En temperaturgradient analysen å bestemme termisk preferanser Drosophila larver

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å finne foretrukne miljø temperaturen i Drosophila Larvene bruker kontinuerlig termisk gradering.

Abstract

Mange dyr, inkludert frukt fly, Drosophila melanogaster, er i stand til kresne minutt forskjeller i miljømessige temperatur, slik at de kan oppsøke sine foretrukne termisk landskapet. Definere temperatur preferansene til Larvene over en definert lineær område, utviklet vi en analyse ved hjelp av en temperaturgradient. For å etablere en én-veis gradering, er to aluminium blokker koblet til uavhengige vann bad, hver Kontroller temperaturen på individuelle tekstblokker. De to blokkene satt nedre og øvre grensene for graderingen. Temperaturgradient opprettes ved å plassere en agarose-belagt aluminiumsplate over to vann-kontrollerte blokkene slik at platen spenner over avstanden mellom dem. Endene av aluminiumsplate som er angitt på vann blokkene definerer minimum og maksimum temperaturene, og områdene mellom de to blokkene danner en lineær temperaturgradient. Gradient analysen kan brukes på larver i ulike aldre og kan brukes til å identifisere mutanter som viser fenotyper, som dem med mutasjoner påvirker gener som koder TRP kanaler og opsins, som kreves for temperatur diskriminering.

Introduction

Thermotaxis er ansatt av mobile dyr å velge et miljø med den mest gunstige forhold^1,2,3. Hvis klimaet er svært varm eller kald, dette er avgjørende for overlevelse. I tillegg mange dyr er følsomme for svært små forskjeller i temperatur i området behagelig og oppsøke omgivelser med en ideell temperatur. Dette er spesielt viktig for poikilothermic organismer som frukt fluer, som equilibrate kroppstemperaturen med miljøet. Analyser overvåke larver thermotaxis har vært medvirkende i identifisere og klargjøre rollene molekylær sensorer som Drosophila forbigående reseptor potensielle (TRP) kanaler^4,5,6, rhodopsins^7,8, og ionotropic reseptor reseptorer (IRs)⁹, som gi gave disse dyrene med temperatur følsomheten over forskjellige temperaturer.

En toveis svaralternativer gir en tilnærming for å studere termisk innstillinger i Larvene^6,7. Analysen omfatter å opprette to forskjellige temperatur soner og tillater dyr å velge ene over den andre. Resultatene fra toveis valg tester kan være robust, spesielt hvis mellom de to alternativene er stor. Siden hver analysen omfatter tabulerer bare to grupper, kan i tillegg dataene uttrykkes som en enkel preferanse indeks. Den lette og enkelhet av toveis valg analyser er også mottakelig for genetisk skjermer. En stor begrensning er imidlertid at mange eksperimenter er nødvendig å etablere foretrukne temperaturen av vill-type eller mutant dyr.

En gradient analysen tilbyr muligheten til å opprette foretrukne temperaturen i en singel-analysen⁸. Videre, i motsetning til toveis valg testen, det tillater evaluering av distribusjon av en gruppe dyr, når konfrontert med et kontinuerlig spekter av temperaturer. En gradient analysen bruker en Petriskål og enkelt dyr og er velegnet for å karakterisere detaljert atferden til enkelte dyr¹⁰. Men siden Petri retter er runde, størrelsen på temperatur soner variere og er stadig mindre avhengig av avstanden fra sentrum. Derfor er ikke dette oppsettet ideelt for overvåking temperatur valgene av bestander av dyr.

En kontinuerlig termisk gradient apparater som er tilpasset å vurdere temperatur innstillinger av Larvene har en rektangulær arena, og er beskrevet her. Apparatet er enkelt å konstruere og montere. I tillegg graderingen er lineær, og er fleksible, som det kan brukes til å vurdere thermotaxis over store temperatur varierer fra 10 ° C til 42 ° C. Analysen er rask og enkel å utføre og gir reproduserbar data. I tillegg til rapportering favoriserte temperaturen på larvene, avslører preferansene til befolkningen i dyr over en hel lineær område i et enkelt eksperiment. Fordi disse fordelene er det et utmerket valg for å identifisere gener kreves for thermotaxis.

