Summary
교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.
Abstract
게놈의 충실 한 복제의 유지 보존 유전 정보에 대 한 최고 이다. 높은 충실도 복제, 평가 비 라는 간단한 개발 했습니다 하 고 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)와 함께 사용 하 여 라디오 동위-방법 질량 분석 (MS) 교정 연구에 대 한 분석. 여기, DNA 중 합 효소 [예를 들면, 대장균 DNA 중 합 효소의 Klenow 파편 (KF) 나 (폴 나)이 연구에서] 모든 4 개의 dideoxyribonucleotide 된 존재 일치 뇌관-템플릿 이중 처리 하는 데 사용 됩니다. 일치 하지 않는 입문서 다음 교정/확장 하 고 MALDI TOF MS를 받게. 제품은 단일 염기 변이 내려 뇌관의 질량 변화에 의해 구별 된다. 중요 한 것은, 한 교정 또한 확인할 수 있습니다 내부 단일 불일치에 대 한 다른 효율성에도 불구 하 고. 3' 끝에서 2-4-뉴클레오티드 (nt)에 있는 불일치 효율적으로 했다, 폴에 의해 교정 그리고 5에서 불일치 뇌관 종점에서 nt만 부분 수정. 아니 교정 뇌관 3' 끝에서 6-9 nt에 있는 내부 불일치에 대 한 발생 했습니다. 이 메서드는 또한 DNA 수리 분석 실험 (예를 들어, 엔 V 복구 경로 대 한 기판의 기본 병 변 수리 평가)에 적용할 수 있습니다. 뇌관 어 deoxyinosine (디) 병 변 3'를 포함 하는 폴에 의해 해결 될 수 나. 실제로, penultimate T-I, G-나, 그리고 A-나 기판 했다 그들의 마지막 2 디 포함 된 뉴클레오티드 excised 폴에 의해 나는 올바른 ddN 5'-monophosphate (ddNMP)를 추가 하기 전에 어 C 동안-나 불일치는 폴에 의해 용납 했다 나 뇌관 없이 확장 될 수 있도록 수리, 감도 및 해상도 MS의 DNA 복구를 측정 하는 분석 결과 보여주는.
Introduction
DNA 복제 시 DNA polymerases의 교정 기능 자손1,2,3,4,로 전송 하는 유전 정보의 높은 충실도 보장 하기 위해 필수적입니다. 5,,67. 중 합 효소 exonucleases 교정의 기여를 평가 하기 위해 수 있는 유전적 안정성을 보호 하는 메커니즘을 명확히 것.
방사성 표지와 젤 기반 분석 autoradiograms 또는 형광 이미징8,,910 의 densitometric 분석을 함께 전통적으로 DNA의 교정 활동을 탐지 하는 데 사용 되었습니다. polymerases입니다. 기능을 하는 동안 이러한 분석 실험, 비싼, 힘들고 높은 처리량 포맷 하지 의무가 있습니다. 또한, radioisotopes 폐기물 처리 등 안전 문제를 겪고 있습니다. 또는, 교정 활동 fluorometric 기술에 의해 분석 되어 있다. 예를 들어 2-aminopurine (2-AP) 생체 외에서 중 합 효소 분석 실험 생산 형광 신호11,12교정 동안 확장 제품에 통합할 수 있습니다. 2 AP thymine와 시 토 신 쌍 수 이후 불행 하 게도, 이러한 접근 낮은 특이성에서 고통. 더 최근의 접근 프로브를 포함 중요 한 G-quadruplex-기반 발광 스위치에는 중 합 효소에 대 한 중 합 효소의 일부를 극복 하는 분석 결과 교정에 대 한 단독으로 표시 된 형광 프로브로 서 3'-5' exonuclease 분석 결과13 는 상기 단점14. 이러한 fluorometric 방법에 대 한 열정 DNA 기판의 특정 라벨에 대 한 필요 때문에 점감 된다.
반면, DNA 분석을 위한 TOF MALDI MS 뇌관 연장 반응 레이블이 없는 4 ddNTPs와 지정된 로커 스15,,1617 에 동 질 다 상 식별 하 사용 될 수 있는 정밀한 분석 결과에서 고용은 고 돌연변이 탐지에 대 한 임상 응용에 널리 채택 되었습니다 및 암 진단18. 이러한 기본 원칙을 사용 하 여, 우리는 높은 해상도, 높은 특이성 및 MALDI TOF 양 사용 중 의 높은 처리량 잠재력을 악용 하는 활동을 교정 하는 DNA 중 합 효소의 생체 외에서 결정에 대 한 레이블 없는 분석 결과 만든 대장균 DNA 중 합 효소 나 Klenow 모델 효소, dideoxyribonucleotide 된 (ddNTPs)으로 조각 기판 제품을 단일 뉴클레오티드 확장 통해 MALDI TOF MS (그림 1) 후 교정의 "스냅숏" 걸릴 수 있습니다.
