Aquí, presentamos un protocolo para distinguir murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) linfocitos de células T CD4 + de ingenuo, incluyendo el aislamiento de las células CD4 + T de ingenuo, diferenciación de THGM, y Análisis de las células THGM diferenciadas. Este método puede ser aplicado a los estudios de la regulación y función de las células THGM.
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Artículo de método
In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (THGM)
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Resumen
Resumen
El factor del granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF)-producción de la célula de T helper (THGM) es un subconjunto de células helper T nuevamente identificado que predominantemente segrega GM-CSF sin producir interferón (IFN) γ o interleukin (IL) -17 y se encuentra a juega un papel esencial en la neuroinflamación autoinmune. Un método de aislamiento de ingenuo de células T CD4 + de una suspensión unicelular de esplenocitos y generación de células THGM de las células T CD4 + de ingenuo sería una técnica útil en el estudio de la inmunidad mediada por células T y enfermedades autoinmunes. Aquí describimos un método que distingue las de células T CD4 + ingenuo de ratón en células THGM promovidas por IL-7. El resultado de la diferenciación fue evaluado mediante el análisis de la expresión de citoquinas utilizando diferentes técnicas, entre ellas citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo, una reacción en cadena en tiempo real cuantitativa de la polimerasa (PCR), y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Utilizando el protocolo de diferenciación de THGM tal como se describe aquí, alrededor del 55% de las células expresan GM-CSF con una mínima expresión de IFNα o IL-17. La expresión predominante de GM-CSF de las células THGM más fue confirmada por el análisis de la expresión del GM-CSF, IFNα y IL-17 en los niveles de mRNA y proteína. Así, este método puede utilizarse para diferenciar ingenuo de células T CD4 + t cells GMH en vitro, que serán útiles en el estudio de la biología de la célula de THGM.
Introducción
De células T CD4 + helper (TH) son componentes esenciales del sistema inmune, teniendo papeles cruciales en la defensa del huésped frente a patógenos microbianos, en la vigilancia del cáncer y autoinmunidad1,2,3. Sobre la activación de células T del receptor (TCR), ingenuo de células T CD4 + se pueden distinguir en TH1, TH2, TH , reglamentarios o de 17 células de T (Treg) bajo la influencia de citocinas diferentes ambientes2,4, 5. recientemente, un nuevo subconjunto de células TH , que principalmente produce el GM-CSF, se identificó y nombró THGM6. La diferenciación de las células THGM es conducida por IL-7 a través de la activación de un transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5). Estas células expresan una gran cantidad de GM-CSF al mismo tiempo que una baja expresión de otros TH-célula citocinas firma como IFNγ y la IL-176. GM-CSF fue encontrado para desempeñar un papel crítico en el desarrollo de CD4 + neuroinflamación mediada por células T7,8. En comparación con las células autorreactivas T expresa IFNγ o con IL-17, GM-CSF-expresar T células transferido a tipo salvaje ratones (WT) causadas un inicio anterior de la enfermedad y mayor severidad de la enfermedad. Además, Csf2- / - células de T no pudieron inducir la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) después siendo transferido eventualmente a los destinatarios de la WT, mientras que las células T carente de IFNγ, IL-17A o retenido la capacidad de mediar EAE7. Por otra parte, un bloqueo de GM-CSF con anticuerpos neutralizantes mejoró EAE de severidad de la enfermedad8. Además, una deficiencia de STAT5 en células T en ratones resultó en una menor generación de THGM y, por tanto, en una resistencia de los ratones a EAE desarrollo6. Estos resultados subrayan la importancia de las células de T de GM-CSF-expresandoH en enfermedad autoinmune capensis. Por lo tanto, establecer un método para distinguir las células de T de GM-CSF-expresandoH de células T CD4 + de ingenuo sería importante en el estudio de la patogenia autoinmune neuroinflamación y la respuesta inmune mediada por células T. Sin embargo, un protocolo eficientemente genera células THGM de murino ingenuo que CD4 + no ha sido establecida.
