493851 gözlenen fark duyarlılığı açıkça göstermektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10 : Fark GABA reseptörleri duyarlılığını. Reseptör GABA EC50 örümcek arsa üzerinde bir arsa ve sözde alt birim kompozisyon bir gösterimini sağlar farklı alt birimleri rolü karşılaştırmak için etkili yollardan. Γ2 alt birimleri getirilmesi reseptör duyarlılığı bir azalma ile ilişkili olduğunu unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 11 : Bir modülatör etkisi sondalama. (A) Bu panel otomatik sistem kontrol etmek için kullanılan simge sırası gösterilmektedir. Not iki (A/D) simgeler (yeşil) denetim ve modülatör pozlama (kırmızı) sırasında kayıt denk gelir. (B) Bu panel tipik akımları GABAA reseptör dizisi sırasında ifade bir hücreye kaydedilmiş gösterir. Bir modülatör etkilerini değerlendirmek için ilk maruz GABA için ilk ve sonra GABA artı modülatör (kırmızı izle), ardından GABA (yeşil izle), sabit bir konsantrasyon maruz uyarılmış yanıt ölçme bir sıra yapılmıştır. (Mavi ve mavi) artı imleçleri konumlandırma ölçümleri sınırlandırır ve mavi çapraz iki kayıt koşulları arasında maksimum fark gösterir. Denetim ve modülatör durum arasındaki oranı analiz yazılımı otomatik olarak hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 12 : Isı komplo ile üç çoğaltır. Bu panel için insan α5β3γ2 GABAA reseptörleri, 96 bileşikler elde modülatör etkileri üç çoğaltır karşılık gelen bir ısı Arsa gösterir. 0.5 ve 1.2 arasında değişen denetim üzerinde test yanıt oranları önemli ölçüde denetiminden farklı olarak kabul edildi ve bir yeşil nokta tarafından temsil edilir. Oranları 0,5 aşağıda bir inhibitör etkisi temsil olarak kabul edildi ve mavi nokta ile gösterilir. Oranları 1,2 yukarıda yanıt artırılması olarak kabul edildi ve kırmızı nokta ile gösterilir. Desen üç bağımsız kayıtları arasında benzeşme unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 13 : Counter α1β2γ2 gösterimde. Bir sözde alt birim organizasyon gösterimi bir (A) Bu panel gösterir. Aşağıdaki panelleri (B-D) insan α5β3γ2 ve (F-H) olumlu bir allosteric modülatör etkileri değerlendirilmesi GABA karşılaştırılabilir konsantrasyonları ve benzer konsantrasyonları (100 µM) kullanarak α1β2γ2 göstermek bileşik özgüllük vurgulamak modülatör bu deneylerde test. (E) Bu panel Ayrıca sözde alt birim organizasyon gösterimi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 14 : PAM duyarlılık ve reseptör kompozisyon. Diazepam etkileri (A-D) α1β2γ2 ve (E-H) konsantrasyonları bir dizi etkileri belirlenmesi α5β3γ2 reseptörleri belirgin benzeşme neredeyse 10 kat bir fark ortaya koymaktadır. Ayrıca alt birim kompozisyon yanıt zaman gidişatı üzerinde etkisi α1β2γ2 reseptörleri, daha hızlı bir duyarsızlaştırma ile (bkz, örneğin, paneller Ge ve H) dikkat edin. Α1β2γ2 dikkat edin ve α5β3γ2 reseptörleri görüntü farklı benzeşim GABA için (Ayrıca bakınız Şekil 10), agonist konsantrasyonu arasında karşılaştırılabilir harekete geçirmek aralığında olmak iki reseptörleri ayarlandı. (I) Bu panel bir komplo temsil eden kat artış geçerli genlik denetim durumu birlik karşı için normalleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 15 : T7 ve CMV promotor dahil olmak üzere ifade plazmid. Bu paneller plazmid ifade için bir Xenopus oosit (üst doğru kapı aynası) ve bir hücre kültürünü göster. Alt doğru kapı aynası da yeşil flüoresan protein (GFP) için gen içeren bir plazmid ile transfected tipik bir HEK-293 hücre yama-kelepçe kayıt elektrot ile gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Geliştirme roman bileşiklerin etkin bir ligand kapılı iyon kanalA GABA reseptörleri gibi birden fazla yaklaşımları kullanımını gerektirir. Genellikle, ilk adım genellikle bağlama deneyleri kullanarak yapılır; Ancak, bu tür ölçümleri bileşik veya onun hassas Farmakoloji fizyolojik etkinlik derecesinin yetersizdir. Özellikle, bir takımı bağlar bir bileşik geliştirmek veya işlevi inhibe veya bile (sessiz olmak) fonksiyonel etkisi üretmek (yani, onun işlevini değiştirme olmadan reseptör bağlamak). Böylece, fonksiyonel test tam bileşik bir karakterizasyonu için gereklidir.