마찬가지로,이 방법은 또한이 어디 포함 3' 어 디 병 변 복구 나 폴을 복종 된다 뇌관 시험 어떤 모방도 긁어 V 수리 중간체 DNA 수리 분석 결과 대 한 개발 되었다. 완전히 이해 하는 동안 엔 V도 수리 통로 교정 exonuclease 활동 병 변의 절단19,20대 나는 폴을 알려진 유일한 복구 시스템입니다. 표시 사용 하 여 MALDI TOF MS, 우리는 명확 하 게 정의 된 수리 패치 어디 디 폴에 의해 excised 수 마지막 2에서 발생 하는 경우 나 올바른 보충된 뉴클레오티드를 추가 하기 전에 뇌관의 nt.
교정 및 DNA 복구의 연구를 위해이 방법은 빠르고 덜 이전 방법 보다는 힘이 드는 이며 메커니즘 및 기능으로 추가 정보를 제공 합니다.
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Protocol
1. 뇌관/서식 파일 준비
- 프라이 머/시퀀싱 또는 PCR 뇌관 디자인 60%와 40% 사이 균형된 G + C 함량 된 서식 파일을 디자인 합니다. 18-21의 뇌관을 사용 하 여 적절 한 열 처리 및 더 나은 MS 신호에 대 한 nt.
- 용융 온도 이상 7 이중 지역에 대 한 최소 50 ° C를 설정 하 여 서식 파일을 디자인 뇌관와 템플릿 간의 신호 분리 5'-오버행의 nt.
참고: 예를 들어 기판 P21/T28 표 1에 대 한 21-nt 뇌관은 짝을 28-nt 서식 파일. 옵션: nuclease 저항 phosphorothioate 채권 대체 서식 파일의 3' 끝에 마지막 4 phosphodiester 채권 등 다른 핵 산의 사용 서식 파일 ( 의 일반적인 3' 끝 저하에 의해 가능한 방해를 방지할 수 있습니다. 예를 들어, 표 1에서 T28S4), 비록 서식 파일 준비에 대 한 약간의 비용이 추가 됩니다. - 더 이상 정화 없이 표준 desalted oligonucleotides를 사용 하 여이 연구에 대 한 만족 이다. 주식으로 pmol 100 µ H2O/L의 농도에서 oligonucleotide 뇌관/서식 파일을 사용 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다 oligonucleotides 독특한 피크 신호 및 좋은 신호 대 잡음 비 MALDI TOF MS (4-7 단계) 실행 하 여 품질 및 뇌관 및 서식 파일의 순도 확인 합니다.
- 교정 및 농도 정규화 (그림 2)에 대 한 반응에 관련 시퀀스의 동등 어 금 니 뇌관의 상대 MALDI TOF MS 신호 강도 (7 단계)를 결정 합니다.
2. 반응 교정
참고: 동일한 교정 반응 조건 및 프로토콜 A의 DNA 복구에 적용 됩니다-난, G-I, C-, 및 T-나.
- 예를 들어 표 1 에서 교정에 대 한 기판 P21/T28의 불일치를 T-G를 사용 하 여, 희석 뇌관 P21 및 템플릿을 T28 µ L pmol 12.5/H2O; 그런 다음 멸 균된 microcentrifuge 1.5 mL 튜브 희석된 뇌관의 12 µ L와 12 µ L 희석된 서식 파일의 전송.
참고: 템플릿/뇌관 믹스의 금액은 2 반응;에 대 한 충분 한 따라는 시 약의 볼륨을 증가 비례 여러 반응에 대 한. - 튜브를 단단히 닫습니다. 대상된 65 ° C 물 목욕, 37 ° C 물 욕조에 30 분 뒤에 30 분 동안 품 어 그리고 마지막으로 적절 한 어 닐 링을 보장 하기 위해 얼음에.
- 멸 균된 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 뇌관의 8 µ L을 추가 하 고 템플릿 믹스 (50 pmol), 교정 반응 버퍼, 4 ddNTPs 믹스 (각 4 dNTPs의 2 m m), 및 H2O 18 µ L.까지 4 µ L x 10의 2 µ L를 섞어 튜브 영화.
참고: 1 x 교정 반응 버퍼에 50 mM NaCl, 10 m m MgCl2, 1 m m dithiothreitol, 및 10 mM Tris HCl (25 ° C에서 pH 7.9)가 포함 되어 있습니다. 10x 반응 버퍼 교정의 상용 소스에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 각 ddNTP는 반응에서의 최종 농도 0.1 m m 이다. - 원하는 농도에 반응 버퍼 교정 x 얼음 1에 DNA 중 합 효소를 희석 [예를 들어, microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 반응 버퍼 및 상업적인 소스에서 5 U Klenow 중 합 효소의 1 µ L 교정 x 1의 4 µ L을 추가 (테이블의 Materials)]. 모든 시간에 얼음에 희석된 효소를 저장 합니다.