Aquí presentamos un método que distingue las células de THGM murinas de células T CD4 + de ingenuo. Este protocolo describe el procedimiento entero, incluyendo la extracción del bazo de ratón, la preparación de una suspensión unicelular, la selección positiva de CD4, la célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación y la célula de TH diferenciación y análisis. Las T helper células diferenciadas, son analizadas por citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo para determinar la expresión de citocinas a nivel unicelular, de una PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la expresión de citoquinas a nivel de mRNA, y por ELISA para evaluar la expresión de citoquinas a nivel de la proteína. Este método puede ser aplicado a los estudios de Biología de la célula de THGM bajo varias condiciones, tales como EAE, donde GM-CSF juega un papel importante en la patogenesia.
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Protocolo
Todos los ratones utilizados en el presente Protocolo en el fondo genético de C57BL/6 y alojados en condiciones libres de patógenos específicas en la Universidad Nacional de Singapur. Todos los experimentos se realizaron utilizando protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad Nacional de Singapur.
1. reactivos y preparación de Material
- Preparar 500 mL de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 2% de suero bovino fetal (FBS) y ácido etilendiaminotetraacético de 1 mM (EDTA).
Nota: Mantenga el buffer en el hielo a lo largo de todo el procedimiento para obtener resultados óptimos. - Preparar 50 mL de medios RPMI completo con RPMI 1640, 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Utilizar medios RPMI completo que contiene β-mercaptoetanol de 50 μm para la diferenciación de la célula de THGM. Añadir β-mercaptoetanol en una campana de humos.
- Preparar 7,5 mL de una mezcla de anticuerpos anti-CD3e diluyendo valores anti-CD3e concentrado a 3 μg/mL en PBS. Capa de placas de 48 pocillos añadiendo 150 μL de la mezcla de anticuerpos a cada pocillo e incubar la placa a 37 ° C durante al menos 1 hora, o a 4 ° C durante la noche.
- Esterilizar un par de tijeras y fórceps y mantenerlos en etanol al 70% entre las disecciones.
2. preparación de esplenocitos murinos
- Eutanasia el ratón (de 6 a 8 semanas) con un aprobado institucionalmente CO2 asfixia o dislocación cervical. Rocíe el ratón con etanol al 70% y montarlo en un bloque de poliestireno en su parte posterior. Transferir el ratón a un gabinete para proceder con las siguientes medidas de seguridad biológica.
- Mantener la piel usar un par de pinzas y cortar la piel por debajo de la caja torácica en el lado izquierdo de unos 4 cm, utilizando un par de tijeras. Abra el saco peritoneal para exponer el bazo y usar pinzas estériles para extraer el bazo.
- Coloque un colador celular de 70 μm en un tubo de 50 mL y Humedezca previamente con 2 mL de tampón. Coloque los bazos en el colador de la célula (2 – 3 bazos para filtro de una célula) y macerar con el extremo de un émbolo de la jeringa de 5 mL.
- Enjuague el filtro y el tubo varias veces con 1 – 2 mL de tampón de aislamiento celular hasta que todas las células se vuelcan en el tubo. Deseche el filtro de la celda y centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el pellet celular con 5 mL de frío (4 ° C) amonio-cloruro-potasio (ACK) lisis buffer (150 m m de NH4Cl, 10 mM KHCO3, m a 0,1 m de Na2EDTA, pH 7.2-7.4) y mezclarlas suavemente por 2 minutos agregar 10 mL de medios RPMI completo para neutralizar el ACK tampón e inmediatamente centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante después de la centrifugación.
3. aislamiento de T de CD4 + las células usando microesferas magnéticas CD4 y una columna de separación celular
- Resuspender el precipitado de células en 5 mL de tampón de aislamiento celular. Filtrar la suspensión de células usando un filtro de separación previa (30 μm) en un nuevo tubo de 15mL para eliminar cualquier residuo.
- Tomar 10 μL de la suspensión de células y hacer una dilución de 10 x por agregar 90 μL de tampón. Tomar 10 μL de la suspensión diluida de células y mezclar con 10 μL de trypan azul para el recuento celular. Contar las células en un hemocitómetro para determinar el rendimiento de células viables.
- Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
- Resuspender las células en 90 μL de buffer por 107 células. Añada 10 μL de microesferas magnéticas de CD4 por 107 células. Incube las células durante 15 min a 4 ° C. Para obtener resultados óptimos, mezcle la suspensión de células suavemente cada 5 min durante la incubación.