Protocol

1. utstyr fabrikasjon og montering apparater for Gradient analyser

1. Dikte analysen aluminiumsplater for single-retningsbestemt gradient analysen.
   1. Trim og male hver analysen aluminiumsplate (figur 1A) av et enkelt stykke aluminium med en båndsag og skarpe vertikal mill med følgende dimensjoner: ytre er 140 x 100 x 9 mm og indre er 130 x 90 x 8 mm (figur 1B). Anodisering innsiden av hver analysen plate med sort maling å gjøre det enklere å visualisere larvene og hindre rust.
      Merk: Fabrikasjon av analysen aluminiumsplater til single-retningsbestemt gradienten er gjort av en maskin butikk. Anodization er utført av en kommersiell leverandør.
   2. Merk den øvre og nedre felger av hver analysen plate med 13 demarkasjoner, atskilt med 10 mm med et permanent markør. Plass de første og siste demarkasjoner 5 mm fra innsiden av analysen platene (figur 1A, B).
2. For å utvikle analysen aluminiumsplate for toveis gradient, kutte ut en aluminiumsplate med følgende dimensjoner med metallplater sakser: 250 x 220 x 2 mm. anodisering analysen platene med sort maling.
   Merk: Fabrikasjon av aluminium analysen platene for toveis graderingene utføres av en maskin butikk. Anodization er gjort av en kommersiell leverandør.
3. Dikte aluminium blokkene.
   Merk: To blokker er nødvendig for single-retningsbestemt forløpningen og tre blokker er nødvendig for toveis gradient.
   1. Kutte aluminium blokkene (figur 1 c) av et enkelt stykke aluminium med en båndsag (dimensjoner av 50 x 255 x 14 mm) (figur 1 c, D).
   2. Drill vann kanalen inne i blokken (7 mm i diameter) bruker en vertikal mill og tråden grooves i de åpne endene på den ene siden (figur 1 d). Lukk riflet hullene med bolter og Gjengetape danner en U-formet vann kanal (figur 1 c, D).
      Merk: Fabrikasjon av aluminium analysen blokkene er utført av en maskin butikk.
   3. Fastsette koblingen i aluminium blokken (figur 1 d) med skruen trådene og tråden forsegle tape i den ene enden. Den andre enden med flere mothaker tilpasses silikon rør (1/4" ID x 3/8-tommers OD x 1/16" vegg).
4. Få to kjøleskap og varme sirkulerende bad.
5. Samle temperaturkontrollert blokker for gradient analysen systemet.
   1. Single-retningsbestemt gradient, koble til hver av de to aluminium blokkene til en separat vannbad slik at temperaturen på hver blokk er kontrollert av en uavhengig vannet sirkulerer systemet (figur 2A). Bruk silikon rør (1/4" ID x 3/8-tommers OD x 1/16" vegg) å koble utløpet av vannbad til kontakten på innsiden av aluminium blokken (figur 2A). Også bruke slangen for å koble yttersiden kontakten på aluminium blokken i innløpet til vannbad.
   2. For toveis gradient, to av de tre blokkene under venstre og høyre side av platen og koble dem til samme vannbad med slangen (figur 2B). Koble tredje aluminium blokken til en ny vannbad og sted under midten av tallerkenen (figur 2B).
      Merk: Dette apparatet og analysen er bare nødvendig hvis Larvene akkumuleres i sonen på en kant eller den andre av enkelt-retningsbestemt graderingen. Hvis ja, er det viktig å vurdere hvorvidt det er en kant effekt. For å teste denne muligheten, etablere en toveis gradient som kanten sonen temperaturen foretrukket larver med enkelt-retningsbestemt gradient (f.eks 18 ° C) er temperaturen i midten av tallerkenen av toveis gradient (figur 3E , F).

2. larver synkronisering

1. Ernære fluer som skal brukes for egglegging.
   1. Mix gjær granulater og destillert vann med en støter gjøre gjær lime. Grundig grind og rør til konsistensen av lim ligner peanøttsmør. Unngå mye tørr pasta, skalle av når du overfører flyr til frisk ampuller, eller våt lim, som kan fange fluene.
   2. Bruker en pistil, legge gjær lim nær indre veggene i Drosophila standarder, like over overflaten av maten.
   3. Antall 12-35 kvinner opp til halvparten så mange menn (men ikke mer enn 10) på en CO₂ pute og legge til kvinner og menn i hvert gjær lim inneholder hetteglass.
   4. For å holde fly mat med gjær-lim fuktig, mens fluene feed, kombinere disse ampuller i en skuff som inneholder opptil 100 ampuller med 20 åpne ampuller med destillert vann. Legg skuffen i en gjennomsiktig plastpose, og forsegl.
   5. Inkuber brettet i en 25 ° C inkubator for 48 timer slik at kvinner er næret tilstrekkelig, og dermed gjør dem til å legge store antall egg.
2. Definere hetteglass for egglegging.
   1. Overføre næret fluene til nye mat hetteglass for innsamling av egg ved å trykke dem. Ikke bruk CO_2, som kan forårsake fluene å legge færre egg over følgende kort tidsvindu.
      Merk: Standard Drosophila mat ampuller brukes uten gjær lim for egg innsamling.
   2. Lar fluer å legge egg for 3t ved 25 ° C slik at alle eggene er samlet over en relativt smale vinduet.
      Merk: Dette aktiverer Larvene synkroniseres på samme utviklingsmessige scenen.
   3. Plasser hetteglass med eggene i skuffen som inneholder vann hetteglass og stram bag. Inkuber ved 25 ° C under 12 h lys: 12 h mørke sykluser.
   4. Alder Larvene for et gitt antall timer etter egglegging (jel) avhengig av larvestadiet ønsket.
      Merk: Tabell 1 er en vurdering av forholdet mellom timene AEL og larvestadiet, som varierer avhengig av fly lager mat brukes, oppdrett temperatur etc. nøyaktig forholdet mellom AEL og utviklingsstadiet må bekreftet ved hver etterforsker med fysiske kriterier, for eksempel morfologi av munnen kroker og voksne¹¹.