참고: 희석된 DNA 중 합 효소의 양 만으로는 2 반응; 비례에 따라 효소의 볼륨을 증가 여러 반응에 대 한. Klenow 중 합 효소의 2.0 단위를 포함 하는 2.0 µ L의 볼륨의 T-G 터미널 일치 P21/T28 5 분에 50 pmol의 절반 이상을 교정 수 있습니다. - 2.3 단계에서 원하는 반응 온도 (예를 들어, 일반적으로 37 ° C Klenow 중 합 효소 및 T4 DNA 중 합 효소에 대 한 25 ° C) 기판 믹스와 함께 microcentrifuge 튜브를 prewarm. Prewarmed 기판 혼합물에 단계 2.4에서에서 2.0 µ L 희석된 DNA 중 합 효소의 전송 그리고 그 내용을 혼합 튜브 영화.
- 반응의 구성 요소를 회전 하는 주위 온도에 3200 x g에서 몇 초 동안 효소와 기질 튜브 원심. 즉시 전송 난방 블록 또는 단계 2.5에서 원하는 외피 온도에 물 욕조에 반응.
-
반응 종료
- 버퍼링 된 페 놀의 동등한 볼륨을 추가 하 고 몇 초 동안 그것을 vortexing에 의해 혼합 5 분 주위 온도에 3200 x g에서 microcentrifuge에서 원심.
- 수성 단계 깨끗 한 microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가, 몇 초 동안 원심 분리기에 깨끗 한 microfuge 관을 3 분에 대 한 주위 온도에 3200 x g에서 microfuge에 수성 단계 전송 vortexing에 의해 혼합 cubate; 5 분 동안 95 ° C에서 다음 얼음에 그것을 장소.
주의: 페 놀과 클로 프롬은 유해 화학 물질입니다. 처리 및 폐기물 처리 제도 규정을 따라야 한다.
- 수성 단계 깨끗 한 microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가, 몇 초 동안 원심 분리기에 깨끗 한 microfuge 관을 3 분에 대 한 주위 온도에 3200 x g에서 microfuge에 수성 단계 전송 vortexing에 의해 혼합 cubate; 5 분 동안 95 ° C에서 다음 얼음에 그것을 장소.
- 또는 사용 하는 프로토콜을 냉각 하는 산. 이 위해 6 분 동안 얼음에 반응을 중지 후 1 M diethanolamine (마약)을 반응 혼합물의 pH를 중화 하 고 5 분; 95 ° C에서 그것을 품 어의 0.64 µ L을 추가 1 M HCl의 2 µ L를 추가 다음 얼음에 그것을 장소.
- 버퍼링 된 페 놀의 동등한 볼륨을 추가 하 고 몇 초 동안 그것을 vortexing에 의해 혼합 5 분 주위 온도에 3200 x g에서 microcentrifuge에서 원심.
3. 수 지 뿐만 아니라 소금 오염 제거
- 상용 담 수 지 국자를 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조), 384-보조 개, 6 mg 수 지 시료 접시의 보조 개를 충당 하기 위해 충분 한 수 지.
- 수 지 모든 보조 개에 걸쳐 균등 (6 mg/보조 개) 접시의 위쪽에 된다고 하 여. 어떤 과잉 수 지를 복구 하 고 병에 합니다.
- 384-잘 접시 microfuge 관에서 2.7 단계에서 최종 반응 제품을 전송. 16 µ L H2O 각 잘에서 최종 반응 제품을 희석 하 고 접시 인감 모든 거품을 제거 하는 그것을 원심의 분배.
- 물개를 제거, 수 지 가득 보조 개 접시를 거꾸로 반응 제품 384-잘 접시.
- 우물-보조 번호판 샌드위치를 뒤집어 고 주의깊게 384-잘 접시에 수 지 (384-잘 접시 수 지 가득 보조 개 접시에 금속 말뚝에 대 한 플러시 되었는지 수).
- 위에 보조 플레이트를 제거, 반응 제품의 혼합물을 포함 하는 384-잘 접시 인감 및 수 지, 잠시 모든 거품을 제거 하 고 그 내용을 담 대 한 실내 온도에 적어도 15 분 동안 회전에 3200 x g에서 원심.
- 수 지 정리 후 원심 우물의 바닥에 수 지를 압축 하려면 5 분 동안 3200 x g에서 384-잘 접시.
4. 전송 반응 제품 매트릭스 칩을
- Nanoliter 디스펜서에 샘플 접시를 설정 (nanodispenser, 테이블의 자료를 참조).
- 넣어 매트릭스 칩 ( 테이블의 자료참조)와 해당 트레이에 섹션 3.7에서에서 384-잘 접시.
- 칩; 반응 제품 자리를 nanodispenser 운영 시작 하는 nanodispenser의 터치 스크린에 실행 버튼을 눌러.
- 확인 채도 정보를 칩에 전체 목격된 볼륨을 보장 하기 위해 화면에 포함 된 샘플 명소의 자동화 된 캡처된 이미지 주위 5-10 nL. 볼륨이 충분 하지 않으면 샘플 안보 반복 합니다.