- Mientras que las células están incubando, colocar una columna de separación en el soporte magnético. Humedezca previamente la columna con 2 mL de tampón.
- Al final de la incubación de células/grano, lavan las células con 5 mL de tampón y centrifugue a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender las células en 1 mL de tampón de carga la muestra en la columna de separación celular y dejarla fluir a través de. Utilice un tubo de centrífuga de 15 mL para recoger la fracción de células CD4. Añadir 1 mL de buffer para lavar el tanque antes de que sea seco. Repetir el lavado 2 x.
- Quitar la columna de la separación celular del soporte magnético y colocar en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL. Añadir 2 mL de tampón de aislamiento de la célula a la columna de la separación celular y aplique el émbolo con firmeza para obligar a las células de la columna.
- Centrifugar la fracción a 350 x g durante 5 min a 4 ° C para obtener las células CD4 +. Deseche el sobrenadante.
4. purificación de las células T Naive de CD4 + (CD4+CD25–CD44loCD62LHola) por diferenciación celular clasificación y THGM activado por fluorescencia
- Resuspender el precipitado de células CD4 + obtenido en 500 μl de tampón. Las células se mezclan con una mezcla de anticuerpos conjugados fluorescentes que contienen CD4-PerCp (2,8 μg/mL), CD44-APC (2.4 μg/mL), CD25-PE (2 μg/mL) y CD62L-FITC (10 μg/mL) (tabla 1). Incubar las células en hielo durante 20-30 minutos, mientras que la protección de la luz.
Nota: Las concentraciones de anticuerpos fueron optimizadas previamente en el laboratorio. El número de anticuerpos aparece es para las células de los ratones de 1 – 2. - Después de la incubación, las células con 5 mL de tampón de lavado y centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μl de tampón. Filtro de las células utilizando una malla de nylon.
- Transfiera la suspensión a un tubo de FACS para la clasificación de la célula. Precapa los tubos con 500 μl de tampón FACS.
- Obtener un CD4+CD25–CD44loCD62LHola población (de ingenuo CD4+ T células) al ordenar de FACS. Puerta en CD4+CD25– primeras y luego seleccionadas CD44loCD62LHola células de esta población.
- Recoger el ingenuo CD4+ T fracciones de la célula en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
- Resuspender las células T CD4 + de ingenua a una concentración de 106 células/mL en medios RPMI completo que contiene 50 μm β-mercaptoetanol.
- Aspire los anticuerpos anti-CD3e utilizados para cubrir primero en la placa de 48 pozos. Células de semilla 0,25 millones (250 μL) en cada pocillo con IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 μg/mL) y anti-IFNγ (10 μg/mL) (tabla 1).
Nota: Las concentraciones de citoquinas y anticuerpos fueron optimizadas previamente en el laboratorio para una diferenciación de la célula de THGM. - Incube las células a 37 ° C con 5% CO2 durante 3 días. No cambie el medio durante la incubación.
5. Análisis de las células de ratón THGM generadas In Vitro
- Utilizando un microscopio, comprobar la diferenciación de la célula 3 d después de la diferenciación. Las células de la cosecha y centrifugue a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Lavar las células 2 x con medios RPMI completo.
Nota: Las células diferenciadas son más grandes en tamaño que ingenuo de células T CD4 +. - Resuspender las células en 1 mL de Medio RPMI completo. Tomar 10 μL de suspensión celular y se mezcla bien con 10 μL de trypan azul para determinar el número de células con un hemocitómetro. Se dividen las células diferenciadas en tres pociones restimulation y análisis.
Nota: Tinción intracelular citoquinas y pruebas de ELISA requieren millones células de ≥0.5, y análisis de qPCR necesita ≥ 1 millón. -
Para la tinción intracelular citoquinas, restimulate las células con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) y ionomycin (1 μg/mL) en presencia de un inhibidor del transporte de la proteína (1 μl/mL) por 4-6 h.
- Cosecha de las células y tinción con anticuerpos anti-CD4 (conjugado con PerCP, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100; o conjugado con FITC, 0,5 mg/mL dilución 1: 100) por 30 min.
