Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das live Cell Imaging von TGF-β/Smad3 Signalisierung Aktivität mit einem Adenovirus-Reporter-System. Dieses System verfolgt transkriptionelle Aktivität in Echtzeit und kann angewendet werden, um sowohl einzelne Zellen in Vitro und in lebenden TierenModelle.
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Methodenartikel
Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Transforming Growth Factor β (TGF-β) Signalisierung regelt viele wichtige Funktionen, die für die zelluläre Homöostase erforderlich und wird im allgemeinen gefunden in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs überexprimiert. TGF-β ist stark in Metastasen während späten Stadium Krebs Fortschreiten, impliziert eine Teilmenge der Zugvögel und invasive Tumorzellen zu aktivieren. Aktuelle Methoden zur Signalisierung Pathway Analyse konzentrieren sich auf Endpunkt-Modelle, die oft versuchen, Signalisierung Post-hoc- des biologischen Ereignisses zu messen und spiegeln nicht die progressive Natur der Krankheit. Hier zeigen wir eine neuartige Adenovirus Reporter System speziell für die TGF-β/Smad3 Signalweg, die transkriptionelle Aktivierung in lebenden Zellen erkennen kann. Mit Hilfe eines Ad-CAGA12-Td-Tom -Reporter, erreichen wir eine 100 %-Infektionsrate von MDA-MB-231 Zellen innerhalb von 24 h in Vitro. Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter ermöglicht für die Darstellung von live Einzelzellen in Echtzeit mit direkten Identifizierung von transcriptionally aktiven Zellen. Stimulation der infizierten Zellen mit TGF-β zeigt nur einen Teil der Zellen, die transcriptionally aktiv und spezifischen biologischen Funktionen beteiligt sind. Dieser Ansatz ermöglicht hohe Spezifität und Sensitivität auf eine einzelne Zellenebene das Verständnis biologischer Funktionen im Zusammenhang mit TGF-β Signalisierung in Vitrozu fördern. Smad3 transkriptionelle Aktivität auch kann berichtet in Vivo in Echtzeit durch die Anwendung eine Ad-CAGA12- Luc Reporter. Ad-CAGA12- Luc in der gleichen Weise wie herkömmliche stabil transfizierten Luciferase-Zell-Linien gemessen werden. Smad3 transkriptionelle Aktivität der implantierten Zellen in Vivo werden durch konventionelle IVIS Bildgebung analysiert und live während der Tumorprogression, einzigartige Einblicke in die Dynamik der TGF-β-Signalweg überwacht. Unser Protokoll beschreibt eine vorteilhafte Reporter-Delivery-System ermöglicht schnelle Hochdurchsatz-Bildgebung live Zelle Signalwege in Vitro und in Vivo. Diese Methode kann zu einer Reihe von bildbasierte Assays und Geschenke als sensibel und reproduzierbare Ansatz für grundlegende Biologie und therapeutische Entwicklung erweitert werden.
Einleitung
Transforming Growth Factor β (TGF-β) ist eine wesentliche Zytokin verwickelt in der menschlichen Entwicklung, das signalisiert durch ein heterodimerisierenden Komplex bestehend aus Typ II und Typ-I-Rezeptoren1. Bindung an II Rezeptor Typ Ergebnisse bei der Rekrutierung und Phosphorylierung von Typ I-Rezeptor, der wiederum nachgelagerten Smad2/3 Proteine2,3phosphorylates. Diese aktiviert Smad2/3 Proteine binden an Smad4, bilden einen Komplex, der translocates in den Zellkern und reguliert gen Transkription4. Homöostatische Bedingungen TGF-β/Smad-Signalisierung ist....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden von der University of Melbourne-Tier-Ethik-Kommission genehmigt.
Hinweis: Die Sequenz, Bau und Generation Protokoll für die adenovirale Vektoren pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP und pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom schon zuvor beschriebenen11,12, 13. Alle Vektoren sind im Handel erhältlich.
1. Virus-Titer-Bestimmung mit 50 % Gewebekultur infektiöse Dosis (TCID50)
- Bereiten Sie 1 x 106 HEK293A Zellen in 10 mL DMEM + 10 % FBS Medien.
- ....
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Ergebnisse
Einzelne Zelle in Vitro imaging zu leben
Um die Aktivierung von TGF-β/Smad-Signalisierung in Einzelzellen mit Adenoviren basierte Reagenzien genau zu beurteilen, ist es wichtig, zunächst die optimale Multiplizität der Infektion (MOI) für jede Zelllinie zu bestimmen. Die optimale MOI wird bestimmt, wenn 100 % der Zellen für adenovirale Infektion ohne vorliegende zytopathischen oder zytotoxische Effekte positiv sind. Um dies.......
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Diskussion
Wir entwickelten eine Technik, um Echtzeit-Bildgebung der TGF-β/Smad3 Signalisierung im einzigen lebenden Zellen zu ermöglichen. Mit dieser neuartigen Methode haben wir zuvor eine Subpopulation von Zellen mit dynamischen TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität identifiziert, die mit verstärkten Invasion und Migration8verbunden war. Diese Methode verbessert auf traditionelle Assays für die TGF-β-Signalisierung, wie westliche Flecken der Smad3 Phosphorylierung und TGF-β gezielt Genexpression, durch .......
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Offenlegungen
Die Autoren Berichten keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council (NHMRC), H-JZ. TMBW ist ein Empfänger von Australien Postgraduate Award der australischen Regierung und der Ann Henderson Top-up Stipendium von australischen Rotary Gesundheit auf Partner mit Rotary Templestowe und Dine für eine Heilung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch |
| Fötales Rinderserum | Scientifix Life | FBS500-S | Vor Gebrauch Hitze inaktiviert |
| Rekombinant Human TGF-β 1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW zur Erzielung einer Endkonzentration bei 10 mg/ml |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Verdünnung in PBS zur Endkonzentration bei 1 μa; L/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Vor Gebrauch 5x in PBS verdünnen |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phasenkontrast-Fluoreszenzmikroskopie | OLYMPUS | IX50 | |
| Zentrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Bildgebungssystem | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0,5 % Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue auf 0,05 % (1x) in PBS |
| Zellkulturlyse 5x Reagenz | Promega | E153A | Verdünnung auf 1x in DDW |
| 10 % Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isofluran | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Gleitende Augensalbe |
| Lösung | Zusammensetzung | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5 % hitzeinaktiviertes FBS; 10 μ g/ml Penicillin; 100 μ g/mL Streptomycin |
Referenzen
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