5. 설치 질량 분석에 분석 결과 정보
- .Xls 형식 가져오기에 대 한 예상된 신호 정보를 포함 하는 파일을 준비 합니다. 예를 들어 2, 3, 4 단계에서 P21/T28의 교정 반응에 대 한 "P21_T28.xls" (표 2)의 설정을 사용 합니다.
- 만들고 응용 프로그램에서 정의 하는 새로운 분석 결과 ( 재료의 표참조)으로 디자이너 형식에서 가져오기 분석 결과 그룹 을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 (예를 들어, "P21_T28.xls" 단계 5.1에서에서).xls 파일 선택.
- 나무의 상단을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 파일 이름을 여는 대상 분석 결과 판 트리를 통해 고객: 프로젝트: 플레이트 옵션 화면의 왼쪽에 설정 (예를 들어, "CTT20171201" 분석 결과 코드와 날짜 나타냅니다).
- 384-잘 접시 유형을 선택 하 고 눌러 확인; 빈 접시를 나타납니다.
- 스크린의 왼쪽에 (예를 들어, P21_T28)에 적절 한 분석 결과 선택 합니다.
- 잘 강조 하 고 추가 플렉스를 선택 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 칩 샘플 위치를 발견 하는 각 샘플에 대 한 (예, P21_T28) 선택 된 분석 결과 할당 합니다.
- (예를 들어, 표 3의 1201.xlsx) 아니 헤더와.xlsx 형식에서 칩에 모든 테스트 작업 목록을 준비 합니다. 작업 목록 옵션을 통해 추가 새 샘플 프로젝트 를 가져옵니다.
- P21_T28 분석 결과의 각 위치에 (예를 들어, 1201.xlsx에서) 작업 목록에 테스트를 할당 하 고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 선택 합니다.
6. MALDI TOF MS 가동
- 응용 프로그램을 사용 하 여 칩을 질량 분석기를 연결 ( 재료의 표참조).
- 화면 오른쪽에서 기본 설정을 선택 합니다.
- 분석 결과 이름 단계의 5.3 (예, CTT20171201), 칩, 칩의 ID와 설정을 저장.
- MS 제어 프로그램을 시작 ( 재료의 표참조).
- In/Out 버튼 누르고 스카우트 접시를 꺼내. 스카우트 접시에 4.4 단계에서 발견된 칩 놓고 질량 분석기를 입력 발견된 칩에 대 한 In/Out 버튼을 누르십시오.
- 응용 프로그램의 인식 버튼을 클릭 ( 재료의 표참조) 질량 분석을 시작 하 고 데이터를.
7. 데이터 분석
- 데이터 분석을 위한 프로그램 ( 재료의 표참조).
- 왼쪽된 상단에 데이터베이스 트리를 단계 6.3에서에서 칩 ID를 선택 합니다. 스크린의 오른쪽에 데이터 파일을 엽니다.
- 질량 스펙트럼을 표시 하려면 스펙트럼 아이콘을 클릭 합니다. 특정 범위의 m/z를 자르려면, 사용자 지정 대화 상자를 선택 하 고 새 창에서 클릭 x 축 에 원하는 위와 더 낮은 제한을 설정 하 고 스펙트럼의 지정된 된 범위를 표시 하려면 확인 을 누릅니다을 마우스 오른쪽 단추로.
- 수출을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 유지 하는 기록에 대 한 스펙트럼을 내보냅니다.
참고: 컴퓨터 화면에 데이터 검사에 대 한 합리적인 크기는 1600 폭/1200 단위의 규모를 사용 하 여.- JPEG 파일 형식을 선택 대상에 클릭 합니다, 그리고 찾아보기 디스크 (예를 들어, 플래시 디스크 e:), 파일 이름을 입력 합니다 (예를 들어, 1201-1.jpg), 선택한 내보내기클릭.
- 데이터 정량에 대 한 커서를 사용 하 고 피크 피크 높이 왼쪽 상단에 표시 클릭 합니다.
- 또는 내보낸된 JPEG 파일을 인쇄 하 고 수동으로 통치자와 피크 높이 측정.
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Representative Results
서식 파일 및 뇌관:
제시 하는 절차를 사용 하 여 여기, 어 금 니 합성 oligonucleotide 서식 파일이 고 상업적인 소스에서 얻은 관련 시퀀스의 뇌관 그들의 순수성 및 (그림 3A; 참고 지정된 질량을 일치 하는 신호 품질에 대 한 확인 그리고 낮은 배경) 뿐만 아니라 피크 강도와 실정이 질량 (그림 2A) 사이의 관계에 대 한로. 피크 높이 및 측정 했다 MS 데이터 정규화에 대 한 (그림 2B)를 계산 합니다.
반응 조건 및 질량 스펙트럼:
단일 기본 뇌관 연장 반응 유전형 MALDI TOF MS와 결합의 사용 이전 표준 ddNTPs 종결자17를 사용 하 여 실현 되도록 표시 되었습니다. 표준 ddNTPs를 사용 하 여 교정 분석 결과 유전형의 singleplex 반응에 유사 하지만 훨씬 간단 하 고 깨끗 하 고 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 실행 하기 매우 쉬운.