3. temperaturgradient oppsett

1. Forberede single-retningsbestemt gradering
   1. Hvis du vil opprette en fuktig ambient miljøet under analyser, plassere to aluminium blokkene koblet til to vann bad på våt papirhåndklær, atskilt med 10 cm (figur 2A).
   2. Slå på to vann bad ~ 2 h før starte analysen for å la temperaturen på aluminium blokker til equilibrate.
      Merk: Det anbefales å utføre en uekte eksperiment for å finne temperaturen på hver vannbad som er nødvendig for å oppnå den ønskede lineær temperaturgradient. Noen typiske temperatur par sette vann bad er oppført i tabell 2. Merk imidlertid at overflatetemperaturer påvirkes av temperaturen. Lengden på rør også påvirker temperaturen som det er kjøling i rørene. Lengden på slangen i våre oppsett er 1,5 m.
   3. Mikrobølgeovn 100 mL 1% agarose på høyeffekts innstillingen i en 500 mL rundt bred munn flaske og hell 25 mL/analysen plate på et nivå Borstemmaskin. Forberede to analysen plater, som kan plasseres på aluminium blokker samtidig (figur 2A).
   4. Etter at agarose har styrket (10-20 min), forsiktig gni hver agarose overflaten med en standard kjøkken svamp eller en melamine svamp å gjøre agarose overflaten litt grov, slik at når sprøyte vann på agarose gel, opprettes en glatt tynn vann membran, og ingen vanndråper vil danne.
   5. Dukke fullt ut plater i en beholder med destillert vann til analysen er klar utføres for å hindre at platene får desiccated.
2. Forberede en toveis gradient (valgfritt)
   1. Hvis du vil opprette en fuktig ambient miljøet under analyser, plassere tre aluminium blokker 8 cm fra hverandre (figur 2B) på våt papirhåndklær.
   2. Slå på to vann bad ~ 2 h før starte analysen for å la temperaturen på aluminium blokker til equilibrate.
      Merk: Det anbefales å utføre en uekte eksperiment for å finne temperaturen på hver vannbad for toveis gradient. Noen typiske temperatur par sette vann bad er oppført i tabell 3. Merk imidlertid at overflatetemperaturer påvirkes av temperaturen. Lengden på rør også påvirker temperaturen som det er kjøling i rørene. Lengden på slangen i våre oppsett er 1,5 m.
   3. For å forhindre agarose hvert platen, vikle kantene av aluminiumsplate med merking tape for å danne en 10 mm høy vegg (figur 2B).
   4. Bruke innstillingen høyeffekts, mikrobølgeovn 200 mL 1% agarose i en 500 mL rundt bred munn flaske og hell 120 mL på en analysen plate.
   5. Etter at agarose har styrket (~ 30 min), forsiktig gni hver agarose overflaten med en standard kjøkken svamp eller en melamine svamp å gjøre agarose overflaten litt grov, slik at når sprøyte vann på agarose gel, en glatt tynn vann membran opprettes og ingen vann dråper skjemaet.
   6. Dukke fullt ut analysen platene i en container med destillert vann til analysen er klar utføres for å hindre at de tørker ut.
3. Angi enkelt-retningsbestemt gradering
   1. Forbered reagenser og varer på en benk ved gradient analysen apparatet (se Tabell for materiale).
   2. For å fremme effektiv temperatur overføring, fylle hull mellom aluminium blokkene og analysen platene ved å sprøyte vann på grensesnittet mellom blokkene og plate.
   3. Bruker hansker, fjerne analysen platene fra vannbeholderen. Hvis vann invaderer mellom agarose gel og plate og forårsaker støt form på overflaten, fjerne vannet med P1000 brønnene.
   4. Plass analysen platene på aluminium blokkene slik at demarkasjoner som er 2 cm fra kanten nøyaktig samsvarer kantene av aluminium blokkene (figur 2A, C).
   5. Spray vann på overflaten av platen (en tynn vann membran som dekker agarose overflaten er tilstrekkelig) å hindre agarose gel tørker ut. Kontroller at vann membranen er kontinuerlig og vanndråper siden Larvene kan få fanget i vanndråper.
   6. Dekker gradient systemet med en pappeske å redusere fordampning og bidra til å stabilisere temperaturen på gel overflaten. Vent 5-10 min å tillate temperaturen å equilibrate.
   7. Sjekk overflate temperatur på 12 poeng på tallerkenen (figur 2C). Foreta to målinger i hver sone for å fastslå om det er variasjoner i en sone. Kontroller temperaturen på begge stedene er innenfor ± 0,2 ° C over ønsket temperatur.
      Merk: Variasjon i en sone oppstår vanligvis fordi den nøyaktige avstanden av de to plassene til kanten av aluminium blokkene ikke er identiske. Juster plasseringen av plate aluminium blokker for å Kontroller at demarkasjoner som er 2 cm fra kanten nøyaktig samsvarer med kantene av aluminium blokkene.
   8. Hvis den målte temperaturgradient avviker fra den ønskede graderingen, øke eller redusere vann bad temperatur innstillinger og kontrollerer overflatetemperaturen når temperaturen i vannet bath(s) stabilize(s).
   9. Dekk gradient systemet med en pappeske til starte analysen.
4. Konfigurere toveis gradient (valgfritt)
   1. Forbered reagenser og varer på en benk ved gradient analysen apparatet (se Tabell for materiale).
   2. Spray vann på overflater av tre aluminium blokker for å fremme effektiv temperatur overføring fra aluminium blokkene til analysen platene ved å fylle hull mellom overflater.
   3. Fjern analysen platene nøye fra vannbeholderen og plasser på aluminium blokker. Hvis vann invaderer mellom agarose gel og platen, som kan forårsake støt form på overflaten, fjerne vannet med P1000 brønnene.
   4. Plass analysen platen på aluminium blokkene slik at midlines av første og siste soner fra kanten samsvarer nøyaktig med kantene av to side aluminium blokkene (figur 2B, D).
   5. Spray vann på overflaten av platen (en tynn vann membran som dekker agarose overflaten er tilstrekkelig) å hindre agarose gel tørker ut. Kontroller at vann membranen er kontinuerlig og vanndråper, siden Larvene kan få fanget i vanndråper.
   6. Dekker gradient systemet med en pappeske å redusere fordampning og bidra til å stabilisere temperaturen på gel overflaten. Vent 5-10 min slik at temperaturen å equilibrate.
   7. Sjekk overflatetemperaturen på to punkter langs midtlinjen til hver av sonene 10 (figur 2D). Foreta to målinger i hver sone for å fastslå om det er variasjoner i en sone. Kontroller temperaturen på begge stedene er innenfor ± 0,2 ° C over ønsket temperatur.
      Merk: Variasjon i en sone oppstår vanligvis fordi den nøyaktige avstanden av de to plassene til kanten av aluminium blokkene ikke er identiske. Juster plasseringen av platen på aluminium blokker å sørge for at midlines av de første og siste sonene nærmeste kanten lik kantene av to side aluminium blokkene.
   8. Hvis den målte temperaturgradient avviker fra den ønskede graderingen, Juster vann bad temperatur innstillinger og kontrollerer overflatetemperaturen når temperaturen i vannet bath(s) stabilize(s).
   9. Dekk blokker med en pappeske til starten av analysen.

