Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz
Bu makalede
Özet
Özet
Patojenler istila yanıt olarak, nötrofil histon ve antimikrobiyal proteinler ile dekore edilmiş DNA hücre dışı ağları olan ekstraselüler nötrofil tuzakları (ağlar), serbest bırakın. Aşırı NET formasyonu (NETosis) ve citH3 yayın sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve fareler ve insanlar mortalite ile ilişkili ama köpeklerde olan etkileri bilinmemektedir. Burada, tam kan gözlem ve NETosis miktar üzerinden köpek nötrofil yalıtmak için bir teknik açıklar. Lökosit açısından zengin plazma dextran sedimantasyon tarafından oluşturulan, piyasada bulunan yoğunluk gradient ayrılık medya tarafından ayrılmış ve granülosit toplanan hücre sayımı ve Viabilite test. Canlı nötrofil içinde gerçek zamanlı NETosis gözlemlemek için hücre permeant ve hücre impermeant floresan nükleik asit lekeleri nötrofil lipopolysaccharide (LPS) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) tarafından aktive eklenir. Nükleer Morfoloji ve NET oluşumu değişiklikler zamanla floresans mikroskobu tarafından gözlenir. Vitro NETosis daha fazla co-değiştirilmiş bir çift-immunolabelling iletişim kuralı kullanılarak colocalization tarafından boş hücre DNA'ın (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ve citrullinated histon H3 (citH3) ile karakterizedir. Objektif olarak NET oluşumu ve citH3 ifade floresans mikroskobu, kullanarak ölçmek için ağlar ve citH3 pozitif hücreleri mevcut yazılım kullanarak kör bir şekilde sayılabilir. Bu teknik NETosis geçmesi köpek nötrofil vitro kapasitesini değerlendirmek için belirli bir tahlil olduğunu.
Giriş
Nötrofil kısa ömürlü granülosit patojenler istila karşı ilk savunma sorumlu vardır. Nötrofiller, enfeksiyon, siteye işe mikroorganizmalar tarafından fagositoz, degranulation ve reaktif oksijen türleri (ROS)1nesil ortadan kaldırmak. Bakteri veya endotoxins huzurunda, nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), hücre dışı kromatin oluşan histon ve elastase ve myeloperoxidase gibi taneli proteinler (MPO)2süslenmiş. NETs vazgeçilmez antimikrobiyal özellikleri olsa da, deneysel ve klinik kanıt artan hevesli NET oluşumu sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve ölüm3,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Kaliforniya Üniversitesi Davis tarafından kabul edildi (protokol numarası: 18338).
1. kan toplama
- 10 mL kan ya 21 G iğne şırınga aspirasyon tarafından kullanarak sefalik veya şah damarı çizin.
- Aşırı kesme stres önlemek için kan sodyum heparin (75 USP) içeren tüpler aktarmadan önce iğneyi şırıngadan çıkarın. Tüpler birkaç kez yavaşça tersine çevirin yeterli antikoagülan ve kan karıştırma sağlamak için. Pıhtı veya kırmızı hücre toplamları kanıtı için buza örnekleri yerleştirmeden önce kontrol edin.
2. nötrofil yalıtım
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Canlı hücre görüntüleme bu iletişim kuralını kullanan, müfettişler nükleer morfoloji, plazma membran bütünlüğü ve yaşam nötrofil cfDNA varlığı gözlemleyebilirsiniz. Bir hücre impermeant nükleer boya çekirdek asitleri kırmızı hücrelerin hasarlı hücre zarı ile lekeleri. Başka bir hücre permeant boya, bozulmamış plazma membran ile canlı hücrelerde hücre içi nükleik asitler Etiketler. Kendi tedavileri ne olursa olsun tüm bozulmamış nötrofil yeşil görünür ve karakteristik loblu çekirdeklerin 0.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada değişmek içinde çekirdek uyum ve cfDNA serbest bırakmak içinde yaşayan köpek nötrofil hücre permeant boya ve bir hücre impermeant boya kullanarak gözlemlemek için bir protokol mevcut. Bu tahlil en büyük avantajı bu NET oluşumu gerçek zamanlı algılama için yüksek çözünürlüklü mikroskobu canlı nötrofil hücre fiksasyon, olmadan tarafından bu nedenle, vitro NET oluşumu gözlemlemek için basit ve değerli bir araç sağlayan sağlanmıştır. Bu tahlil NET bileşenler tespiti için antikorlar gerektirmez, NETosis türler.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarın Morris hayvan Vakfı (D15CA-907) tarafından finanse edildi. Çalışma fon University of California, Davis, Equine Sağlık Merkezi ve refakatçi hayvan sağlığı merkezi tarafından desteklenmiştir (2016-24-F). Yazarlar Geena Ng onun hakkında yardım almak için rakamlar ve Nghi Nguyen video ile yardımını kabul etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molekül ağırlığı 450.000 – 650.000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Yaşam Bilimleri | 17144002 | |
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu | Su ThermoFisher Scientific | A1285801 | İki değerlikli katyonlarla |
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu | Su ThermoFisher Scientific | 14190136 | İki değerlikli katyonlar olmadan |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Turuncu Floresan Nükleik Asit Lekesi | DMSO'da ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM; geçirgen zarlı hücrelerde lekeler |
| SYTO Green 16 Floresan Nükleik Asit Lekesi | ThermoFisher Scientific | S7578 | DMSO'da 1 mM; Sağlam zarlı hücrelerde lekeler |
| Yüzey Ampları NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poli-D-Lizin kaplı lameller | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm çap |
| Anti-sitrüline histon H3 antikoru | Abcam | Ab5103 | |
| Konjuge olmayan keçi anti-tavşan Fab parçaları | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Özgüllük: IgG (H +L) |
| Anti-Miyeloperoksidaz antikoru | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-fenilin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
Kaynaklar
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