MS 스펙트럼 적용 뇌관 및 템플릿 (그림 3)에서 발생 하는 모든 신호. 뇌관 및 서식 파일의 적절 한 디자인 서식 파일을 (그림 3) 프라이 머 잘 분리 된 신호 프로 파일 생성. M/z 값에 따라 템플릿 및 그들의 일반적인 부분 저하 제품 (m/z > 7000)에서 신호 잘 일치 하지 않는 뇌관에서 분리 하 고 교정 제품 (m/z < 7000 그림 3). 필요한 경우 대체 서식 파일 (표 1;의 3' 끝에 마지막 4 phosphodiester 채권 채권 nuclease 저항 phosphorothioate를 소개 T28S4/P21) 일반적인 템플릿 가수분해 (그림 3G; d27)을 줄일 수 있습니다.
DNTPs의 부재, KF는 강력한 3'-exonuclease 있으며 뇌관 그리고21 생체 외에서서식 파일의 수 있습니다. 기본 4 dNTPs 처럼 4 ddNTPs의 추가 KF (그림 3C 와 3E)에 의해 3' 끝 저하를 방지할 수 있습니다. 마찬가지로, 3'-끝의 한 뉴클레오티드 확장 뇌관에 증가 한 안정성을 추가합니다. 유류를 사용 하 여 이전 조건 교정 설명한20 10 U (46 pmol) KF, 이상의 50 pmol 불일치 기판의 80%는 5 분 (그림 3C, 3E및 3 세대)에 수정 했다.
중간체 및 메커니즘 분석:
MALDI TOF MS 해상도 1 달 튼;으로 벌금으로 수 있습니다. 실제로, 모든 기판, 제품 및 중간체와 반응에서 질량 변화는 선택한 범위의 같은 MS 스펙트럼에서 해결할 수 있습니다. 예를 들어 터미널 T G 불일치는 뇌관에 일치 하지 않는 G만 32의 m/z 차이와 ddA의 설립과 함께 수정 되었습니다. 이러한 m/z 차이 5000에서 7000 (그림 4A)는 m/z 범위에서 MS 스펙트럼에 쉽게 식별할 수 있습니다. 각 개별 신호 변경 일치 뇌관, 절단 중간체에서 모든 신호를 합산 하 여 산출 될 수 있다 고 교정 100% 제품. 예를 들어 T-G 교정 반응에서 절단 제품 기준으로 수정 된 제품 5 분 17% 대 23%, 10 분, 18% 대 31%와 69% 14% 대 20 분 (그림 4A)를 했다.
때 어 T-G 불일치 뇌관, 마지막 2에에서 존재 하는 nt ddA 추가 수정 완료 뒤 excised 해야 합니다. 실제로, 올바른 제품 시간 5 분에서 12%, 28%에서 10 분, 20 분 반응의 45% 증가. 또한, 두 가지 형태의 어 T G 교정, 1-nt 절단 중급 및 2-nt 절단 제품에 대 한 절단 제품 쉽게 확인 (그림 4B) 했다.
단일 dNTP와 교정 활동:
대장균 DNA pol 위해 I, ddNTPs 적합 기판 되지 않습니다 및 억제제22로 간주 되어야 합니다. 또는 교정 반응에서 단일 '올바른' dNTP를 사용 하 여 대신 또한 하지 않는다 일반적인 3'-5' exonuclease 활동 및 적합 한 MS 분석 (그림 5B) 단일 뉴클레오티드 확장 제품의 생성. 단일 dCTP를 포함 하는 반응에서 얻은 교정 속도 (그림 5A, 5B, 5c) 4 ddNTPs를 포함 하는 반응 보다 약 2 배 높은 수준 이다. 따라서, 단일 '올바른' dNTP 교정 분석 결과에서 사용 하 여 ddNTPs의 억제 효과 없이 더 나은 결과 생성합니다. 이 이렇게 교정 운동 분석에 대 한 더 큰 감도 제공 해야 합니다.
내부 불일치의 교정:
MS 교정 내부 불일치 및 교정된 제품의 식별은 간단 대 한 KF를 사용 하 여 분석 (즉, 교정 exonuclease 뇌관의 내부 불일치에 3' 끝에서 뉴클레오티드 excises), 뒤에 절단 제품을 통해 중 합 효소 기능 생성을 일치 ddNMP의 추가 제품 뇌관 기판 (그림 6) 보다 짧은 교정. KF 마지막, penultimate, 3rd 및 뇌관 (그림 6;의 3' 끝에서 4번째 뉴클레오티드에 불일치를 교정 하는 곳에 효율적으로 교정 하는 효율성의 명확한 추세 관찰 되었다 MM1, 2, 3 및 4). 5에서 불일치 nt 3' 뇌관의 끝에서의 불일치, < 15%와 (그림6; 교정 하지 않고 확장을 보여주었다 뇌관의 > 15% 부분적으로 수정 했다 MM5)입니다. KF 6, 7, 8, 및 9에 위치 하는 불일치를 교정 하지 못했습니다 뇌관 (그림 6;의 3' 끝에서 nt MM6, 7, 8, 및 9) 하지만 여전히 기판 (그림 6;의 상당한 비율을 확장 MM6, PE 7, 8, 및 9).