4. larver innsamling og vask

1. Isolere ren Larvene (alternativ 1)
   1. Legge til ~ 40 mL 18% sucrose løsning i et 50 mL reagensrør. Scoop alle Larvene fra mat vial(s) med scoopula og overføring til 18% sukrose løsning.
   2. Bland godt men forsiktig bruker en scoopula skille larver fra maten rusk. Vent 30-60 s til Larvene dupp å det øverste laget av røret. Hell det øverste laget som inneholder Larvene (~ 10 mL) til en annen 50 mL tube og fylle røret med fersk 18% sucrose løsning. Vente for 30-60 s til Larvene dupp å det øverste laget igjen.
      Merk: Store matpartikler noen ganger overføre sammen med larver og kan påvirke larver thermotaxis hvis de ikke fjernes. Hvis store matpartikler forblir i det øverste laget, Gjenta trinn 4.1.1-4.1.2, eller manuelt fjerne dem ved hjelp av en scoopula.
   3. Overføre det øverste laget av Larvene (~ 10 mL) til to andre 50 mL rør og fylle to rør med destillert vann å redusere sukrose konsentrasjonen, slik at larvene raskt synke i vann. Vent 30-60 s til Larvene synke å bunnen. Utføre denne og følgende så raskt som mulig å hindre at larvene drukning.
   4. Kast så mye vann som mulig ved å vippe rør forsiktig. Kombinere larver i en tube ved å helle ut Larvene med det samme vannet og fylle røret med destillert vann.
   5. Vent for 30-60 s til alle larver synke og fjerne så mye vann som mulig ved å vippe rør forsiktig. Gjenta denne vask trinn 2 - 4 ganger å helt fjerne sukrose og alle synlige mat.
   6. Forkast så mye vann som mulig og overføre Larvene til en tom 35 mm Petriskål av dekantere vin. Spray røret med vann og bruk en liten pensel for å overføre larvene.
   7. Fjern overflødig vann fra Petriskål bruker P1000 brønnene. La ~0.5 mL vann å hindre dehydrering næringsplante.
   8. Plass lokket på parabolen hindre at larvene unnslippe. Skru lokket opp ned for å redusere muligheten for Larvene å flykte gjennom den lille gapet mellom lokket og parabolen. At larvene å gjenopprette for 10-20 minutter.
2. Isolere ren Larvene (alternativ 2)
   Merk: Denne alternative metoden for rengjøring Larvene begrenser muligheten for kvelende Larvene under vask prosedyren. For å bruke denne metoden, fortsetter du med følgende etter utføre det over skritt 4.1.1-4.1.2.
   1. Plasser en celle sil (300 µm, beholder Larvene 72 h AEL eller eldre) på en 50 mL tube.
   2. Etter å ha bekreftet at det er ingen voksen organer eller matrester flyter på overflaten av sukrose løsningen, hell det øverste laget som inneholder Larvene gjennom silen å fange alle Larvene på mesh skjermen. Vask Larvene grundig med destillert vann til 50 mL røret er fylt.
   3. Fjerne celle silen med larver og kast den brukte vannet fra røret. Plasser silen som inneholder Larvene over tomme røret og vaske Larvene igjen med destillert vann til 50 mL røret er fylt.
   4. Slå silen opp ned over en tom 35 mm Petriskål og sprøyte vann fra toppen av cellen silen overføre Larvene til Petriskål. Overføre gjenværende Larvene bruker en liten pensel.
   5. Fortsett å gå 4.1.7 over før du går videre til trinn 5.

