Un metodo non-radio-isotopica non etichettata per correzione di bozze della polimerasi del DNA e un saggio di riparazione del DNA è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF ad alta risoluzione e una strategia di estensione di singolo nucleotide. Il test ha dimostrato di essere molto specifico, semplice, rapida e facile da eseguire per la correzione di bozze e riparare le patch inferiore 9-nucleotidi.
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Articolo metodologico
Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il mantenimento del genoma e suo fedele replica è di primaria importanza per la conservazione di informazioni genetiche. Per valutare la replica ad alta fedeltà, abbiamo sviluppato un semplice non marcato e analisi di spettrometria (MS) per uno studio di correzione di bozze di massa non-radio-isotopica metodo utilizzando un'ionizzazione di matrix-assisted laser desorption con tempo di volo (MALDI-TOF). Qui, una polimerasi del DNA [per esempio, il frammento di Klenow della polimerasi di DNA di Escherichia coli (KF) ho (pol io) in questo studio] in presenza di tutti e quattro i trifosfati dideoxyribonucleotide viene utilizzato per elaborare un duplex non corrispondenti primer-modello. Il primer non corrispondente è quindi esteso Rileggi e sottoposti a MALDI-TOF MS. I prodotti si distinguono per la variazione della massa del primer fino a variazioni di singolo nucleotide. Importante, una correzione di bozze può anche essere determinato per interno singolo disadattamento, seppur alle efficienze diverse. Mancate corrispondenze in posizione 2-4-nucleotidi (nt) dall'estremità 3' sono stati efficacemente corretto da pol io, e una mancata corrispondenza alle 5 nt dal capolinea primer ha mostrato solo una parziale correzione. Nessuna correzione di bozze si è verificato per le mancate corrispondenze interne, situate al 6-9 nt da estremità 3' primer. Questo metodo può essere applicato anche ai test di riparazione del DNA (per esempio, valutare una riparazione di base-lesione dei substrati per la via di riparazione endo V). Primer contenenti 3' penultimo deoxyinosine (dI) lesioni potrebbe essere corretto da pol io. Infatti, penultimo T-I, G-I e A-ho substrati ha avuto loro ultimo 2 nucleotidi contenenti dI asportato da pol io prima di aggiungere un corretta ddN 5'-monofosfato (ddNMP) mentre la penultima C-mi mancate corrispondenze sono state tollerate da pol I, permettendo il primer per essere esteso senza riparazione, che dimostrano che la sensibilità e la risoluzione del MS test per misurare la riparazione del DNA.
Introduzione
Le funzioni di correzione di bozze di polimerasi del DNA durante la replicazione del DNA sono essenziali per garantire l'alta fedeltà dell'informazione genetica che deve essere trasferito alla progenie1,2,3,4, 5,6,7. Essendo in grado di valutare il contributo della polimerasi esonucleasi correzione di bozze sarebbe chiarire i meccanismi di salvaguardia della stabilità genetica.
Etichettatura del radioisotopo e....
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Protocollo
1. primer/template preparazione
- Disegno primer/template con un equilibrato contenuto di G + C tra 40% e 60% come in un sequenziamento o disegno dell'iniettore di PCR. Utilizzare il primer di 18 a 21 nt per un appropriato ricottura e meglio MS segnali.
- Progettazione del modello impostando 50 ° C come il minimo di temperatura per la regione duplex con almeno 7 di fusione nt di 5'-sporgenza per separare i segnali tra il primer e il modello.
Nota: ad esempio, per il substrato P21/T28 nella tabella 1, il primer 21-nt è accoppiato con un modello 28-nt. Opzione: l'uso di acidi nucleici alternativi quali obbligazioni fosforotioato nucle....
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Risultati
Modelli e primer:
Utilizzando la procedura presentata qui, uguale modelli molare oligonucleotide sintetico e primer di rilevanti sequenze ottenute da fonti commerciali sono stati controllati per la loro purezza e qualità (Figura 3A; notare che i segnali abbinato la massa designata e il basso fondo) così come per il rapporto tra l'intensità di picco e la massa di analita (
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Discussione
Questo studio ha descritto una dettagliate analisi di attività correzione di bozze analizzata mediante lo strumento commerciale prescelto (Vedi la Tabella materiali) mediante MALDI-TOF MS. I vantaggi principali sono che il primer e il modello sono etichetta gratuito e facile da eseguire, permettendo una maggiore flessibilità nella progettazione di esperimenti. Un flusso-calce completa elaborazione di 30 correzione test avrebbe preso 4 h, tra cui 3 h per eseguire manualmente la correzione di bozze reazion.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il NCFPB Integrated Core Facility di genomica funzionale (Taipei, Taiwan) e il laboratorio di farmacogenomica NRPB (Taipei, Taiwan) per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca da Taiwan Health Foundation (L-I.L.) e il Ministero della scienza e tecnologia, Taipei, Taiwan, ROC [più 105-2320-B-002-047] per Hu Yao Wei, [più 105-2628-B-002-051-MY3] per Su Kang-Yi e [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] per Lin Liang-In.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Oligonucleotidi | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| Oligonucleotidi modificati fosforotioati | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polimerasi I, grande (Klenow) frammento | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Frammento di Klenow (3'→ 5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Riferimenti
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA....
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Ristampe e permessi