Deoxyinosine 병 변의 복구:
대장균에서 deoxyinosine DNA에 주로 엔 V도 수리 통로20,23처리 됩니다. 엔도 V 3' 디 병 변의 두 번째 phosphodiester 본드에는 절 개 하 여 반응을 시작합니다. 생성 된 스트랜드 휴식 pol 사용할으로 후속 병 변의 절단 및 DNA resynthesis24에 대 한 나. 이 절차는 폴 디 3' 어 사이트 (표 1;에 포함 하는 기판 수리 테스트에 적용 된 -I, C-I, G-, 및 T-나)이이 가설을 확인 하기 위해. 3' 어 디의 복구는 어 T-G 불일치 (그림 4B와 6;의 교정 MM2 항목)는 마지막 2 nt 해야 뒤에 복구를 완료 하려면 올바른 ddNMP의 제거. MS 패턴 명확 하 게 A의 heteroduplexes 수정 pol 보였다-I, G-, 및 T-난, 다른 효율성 (그림 7;와 RP 신호)입니다. 그러나, C-나 기판 수리 폴 내 화물은 (표 1 및 그림 7D 와 7E; 매우 낮은 RP)와 훌륭한 범위 (그림 7D; 뇌관 연장 PE 신호)입니다.
그림 1 . 분석 결과 교정에 대 한 시스템 모델. 일치 하지 않는 뇌관 터미널 불일치 (굵게)를 형성 하는 서식 파일에 표시 된 대로 단련 했다. DNA 중 합 효소의 exonuclease 교정 감지 하 고 절단 하는 제품을 형성 하는 일치 하지 않는 뉴클레오티드를 제거 것입니다. DNA 중 합 효소, 4 개의 ddNTPs의 절단 제품 단일 자료 이전 일치 하지 않는 사이트를 보완 하 여 확장 됩니다. MALDI TOF를 때, 일치 하지 않는 뇌관, 절단 제품 및 교정된 제품 질량에 차이 해결할 수 있습니다. (이 수치는 수 외. 에서 적응 25 허가 함께입니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 피크와 oligonucleotide 미사 24 17에서 8 oligonucleotides T28의 3' 끝에 보완 시퀀스와 nt (표 1) 테스트 되었습니다. (A) A 혼합물 각 oligonucleotide 40 µ L 솔루션에서의 50 pmol의 MS 분석을 복종 되었다. (B) 17의 피크 높이 nt는 계산에 대 한 100%로 사용 되었다. 각 oligonucleotide 상대적 신호 강도 6 결정의 평균 이었고 오차 막대 1 표준 편차를 나타냅니다. (이 수치는 수 외. 에서 적응 25 허가 함께입니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 다양 한 템플릿 디자인의 효과. 교정 반응은 형성 하는 다른 템플릿 사용 하 여 터미널 T G 불일치 P21 뇌관으로 평가 됐다. 교정 시험 50 pmol 기판, 그리고 5 분 (A)이이 패널에 대 한 37 ° C에서 4 ddNTPs 보여준다 효소 없이 P21/T32 T-G 기판 10 U (43 pmol) Klenow 중 합 효소, 수행 했다. (B)이이 패널 P21/T32 T A 기판의 뇌관 연장 하 여 보여줍니다 3' exonuclease 불충분 Klenow. PE = 뇌관 확장 제품. (C)이이 패널 P21/T32 T-G 기판의 교정을 보여줍니다. PP = 교정 제품; d26, d27, d28 = 3' 끝 저하 템플릿. (D)이이 패널 효소 없이 P21/T28 T-G 기질을 보여줍니다. (E)이이 패널 P21/T28 T-G 기판의 교정을 보여줍니다. PP = 교정 제품; d26, d27 = 3' 끝 저하 템플릿. (F)이이 패널 효소 없이 P21/T28S4 T-G 기질을 보여줍니다. (G)이이 패널 P21/T28S4 T-G 기판의 교정을 보여줍니다. PP = 교정 제품; EP = 절단 제품; d27 템플릿 저하 부산물을 =. (이 수치는 수 외. 에서 적응 25 허가 함께)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 절단 및 교정 제품에 대 한 과정 분석 시간. 2 U 교정 분석 수행 (8.6 pmol) KF와 50 pmol 기판으로는 프로토콜에서 설명. 반응 했다 침묵에 제시 된 시간. (A)이이 패널 표시 3' 터미널 T G 불일치;의 교정 EP = 교정 절단 제품; d18 / d19 초과 절단 부산물; = PP = 교정 제품; P21 = 일치 뇌관. (B)이이 패널 표시 3'-penultimate T-G 불일치;의 교정 EI-1 = 절단 중간; EP-2 = 교정 절단 제품; d18 초과 절단 부산물; = PP = 교정 제품; P21 = 일치 뇌관; Na 나트륨 이온 바인딩 뉴클레오티드 =. (이 수치는 수 외. 에서 적응 25 허가 함께입니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 4 ddNTPs와 반응 교정 대 단일 dNTP. 0.1 U와 교정 분석 수행 (0.43 pmol) KF와 50 pmol 기판으로는 프로토콜에서 설명. 반응 했다 침묵에 제시 된 시간. (A)이이 패널 표시 3' 터미널 G G 불일치의 4 ddNTPs;와 교정 EP = 교정 절단 제품; PP = 교정 resynthesis 제품; P21G = 일치 뇌관. (B)이이 패널 표시는 3' 터미널 G G와 불일치 dCTP;의 교정 PP = 교정 resynthesis 제품; P21G = 일치 뇌관. (C)는 정정 수준 3 결정의 평균 이며 오차 막대 1 표준 편차를 나타냅니다. 