5. analysen og beregning

1. Fjerne pappeske og sjekk gel overflatetemperaturen umiddelbart før du overfører Larvene til platen. Redusere tiden som pappeske er åpne for å unngå forstyrre temperatur balanse. Hvis overflaten er tørr, spray en liten mengde vann på overflaten.
2. Distribuere 150 ± 50 Larvene nær midten av hver plate (mellom soner 3 og 4 av 6 soner) for single-retningsbestemt forløpningen (release sone; Figur 2C).
   Merk: For toveis gradient, distribuere 200-400 Larvene langs midten sonen for hver halvdel (figur 2D).
3. Plass microplate lokk over hver analysen plate hindre at larvene krypende ut. Dekk oppsett med en pappeske å hindre lyseksponering, noe som kan påvirke larver valg på agarose gel.
   Merk: For toveis gradient, det bør ikke være nødvendig å dekke platen med lokk, fordi platen er større, og Larvene foretrukne temperaturen er i midtre sone. Derfor noen larver akkumuleres i kantene og mulighet til å krype ut.
4. Lar analysen fortsette i 10-30 min for enkelt-retningsbestemt graderingen og 15-35 min for toveis gradient, avhengig av alderen næringsplante (Tabell 4).
5. Fjern pappeske og microplate lokket. Fotografere platene ovenfra bruker et digitalt kamera. Ta to bilder av hver analysen plate slik at etterforskeren kan velge bedre kontrast og lysstyrke for analyse.
6. Fjern alle Larvene fra analysen platene og hvor som helst utenfor platene av aspirasjon.
7. Rengjør analysen platene, rør og celle silen grundig med destillert vann. Bruke analysen platene forberedt den dagen hvis overflaten av agarose er skadet.
8. Beregn prosentvis fordeling av larver i hver sone.
   1. Åpne fotografiske bildet av analyseresultatene ved å bruke programvare som tillater å legge til markeringer i bildet. For å angi sonene analysen, trekke vertikale linjer hver 2 cm basert på demarkasjoner på analysen tallerkenen.
   2. Antall larver i hver sone og registrere tallene. Telle ikke larver i regioner 0,5 cm fra alle veggene. Gel er tykkere nær vegger, og overflaten temperaturen er ikke lineær i disse regionene.
   3. Single-retningsbestemt gradient, beregne prosentvis fordeling i hver sone som følger:
      (antall larver i en gitt sone 2 cm) / (totalt antall larver i 6 soner) x 100.
   4. Toveis gradient, beregne prosentvis fordeling i hver sone som følger:
      (antall larver i en gitt sone 2 cm) / (totalt antall larver i 5 soner på hver side av gradient) x 100.

Representative Results

For å etablere en 18 ° C - 28 ° C single-retningsbestemt gradering, vi satt temperaturer på to vann bad 16,8 ° C og 31 ° C. Vi få var temperaturene på 13 poeng ved å måle temperaturen på 26 stillinger i den øvre og nedre delen av alle 6 soner, kantlinjene mellom soner, og på de ekstreme endene av agarose gel overflate (figur 2C, 2E). Temperatur fordelingen langs graderingen var nesten lineære (Y = 0.9672 * X + 16.19, R² = 0.9961) (figur 2E).

Vi assayed temperatur preferansene til kontroll (w¹¹¹⁸) Larvene lever på ulike aldre. 1^st (24 ± 1,5 t AEL), 2^nd (48 ± 1,5 t AEL) og tidlig-3^rd larver (72 ± 1,5 t) viste topper i sonen 24 ° C (figur 3A, B). Temperatur innstillingene endres under 3^rd skikkelsen larver utvikling. Den største prosentandelen av midt-3^rd skikkelsen (96 ± 1,5 t AEL) akkumulert i sonen 18 ° C (figur 3A, B), og denne skjevhet økt med alderen. Blant sent-3^rd skikkelsen Larvene (pre klatring, 120 ± 1,5 t AEL), ~ 50% gruppert i sonen 18 ° C, og valg av denne temperaturen var ~ 4-fold høyere enn sonen ved 20 ° C (18 ° C sone, 50.2%, 20 ° C sone, 15,1%. Figur 3A B). Proclivity å samle i sonen 18 ° C i w¹¹¹⁸ skyldtes ikke en kant effekt siden slutten-3^rd skikkelsen Larvene fortsatt akkumulert i sonen 18 ° C, med en toveis temperaturgradient (figur 3E, F ).

