Aquí, presentamos un protocolo paso a paso de axones myelinated en un trozo de cerebro fija usando una nanoescala libre etiqueta técnica basado en reflectometría spectral de la proyección de imagen de la proyección de imagen.
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Artículo de método
Microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en Situ
En este artículo
Resumen
Resumen
En un mamífero sistema nervioso, mielina proporciona un aislamiento eléctrico enwrapping las fibras del axón en una espiral de varias capas. Inspirado por su arquitectura subcelular altamente organizado, recientemente desarrollamos una nueva modalidad de imágenes, llamada reflectometría espectral (SpeRe), que permite la proyección de imagen de nanoescala etiqueta-libre sin precedentes de los axones myelinated vivo in situ. El principio subyacente es obtener información nano-estructural analizando el espectro de reflectancia de la estructura subcelular de varias capas. En este artículo se describe un protocolo detallado paso a paso para realizar una básica SpeRe la proyección de imagen de los tejidos nerviosos mediante un sistema microscopio confocal comercial, equipado con un láser de luz blanca y un filtro sintonizable. Cubrimos los procedimientos de preparación de muestras, adquisición de datos espectrales y procesamiento de imagen para obtener información de nano-estructural.
Introducción
En el mamífero sistema nervioso, mielina proporciona integridad axonal y conducción nerviosa rápida enwrapping las fibras de axones con varias capas envolturas membranosas. Su estructura multicapa se compone de alterna de nanoescala películas delgadas compuestas de membranas del plasma (~ 5 nm), citosol (~ 3 nm) y espacios extracelulares (~ 7 nm)1,2. Microscopía óptica, incluyendo la microscopía de superresolución recientes, no son adecuados para la observación de la dinámica de la mielina de escala nanométrica debido a su insuficiente resolución debido a la difracción óptica3,
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Protocolo
Todos los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan.
1. preparación de la muestra
Nota: Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de manejo de animales. Llevar a cabo todos actuación quirúrgica en una sala dedicada a procedimientos quirúrgicos. Guantes y batas quirúrgicas estériles deben llevarse por todo el personal en la sala quirúrgica en todo momento.
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Fijación del tejido
- Preparar dos jeringas de 10 mL, que cada uno relleno con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y....
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Resultados
Según el protocolo, un trozo de cerebro fija fue preparado con coloración exógena, un fluoróforo dirigidos a la mielina (véase Tabla de materiales). SpeRe la proyección de imagen se realizó en el segmento del cerebro con un microscopio confocal comercial hiperespectral en conjunto (figura 4a) la proyección de imagen confocal de la fluorescencia. SpeRe, entrada intensidad óptica fue establecido como 5 μW/μm2 con un tiempo de permane.......
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Discusión
SpeRe es una modalidad de etiqueta-libre nuevo basada en interferometría espectral, que por primera vez, ofrece la información de nanoescala en axones mielinizados energizados. En el actual protocolo de adquisición, la resolución espacial para el diámetro del axon es del orden de 10 nm. Por otra parte, SpeRe utiliza órdenes de la magnitud dosis más baja de luz en comparación con otras Microscopías de súper-resolución; por lo tanto, es libre de fototoxicidad y photobleaching. SpeRe proporcionaría una nueva vía para estudi.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que compiten intereses financieros: Kwon J. y M. Choi son inventores de la tecnología pendiente de patente se describe en este artículo.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Instituto de ciencias básicas (IBS-R015-D1) y programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1A6A1A03015642).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cortador de vidrio | : | se puede comprar en una tienda de conveniencia local o en tiendas en línea. | |
| Esmalte de uñas | : | se puede comprar en una tienda de conveniencia local o en tiendas en línea. | |
| Objetivo apocromático 40 veces, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Tipo de inmersión |
| en agua Verde de fluoromielina | Thermo Fisher | F34651 | Alternativamente, se puede utilizar rojo de fluoromielina (F34652). |
| Microscopio Leica SP8 TCS | Leica Microsystems | SP8 | Consulte la sección "Configuración del microscopio" en la introducción para obtener más información. |
| Software de imagen | Leica Microsystems | LAS-X-Matlab | |
| MathWorks | - | - | |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Recubierto con plata protegida. |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Life technologies | 14190-136-Paraformaldehído | |
| Biosolution | BP031a | 4% v/v en PBS | |
| Cubreobjetos | Thermo Fisher | 3306 | Grosor: #1 (0,13 a 0,17 mm) |
| Portaobjetos de vidrio | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Grosor: ~1 mm |
| Superpegamento | Henkel | Loctite 406 | Utilice un equipo dispensador para evitar el contacto con la piel o los ojos. |
| Bomba de jeringa | Brainetree | Scientific BS-8000 DUAL-Vibratome | |
| Leica Biosystems | VT1200S-Láser | ||
| de luz blanca | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 fue descontinuada y reemplazada por EXU-6. |
Referencias
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS mye....
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Reimpresiones y permisos