나+ = 나트륨 이온 바인딩 뉴클레오티드. (이 수치는 수 외. 에서 적응 25 허가 함께입니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 내부 불일치의 교정. 교정 분석 실험 프로토콜에 설명 된 대로 2 U (8.6 pmol) Klenow 중 합 효소와 20 분 동안 37 ° C에서 50 pmol 기판 수행 했다. 빈 MM1 기판의 효소 빈 =. MM1 = P21/T28 T-G 기판; MM9 MM2 = 기판 내부 불일치와 숫자 3' 끝을 기준으로 불일치 위치를 나타냅니다. P21 = 일치 뇌관; PR = 교정된 제품; PE = 확장된 뇌관; d19와 d20 = 초과 절단 부산물, 숫자는 뉴클레오티드의 크기를 나타냅니다. (이 수치는 수 외. 에서 적응 25 허가 함께입니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 . 3' 어 deoxyinosine 장애의 수리. 2.3 프로토콜 단계에 설명 된 대로 2 U Klenow 중 합 효소와 37 ° C에서 50 pmol 기판 수리 분석 수행 했다. 반응 했다 침묵에 제시 된 시간. 이러한 패널 표시 (A) T와 반응-나 기판; (B) G-나 기판; (C) A-나 기판; 그리고 (D) C-나 기판. RP = 수리 제품; EP = 절단 제품; PE 뇌관 확장 제품, 나+ = = 나트륨 이온 adducts. T (E)는 수정 수준을-I, G-나, 그리고 A-3 결정의 평균 되었고 오차 막대 1 표준 편차를 나타냅니다. C에 대 한 보정 수준-2 결정의 평균 했다. (이 수치는 수 외. 에서 적응 25 허가 함께입니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 기판 | 시퀀스 | 보정 효율 (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17.3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18.4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22.9 | |
| MM1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16.9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-난 | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-난 | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-난 | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15.4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-나 | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16.6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
표 1입니다. Klenow 파편에 의해 기판 및 보정 효율 교정. 이 표에서 3'-끝에 phosphorothioate 수정 포함 된 서식 파일의 대담한 4-뉴클레오티드를 보여줍니다. 일치 하지 않는 기본적인 쌍 대담한에 있다입니다. 2 U (8.6 pmol) Klenow 중 합 효소, 50 pmol 기판, 및 10 분에 대 한 37 ° C에서 4 ddNTPs 교정 분석 수행 *이 값은 배경 잡음 방지의 < 1%의 정확한 견적 때문에 교정 수준에 대 한 낮은 한계는 총 질량 신호 관찰입니다. (이 수치는 수 외. 에서 적응 25 허가 함께입니다.)
| 잘 | 용어 | SNP_ID | 2-PCRP | 1-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | Tm | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
표 2입니다. T28_P21.xlsx 파일입니다. 설정 그림 3D와 3E, 4A, 5A사용 되었다.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
테이블 3입니다. 1201.xlsx 파일입니다. 설정 그림 4A에 7 반응을 위해 사용 되었다.
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Discussion
이 연구는 선택한 상업 계기에 의해 분석 단계별 교정 활동 분석 결과 설명 ( 테이블의 자료를 참조) MALDI TOF MS를 사용 하 여. 주요 장점 포함 뇌관 및 템플릿 레이블 무료로 쉽게 수행 하는 실험 설계에서 더 큰 유연성을 허용 합니다. 스트림-석 회 완전 한 테스트를 교정 하는 30의 처리 등 수동으로 교정 반응을 수행 하기 위한 3 h 4 h 고 MALDI TOF MS 분석 위에서 언급 한 프로토콜을 사용 하 여 그들의 정리를 완료 하려면 1 시간 걸립니다. 이 방법의 주요 단점 분석 결과에 필요한 기판의 금액입니다. 강한 신호 및 일관 된 결과 얻으려면, 우리 20 µ L 반응; 50 pmol DNA 기판의 사용 따라서, DNA의 크기는 방사선 DNA 실험8,,910보다 훨씬 높다. 볼륨 및 샘플 크기를 줄이고 MS 작업 튜닝 필요한 기판의 양을 낮출 수 있습니다.