Vi testet sent-3^rd skikkelsen Larvene (120 ± 1,5 t AEL) mutasjoner i gener kreves for kresne temperaturforskjeller i området behagelig. Disse inkluderer trpA1, som er nødvendig for normal temperatur utvalg i 18 ° C - 24 ° C området^5,7,8. Larvene med en null mutasjon i trpA1 (trpA1¹) distribuere like over hele 18 ° C-28 ° C gradering (Figur 3 c). Larvene mangler bare den A og B isoformene (trpA1-AB^G4) eller C og D isoformene (trpA1-CD^G4) også viser alvorlig nedsatt (Figur 3 c). Fluer kode to isoformene av fosfolipase Cβ (PLC21C og NORPA), og mutasjoner påvirker norpA (norpA^P24) men ikke plc21c (plc21c^P319) også forstyrre akkumulering i området 18 ° C ( Finne 3D).

Figur 1. Apparater for å utføre single-retningsbestemt temperaturgradient analysen. (A) en teste platen brukes til assaying larver thermotaxis atferd. De 13 svarte linjene øverst og nederst avgrense 12 soner (10 mm hver). Bunnen av platen er eloksert med sort maling slik at det blir enklere å visualisere larvene. (B) dimensjoner av aluminiumsplate (angitt i mm). Ytre er aluminiumsplate 140 x 100 x 9 mm. Indre er aluminiumsplate 130 x 90 x 8 mm. Demarkasjoner er atskilt med 10 mm. Første og siste avgrensning er 5 mm fra kantene på den indre delen av platen. (C) topp og side utsikt over en av aluminium blokker brukes til å kontrollere temperaturen på graderingen. Blokken har to kontakter legges til silisium rør, som kobles til et vannbad. (D) dimensjonene av en aluminium blokk. Ytre er aluminium blokken 255 x 50 x 14 mm. Diameteren på indre vann banen er 7 mm. To 30 mm kontakter til venstre koble med silisium rør som strekker seg til vannbad. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Enkelt og toveis gradient analysen oppsett. (A) Single-retningsbestemt gradient oppsett med to aluminiumsplater analysen på to aluminium blokker. Temperaturer på aluminium blokkene kontrolleres av circulating vann fra to vann bad. (B) ordningen med tre aluminium blokkene, vann bad og en aluminiumsplate (250 x 220 mm) for en toveis gradient. Venstre og høyre blokkene er koblet til samme vannbad og den midterste blokken er koblet til andre vannbad. Analysen aluminiumsplate er pakket med tape for å danne en 10 mm vegg inneholder 1% agarose. (C) posisjoner å sjekke temperaturer (angitt med prikker) og å løslate larver på tallerkenen. Før du starter et eksperiment, Sjekk temperaturen på to punkter i hver sone å bekrefte at det ønskede lineær temperaturgradient er etablert. Larvene frigis innenfor det angitte området i nærheten av midtlinjen. Larvene telles innenfor hver av sonene 2 cm. (D) posisjoner å sjekke temperaturer (angitt med prikker) og sonene utgivelsen for Larvene på en toveis gradient. Likt antall Larvene frigis langs midtlinjen av hver halvdel av toveis gradient. Antall Larvene telles i hver av 10 (2 cm) soner. En vanlig sett med temperaturer (18 ° C - 26 ° C) på agarose overflaten er angitt. (E) temperaturer målt langs kantlinjer og midlines av hver sone i utvalg enkelt-retningsbestemt gradering. Dataene representerer bety temperaturer ± SD. n = 8 analyser (150 ± 50 Larvene/analysen). Deler av dette tallet er gjengitt fra Sokabe et al. ⁸ med små modifikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Representant resultater med enkelt-retningsbestemt og toveis gradient analyser. (A, B) Mener prosenter av larver i 6 soner på enkelt-retningsbestemt graderingen. Data omfatter 3^rd skikkelsen larver på angitte timer etter egglegging (jel). n = 6-7. Feilfeltene i en representerer ±SEM. (C) termisk distribusjoner av pre klatring sent-3^rd skikkelsen larver kontroll (w¹¹¹⁸) og trpA1 mutanter på enkelt-retningsbestemt graderingen. n = 3-4. Feilfeltene representerer ±SEM. (D) termisk distribusjoner av sen-3^rd skikkelsen larver kontroll (w¹¹¹⁸) og PLCβ mutanter på enkelt-retningsbestemt graderingen. n = 4-6. Feilfeltene representerer ±SEM. (E) representativ fordeling av pre klatring, sen-3^rd skikkelsen Larvene (w¹¹¹⁸) på toveis gradient. Venstre og høyre analysen sonene er angitt av stiplede linjer og atskilt av sonen no-teller i midten (skyggelagt område). (F) andelen pre klatring sent-3^rd skikkelsen Larvene (w¹¹¹⁸) i hver sone langs termisk graderingen. Larvene er plassert i venstre og høyre slipp soner. Sonene analysen er atskilt med en 3-cm no-count sone i midten og distribusjonene beregnes uavhengig. Feilfeltene representerer søkemotormarkedsførere. n = 3 analyser (200-400 Larvene/analysen). Deler av dette tallet er gjengitt fra Sokabe et al. ⁸ med små modifikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Timer AEL	Larvestadiet
24	1st skikkelsen
48	2nd skikkelsen
72	Tidlig-3rd skikkelsen
96	Midt-3rd skikkelsen
120	Sen-3rd skikkelsen, like før klatring scenen

Tabell 1. Forholdet mellom timene etter egglegging (jel) og larver stadier.