- Fijar las células con 200 μL de tampón de fijación durante 20 a 60 minutos. Después de la fijación, se lavan las células 2 x con 1 mL de amortiguador de permeabilización.
- Realizar tinción intracelular con anticuerpos contra GM-CSF (conjugado con PE, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100), IL-17A (conjugado con FITC, 0,5 mg/mL, dilución 1: 100; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100), IL-4 (conjugado con APC, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100) y el IFNγ (conjugado con APC, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100) por 30 min en la oscuridad.
- Para un análisis de qPCR de la expresión génica de citoquinas por células diferenciadas, activan las células con limite de placa anti-CD3e (3 μg/mL) (mismo la placa como se describe en el paso 1.3). A las 3 h después de la estimulación, cosechar las células para aislar el ARN total usando un reactivo de extracción fenol RNA para preparar cDNA para la qPCR. El programa utilizado para la qPCR y cartillas se enumeran en las tablas 2 y 3, respectivamente.
- Para el análisis de la secreción de la proteína de citoquinas por células diferenciadas, restimulate las células con limite de placa anti-CD3e (3 μg/mL) durante 24 h (mismo la placa como se describe en el paso 1.3). Cosechar el cultivo celular sobrenadante para IL-17 y GM-CSF ELISA determinar sus concentraciones.
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Resultados
Ingenua de células T CD4 + aisladas de dos ratones C57BL/6 machos de 8 semanas de edad se dividieron en tres porciones. Una porción de las células fue distinguida en las células de THGM siguiendo el protocolo descrito. Otra porción fue cultivado bajo una condición de THGM en presencia de anticuerpos anti-IL-4 (10 μg/mL) para probar la influencia de un bloqueo de la IL-4 en la diferenciación de THGM. La última parte fue cultivada bajo una condición de difer...
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Discusión
Aquí hemos descrito un protocolo de una diferenciación de THGM en vitro de las células del ratón ingenuo CD4 +, seguido de un análisis de las células diferenciadas para validar el método. De nota, bazo y ganglios linfáticos puede utilizarse para ingenuo CD4 + células de T de purificación y la diferenciación de THGM. La expresión de citocina determinada por citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo mostró que alrededor del 55% de las células fueron inducidos a conve...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por becas de la Universidad Nacional salud sistema de Singapur (Oct-12-2014 T1 y T1-2015 Sep-10).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| Capricornio | Inactivado por Calor | FBS-HI-12A | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1ª Base | BUF-2040-10 | Diluido a 1x PBS en agua estéril |
| EDTA | 1ª Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x Tampón | ACKBiolegend | 420301 | diluido en agua estéril |
| Filtro de células | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microperlas | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS columna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| soporte magnético | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Jeringa de 1 mL Centrífuga | Terumo | SS+01T | |
| Eppendorf Eppendorf | 5810R | ||
| Clasificador de células Sony SY3200 | Clasificador | células Sony SY3200 | |
| Tubo de centrífuga cónico de 50 mL | Greiner Bio-One | 210261 | |
| tubo de centrífuga cónico de 15 mL | Tubo | ||
| FACS | Corning | 352054 | |
| placa de cultivo celular de 24 pocillos | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-ratón CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugado anti-ratón CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-humano/ratón CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-ratón CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Cámara de recuento mejorada de Neubauer | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscopio | Nikon Nikon | Elipse TS100 | |
| Purified anti-ratón CD3e anticuerpo | Biolegend | 100314 | |
| Hámster purificado anti-ratón CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Rata purificada anti-ratón IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Anticuerpo anti-ratón IL-4 purificado | Biolegend | 504102 | |
| Proteína recombinante IL-7 de ratón | R& Sistema D | 407-ML | |
| TGF-beta humano recombinante | R& Sistema D | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomicina | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug inhibidor del transporte de proteínas | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Fijación intracelular& Juego de tampones de permeabilización | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-ratón GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-ratón IL-17A Biolegend | 506908 | ||
| APC anti-ratón IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| ratón GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Ratón IL-17A ELISA sin salida | invitrogen | 88-7371-22 |
Referencias
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- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
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