Deneyleri bağlama:
Bağlama tahlil büyük avantajı bu verimli bir şekilde örnekleri birkaç bin kadar değişen sayıda yapılabilir olduğunu ve etkin moleküller için bağlama affinities sağlar olduğunu. Burada açıklandığı gibi ilk adım bir yöntem istenen reseptör alt türlerinden değerlendirmesi için oluşturma oluşur. Yani, bağlama kesirleri veya tüm beyin yerli reseptörleri üzerinde yapılan iken, böyle bir yöntem belirli reseptör alt türlerinden, benzeşim belirlenmesi engeller. Bu, bu nedenle, ekran moleküllere rekombinant sistemleri istenen hedef kullanmak gereklidir. Günümüzde, istenen reseptör alt birim cDNAs hücre hatlarında, geçici veya sabit transfection reseptör alt türleri (Örneğin, GABAA α5β3γ2) ilgi ifade etmek için verimli ve güvenilir bir yöntem sunuyor. Geleneksel bağlama deneyleri yapmak kullanmak teknikleridir radioligands, ama günümüzde mevcut radyoaktivite (Örneğin, kantitatif floresan tabanlı-ligand taşıması) işleme rahatsızlık kaçının.
Bir ana bilgisayar sistemi işlevsel ifadede:
Bir ana bilgisayar sistemindeki genlerin ifade etmek için kodlama dizisi ilgi yeterli promotors içeren bir plazmid eklenmesi gerekir. Genellikle, vitro mRNA sentezi için bakteriyel T7 veya T6 promotors kullanılır. CMV (sitomegalovirüs) veya eşdeğeri gibi ökaryot promotor tarafından cDNA ifade için faiz Gen transkripsiyonu düzenlenmiş olması gerekir. Günümüzde, birkaç plazmid (yani, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, PCI-neo, pcDNA), iki promotors de dahil olmak üzere, kullanılabilir bir vitro sentezi mRNA ya da Şekil 15' te gösterildiği gibi bir cDNA ifade izin vardır. Bir ifade GABAA reseptörlerinin sadakatle hücre hatları veya Xenopus yumurta elde edilebilir. İkinci en önemli avantajları bir endojen reseptör ifade, manipülasyonlar sadeliği ve mikro-enjeksiyon ve kayıtları için otomatik bir sistem kullanılabilirliğini eksikliği vardır. Bu protokol için açıklanan yordamları yaklaşık 7 dakika içinde 96 yumurta enjeksiyon sağlar ve hiçbir embriyolardan beceri gerektirir otomatik sistem etkinliğini göstermektedir. Xenopus tek yumurtalıktan 10.000 – 30.000 yumurtalar arasında içerir hatırlayarak, bu hücre ölçümleri, çok sayıda tek bir hazırlık yapılabilir açıktır. Bir ifade kullanarak cDNA enjeksiyonları yapılabilir gibi Ayrıca, bağlama deneyler için geliştirilen genleri ilgi içeren aynı plazmid ezelî belgili tanımlık lüzum daha da moleküler biyoloji işlevsel bir karakterizasyonu için kullanılabilir manipülasyonlar.
Onun büyüklüğü ve yüksek yüzey anlatım göz önüne alındığında, bir tek yumurta yaklaşık 35 mm Petri kabına konfluent hücrelere eşdeğerdir reseptörleri sayısını verir. Ancak, bir yumurta hazırlık ve enjeksiyon gösteren bir hücre kültürünü maliyetinin bir kısmını deneyler özel bir kültür ortam ve steril manipülasyonlar gerekmez. Bir kaç picoamperes (10-12) tek bir GABAA kanal aktivasyonu verimleri ve ilâ microampere (10-6) onlarca arasında değişen akımlar kolayca birkaç milyonlarca eşlik eden etkinliğini doğruladı bir tek yumurta içinde kaydedilir reseptörleri sırasında tek bir yanıt.