상업적인 소스에서 얻은 합성 oligonucleotides 더 이상 정화 또는 치료 하지 않고 직접 교정 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 MALDI TOF MS에 의해 DNA의 품질과 순도 확인 하는 것이 좋습니다. Phosphorothioate 채권 샘플 당 더 높은 비용에도 불구 하 고 템플릿 스트랜드 (그림 3) 일반적인 저하를 줄이기 위해 템플릿 (표 1)의 3' 끝에 지난 4 phosphodiester 채권을 대체 하기 위하여 소개 되었다. 흥미롭게도, 서식 파일 및 뇌관 DNA에서 신호 분리 될 수 있다 잘 MS에 의해 크기;에서 그들의 다름의 덕택으로 따라서, phosphorothioate 수정이 필요 하지 않습니다. 그림 3E, 예를 들어 뇌관 P21 연장 교정 절단 및 resynthesis의 모든 가능한 제품 했다 미만 22 nt (m/z < 7000) T28 템플릿에서 모든 저하 조각 동안에 24 보다 큰 했다 nt (m/z > 7000 ). 그림 4A 에 결과 동일한 P21/T28 이중 그림 3E에 그 설정에서 했다. M/z 6000-7000의 확대 창만 신호 템플릿에서 신호 어떤 혼동 없이 뇌관 DNA에서 보여줍니다.
DdNMP 확장명이 뇌관을 사용 하 여 전략을 매우 안정 입증 되며, 따라서, ddNMP 포함 제품 교정 분석 결과 대 한 좋은 지표. DdNMP 절단 제품의 추가 수 ' 동결 ' 분석에 대 한 상태에서 교정 제품 즉시 후 절단. 또는 교정 exonuclease의 일반적인 가수분해 활동을 억제 하기 위해 4 ddNTPs 대신 단일 올바른 dNTP (그림 5B)를 사용 하 여 가능한 또한 이다.
표준 페 놀/클로 프롬 적 출 절차와 반응을 중지 입증 반응 종료에 대 한 최고의 수단 이후 한 단계에서 반응 단백질 간섭 제거 하는 동안 중지 될 수 있습니다. 또는,는 자동화, 의무가 아닌 금속 단계 분리 없이 알칼리에 의해 무력화 후, 냉각 하 고, 산 성 또한 신뢰할 수 있는 결과 설명 했다. 나트륨 이온 (Na+ 그림 4, 5, 및 7) adducts는 관심사 때문에 그들은 수 증가 배경 신호 차별을 복잡 하 게. 깨끗 한 수 지의 적절 한 사용은 이러한 간섭;를 줄일 수 있습니다. 아직, 심지어 adducts 같은 존재, 그들은 일반적으로 그들의 부모-신호, 상대적으로 훨씬 더 작은 봉우리를가지고 있으며 (그림 4, 5및 7) 그들 사이 구별 하는 것이 속성을 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 나트륨의 피크 높이 adducts 주요 봉우리;에 비례 했다 포함 또는 제외 나트륨에 adducts 계산 크게 미치지 않았다 정량화 결과. 따라서, 정량화, 사용 했습니다 주요 피크 높이 계산에만.
교정 실험 설명 여기를 이용 했다 내부 불일치는 exonuclease의 중요성을 설명 하기 위해 도메인 파티션 분석 결과 KF26 및 상세한 DNA 중 합 효소의 나 효율적으로에서 불일치를 교정 하는 기능을 4 뇌관 3'-끝에서 (그림 5, MM1-4) 뇌관 템플릿 접속점27에 기본 쌍 안정성으로 인해 상류 nt. 또한,이 연구 또한 폴 엔 V 긁어 수리 중간체의 수리 공부 뇌관 어 deoxyinosine 병 변 포함를 사용. 결과 보여주었다 그 T-A 보다 더 효율적으로 수리-I 및 G-난; 그러나, C-내 화물 유류 나 복구 되었다 (표 1 및 그림 7). 이러한 결과 MALDI TOF MS 분석 교정과 다양 한 짧은 패치에 대 한 매우 유용한 수 확인 DNA 수리 분석 실험28 의 높은 해상도 때문.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 NCFPB 통합 핵심 시설 기능 유전체학 (타이페이, 대만)와 그들의 기술 지원에 대 한 NRPB Pharmacogenomics 연구소 (타이페이, 대만). 이 작품에서 대만 건강 재단 (L-I.L.) 사역의 과학 및 기술, 타이 페이, 대만, ROC [가장 105-2320-B-002-047] 웨이 야 오 주석, 연구 보조금에 의해 지원 되었다 [가장 105-2628-B-002-051-MY3] 강이 수, 및 [ MOST-105-2320-B-002-051-MY3] 회담에 린에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
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