Temperaturgradient på agarose plate (stigningstallet)	Temperaturer på vann bad	Temperaturer på aluminium blokker
10.0-25.0° C (1,5 ° C/cm)	~6.5-7°C/~28.5°C	~8.5°C/~26.8°C
18,0-28.0° C (1° C/cm)	~16.8°C/~31.0°C	~17.8°C/~29.7°C
14.0-34.0° C (2° C/cm)	~10.0°C/~40.0°C	~11.8°C/~36.8°C
12.5-42.0° C (2,95 ° C/cm)	~7.0°C/~55.0°C	~9.4°C/~49.4°C

Tabell 2. Typiske temperatur graderinger og tilsvarende temperaturene vann bad og aluminium blokker for enkelt retningsbestemt graderinger.

Temperaturgradient på agarose plate	Temperaturer på vann bad	Temperaturer på aluminium blokker
22-10-22 ° C (1,5 ° C/cm)	~5.0°C /~25.0°C	~7.5°C/~24.0°C
26-18-26 ° C (1° C/cm)	~15.8°C /~30.6°C	~16.9°C/~28.4°C
30-14-30 ° C (2° C/cm)	~8.5°C /~36.4°C	~10.9°C/~32.8°C
36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm)	~5.0°C /~47.2°C	~7.9°C/~40.9°C

Tabell 3. Typiske temperatur graderinger og tilsvarende temperaturene vann bad og aluminium blokker for toveis graderinger.

Larver alder (jel)	Analysen tid (én retning)	Analysen tid (toveis)
24 h	30 min	35 min
48 timer	22 min	27 min
72 h	16 min	21 min
96 h	13 min	18 min
120 timer	10 min	15 min

Tabell 4. Ulike larver aldre (jel) og tilhørende analysen tider.

Discussion

For å lykkes med denne protokollen, er det viktig å få tilstrekkelig antall larvae å utføre eksperimenter. Disse inkluderer pre mate flyr i gjær lim inneholder hetteglass for 2-3 d å forbedre egglegging. Ampullene må plasseres på et brett som inneholder vann flasker og vedlagt i en gjennomsiktig plastpose, som gjør at fuktigheten maten og fremmer effektiv fôring larver mens tillater eksponering for vanlig lys-mørk sykluser. Gjær lim bør imidlertid ikke være så myk at fluene bli fanget. Antall kvinner per medisinglass avhenger av genotype. Ved w¹¹¹⁸er det vanligvis tilstrekkelig å tillate ~ 12 kvinner og ~ 6 menn å legge egg for 3t. To flasker gir vanligvis nok larvae (100-200 Larvene) å plassere på en tallerken for single-retningsbestemt analysen. Hvis fly aksjen legger færre egg enn vill-type eller andelen larver som klekker reduseres, legge flere kvinner (opptil 30-35/medisinglass) og menn.

Det er mange årsaker til utilsiktede variasjon når du utfører disse analyser. Det utviklingen scenen påvirker temperaturen fortrinnsretten larvene. Derfor er det viktig å nøye bruke larver av en definert scene. For å gjøre så, samle Larvene over en smal tidsrom (for eksempel 3 h). Siden oppdrett betingelser (temperatur, fuktighet, lys og mørke syklus og type mat) og noen mutasjoner påvirker hastigheten av utvikling, ikke stole strengt på tiden etter egglegging for å analysere sammenlignbare alderen larver. Det er også viktig å undersøke fysiske egenskaper, for eksempel størrelsen av munnen kroker og voksne⁷ å avgjøre om larver av ulike genotyper er på den samme utviklingsstadiet. Tidspunktene for 1^st, 2^nd og 3^rd skikkelsen Larvene å utvikle (tabell 1) er basert på bruk av korn måltid-baserte mat og inkubasjon ved 25 ° C under 12 h lys: 12 h mørke sykluser. Larvene vokser saktere på sirup-basert næringen. Skikkelig hydrering og maten friskhet påvirker også veksten av larver. Mengden av vann i maten bør la maten for tørr å skrelle tilbake fra ampullen verken for løs på grunn av overdreven vann. Ideelt sett ~ 5 mm laget nærmeste mat overflaten er betinget av voksende larvene og flytter lett når ampullen er skråstilt eller tappet. Denne tilstanden kan oppnås med nystekte mat med 50-100 larver.