İlk adımda ligand kapılı iyon kanalları karakterizasyonu kez reseptörlerinin belirgin benzeşme belirlenmesidir. Tarihte gerek deneyler bir dizi kısa agonist testi uygulayarak ve genliği uyarılmış geçerli veya belirli durumlarda, agonist konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak (AUC) eğri altındaki alan komplo oluşur. Farklı plazmid konsantrasyonları ve yumurtalar aynı toplu oranı microinject kolayca mümkün olduğu gibi bu sistem ifade böyle bir karakterizasyonu için özellikle uygundur. Ayrıca, bir toplu iş toplu iş karşılaştırma istikrar için farklı EC50s yüksek derecede ortaya koydu. Alt birim kompozisyon reseptör'ın belirgin benzeşme hakkında etkisi kolayca Şekil 10örneği olarak bir örümcek arsa kullanarak görüntülenir.
Xenopus yumurta elde iki elektrot gerilimi kelepçe sonuçlarını sık sık düzeltme eki EKG mandalları kullanılarak yapılan kayıtları ile karşılaştırılır. Bu iki sistem arasında detaylı bir karşılaştırma gitmek bu işin kapsamı ötesinde gitti ise bir kaç puan incelenebilir. Hücrelerde bir yama kelepçe hızlı ilaç uygulaması ile biyofiziksel bir karakterizasyonu için avantajları sunarken, gereksinimleri daha bu iki elektrot kayıtları Xenopus yumurta daha karmaşıktır. Zorluk ilk ve önemsiz olmayan bir hücre kültürü, bir geçici veya sabit transfection gerekliliği ve istenen yapı ifade eden hücreler tanımlaması ile verilen bir protein ifadesidir. Buna ek olarak, kabul hücre endojen ifadede mümkün katkısını incelemek için vazgeçilmezdir. Ayrıca, bir yama kelepçe kayıt o kişi de, örneğin, mühür kalitesini değerlendirmek için deneme sırasında yeterli bir analiz yapmak gerekir iken yüksek büyütme mikroskop altında embriyolardan yapmak yetenekli bir kişi gerektirir, erişim direnç vb aksine, kayıt, özellikle bir elektrofizyolojik otomatik bir sistem kullanarak bir iki elektrot gerilimi kelepçe herhangi bir özel beceri gerektirmez ve Laboratuvar teknisyenleri tarafından yapılabilir.
Elektrofizyolojik bir set-up edinme zaman maliyet dikkate kesinlikle dikkatli bir şekilde çözümlenmesi gereken önemli bir faktördür. Otomatik bir sistem maliyeti nispeten yüksek olmakla birlikte, örneğin, daha yakın bir karşılaştırma yükleme tam elektrofizyolojik teçhizat gibi iyi micromanipulators, bir dürbün lens, bir amplifikatör, bir perfüzyon donanımları satın içerir ortaya çıkarır Sistem ve ayrıca veri alınıyor ve bir çözümlemesini süre bir anti-titreşim tablo. Bir iki elektrot gerilimi kelepçe koymak-yukarıya karşı bir yama kelepçe koymak-yukarıya arasında bir maliyet karşılaştırma daha da farklılıklar ortaya koymaktadır. Ayrıca, otomatik bir sistem tam otomatik ekipman avantajı sunuyor ve gece gündüz katılımsız çalışır.
Bir bileşik farmakolojik özelliklerini yazam├╜yor reseptör, eylem tarafından belirlenir. Örneğin, rekabetçi inhibitörleri aynı bağlama cebinizde veya orthosteric sitesi, girebilirsiniz molekülleri şunlardır agonist kendisi bir yarışma neden olur. Sigara rekabetçi inhibitörleri, girebilir ve iyonik gözenek örneğin engellemek, başka bir sitede ve bir ligand kapılı iyon kanalı durumunda etkileşerek reseptörleri inhibe bileşiklerdir. Etkileşim farklı mekanizmaları incelemek için bu işin kapsamı gitmek istiyorum, ama daha fazla bilgi farmakolojik bir ders kitabından ve/veya Bertrand ve Bertrand'ın22gibi diğer işten elde edilebilir.
Allosteric modülatörler söz konusu olduğunda, orthosteric sitesi, ama durum molekülün farklı bir sitede bileşik bağlar enerji bariyeri aktif ve diğer devletler arasında değiştirir. Pozitif allosteric modülatörler (PAMs) enerji bariyeri etkin duruma dinlenme--dan azaltmak bileşiklerdir ve bu nedenle, agonist etkisini artırmak. Olası PAM etkileri tanımlamak için bu, bu nedenle, Eğer bileşik bir maruz agonist yanıtı geliştirir ve eğer öyleyse, hangi konsantrasyon de belirlemek gereklidir. Şekil 11 ve Şekil 14 sunulan deneyler başarıyla GABAA reseptörleri, PAMs karakterizasyonu için kullanılabilir protokolleri göstermektedir.
Bazı durumlarda, tek başına PAM maruz reseptörleri etkinleştirmek yeterli olabilir. Bu tür etkinlikler burada sunulan Deneysel protokol hafif bir değişiklik tarafından belirlenebilir. Yani, modülatör ortak bir uygulama GABA maruz sırasında kullanmak yerine, protokol ilk uygulama için tek başına ve sonra huzurunda GABA bileşik değiştirilebilir. Doğrudan agonist etkinlik karakterizasyonu bileşik tarafından uyarılmış ve GABA uyarılmış geçerli karşılaştırıldığında yanıt genliği tespiti yapılacak.
Şekil 7' de gösterildiği gibi beyin dilimler halinde yapılan deneylerde daha fazla hayvan modellerinde ve klinik karşı yol boyunca gitmeden önce kesin bir inhibitör devre yerel reseptörleri, bileşik faaliyet onaylamak için kullanılır. Nispeten basit veri kayıt ve analiz Protokolü PS genlik fark düzenleyici etkileri değerlendirilerek birden çok bileşikleri sıralamasını sağlar. GABA sisteme ilgili olmayan bileşikler spesifik olmayan etkileri (PS şekil değişiklikleri gözlendiğinde algılananÖrneğin) de kullanabilirsiniz. Doğrudan, GABAergic neurotransmission bu gibi durumlarda bütün hücreli yama klemp tekniği8kullanarak inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs) bileşiklerin etkisi ölçülerek tespit edilebilir.
Disclosures
Yazarlar Frédéric Knoflach ve Maria-Clemencia Hernandez, F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, İsviçre, bir ilaç şirketi çalışanlardır. Yazar Daniel Bertrand HiQScreen Sàrl 6, rte bir çalışandır de ilaç firmaları için tarama imkanları sağlayan Compois, 1222 Vésenaz Cenevre, İsviçre,.
Acknowledgments
Yazarlar Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab ve Marie Claire Pflimlin Roche üzerinden ve Tifany Schaer ve Deborah Paolucci HiQScreen dan onların mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General equipment | |||
| 96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
| Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
| Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
| Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
| Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
| Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
| XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
| Smart Pull | UniPix | - | Electrode Puller |
| RoboInject | MultiChannel Systems | - | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
| HiClamp | MultiChannel Systems | - | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
| DataMining | MultiChannel Systems | - | Data Analysis Software |
| DataMerger | MultiChannel Systems | - | Data Processing Software |
| Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
| CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
| pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
| Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
| Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
| Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
| McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
| Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
| Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
| Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
| Plasticware | |||
| Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
| GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
| 50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
| Shipping tubes 180 mL | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
| Pony vial Polyethylene 6 mL | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
| Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
| Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
| 96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
| 96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
| Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | - | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
| RNA preparation | |||
| Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
| Chemicals | |||
| Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Diazepam 4 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| [3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C | Used for binding assay | ||
| Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
| MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
| AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
| Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
| Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
| EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
| Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
| Membranes | |||
| Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |
References
- Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
- Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
- Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
- Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
- Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
- Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
- Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
- Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
- Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
- Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
- Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
- Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
- Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
- Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
- Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
- Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
- Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).
- Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
- Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
- Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
- Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17 (2004).