Det er viktig å etablere et stabilt temperaturgradient før starte analysen. Derfor slå på vannbad 1-2 h før starte analysen, som i vann produserer varme og kan endre ambient romtemperatur, som igjen har potensial til å påvirke graderingen. Etter 1-2 h equilibrates temperaturen på mest aircondition. Men må dette avgjøres i hvert miljø. Når genererer en forløpning med et stort temperaturområde (> 3.0 ° C/cm), kan det være vanskelig å få en stabil gradering. En liten bevegelse av analysen platen mer betydelig endres temperaturgradient når området er stort (f.eks > 3.0 ° C/cm). Vi fant at en 1-2 ° C/cm gradering gir den mest stabile forløpninger.

Det er flere ekstra hensyn må kontrolleres for å begrense variasjon i thermotaxis analyser. Vaske Larvene er kritisk, som tilstedeværelse av matrester eller Sukrose på Larvene kan påvirke analysen. Vask trinnene må utføres grundig, men raskt, fordi begrense deres oksygentilførsel overdrevet mens de er neddykket i vann kan påvirke deres helse. Derfor anbefaler vi bruke celle silen (alternativ 2) for å rengjøre larvene. En sil med en porestørrelse av 300 µm fungerer godt for larver på tidlig-3^rd skikkelsen scenen (72 h AEL) eller eldre. I tillegg er det viktig å utføre eksperimenter på samme tid på dagen, som fra Zeitgeber tid (ZT) ZT4 til ZT8 (ZT = 0 er når lysene er slått på), begrense variasjon på grunn av virkningene av biologiske rytmer på temperatur utvalg. Nivået av fuktighet på agarose plate kan også forårsake variasjon i resultatene. Mens overflaten av platene må være fuktig, vanndråper felle larvene, og derfor må unngås.

Begrense variasjon i analyser vil gjøre det mulig å få robust resultater uten å utføre et stort antall uavhengige forsøk. 3-8 uavhengig eksperimenter er vanligvis tilstrekkelig for å oppnå en pålitelig utfall. Riktig målingen av resultatene er også avgjørende for suksessen til thermotaxis analyser. Telle ikke Larvene distribuert i områdene i 0,5 cm fra aluminium vegger, siden temperaturene ikke er lineær i disse regionene. Noen larver plasseres på grensen mellom to soner, når analysen er avsluttet. Hvis mer enn 50% av hvor kroppen ligger i en sone, da inkludere Larven i målingen for sonen. Hvis en Larven er nettopp 50% i hver av to soner, regnes dyret som 0,5 larver i hver sone.

Mens gradient analysen lar Larvene å diskriminere en rekke temperatur, finnes begrensinger for nedre og øvre temperaturer som kan testes effektivt. Det er ikke mulig å teste temperaturer < 10 ° C siden mobiliteten til Larvene reduseres betydelig ved lavere temperaturer. Selv om forløpninger med øvre temperatur nå 42 ° C kan etableres, nesten ingen kontroll Larvene bo i en sone > 28 ° C. Derfor kontinuerlig gradient analyser kan ikke brukes til å diskriminere temperatur innstillinger mellom ulike soner > 28 ° C. Imidlertid kan gradient analyser på disse høye temperaturer potensielt brukes som karakteriserer mutanter hvis de svært skiftet varm temperatur innstillinger.

Hvis en mutant har locomotor feil, kan det være nødvendig å utføre flere eksperimenter å sørge for at den tilsynelatende temperatur preferansen ikke er unøyaktig på grunn av en bevegelse verdifall. For å bøte på dette potensielle problemet, kan det være nødvendig å etablere lengre analysen ganger å tillate dyr Tilleggstiden flytte til deres ønskede soner. Toveis gradient analysen kan også brukes til å teste om dyrene Velg samme foretrukne sonen, uten hensyn til hvor de plasseres først på tallerkenen.

Avslutningsvis har gradient analyser beskrevet her fordeler over andre thermotaxis analyser. Mens toveis valg analyser er nyttig, som de kan gi robust resultater, spesielt når mellom de to sonene er stor, er de ikke effektive i avslørende den ideelle temperaturen foretrukket larver i et enkelt eksperiment. Det krever utfører mange toveis valg kombinasjoner for å finne den mest foretrukne temperatur^5,6,7. Derimot gir gradient analysen dyret mulighet til å velge sin foretrukne temperatur sone i et miljø med et enkelt kontinuerlig temperatur landskap. Dermed er det nødvendig å utarbeide en stor kombinasjon av toveis valg å avgjøre det foretrukne termiske miljøet. Studere thermotaxis med en runde Petriskål har vært ansatt å vurdere effekten av temperatur på bevegelige dynamikken i en larve¹⁰. Det er imidlertid mindre nyttig i forskjellsbehandle innstillinger mellom forskjellige temperaturer, siden hver sone har en annen størrelse. Til slutt, på grunn av enkelhet av analysen, og dens nytte i kresne lille temperatur innstillinger i en enkelt analysen, det kan være ansatt til skjermen dusinvis av kandidat gener som er potensielt involvert i larver temperatur preferanse som kan ellers være oversett bruker andre analyser

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124
Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila food
Distilled water			22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1,609 g
Brewers yeast 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo light corn syrup	Karo		1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8.5 mL