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Biochemistry

Caracterización funcional de carboxilesterasas en casa resistente al insecticida moscas, Musca Domestica

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/58106
Automatic Translation
1, 1
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para producir casa mosca carboxilesterasa proteínas en vitro con un sistema de expresión de baculovirus mediada por células de insectos y caracterizar funcionalmente más adelante su papel en la metabolización de permetrina, de tal modo, que confieren piretroides resistencia mediante la realización de celular MTT análisis y en vitro estudios metabólicos.

Abstract

Metabolismo mediado por la carboxilesterasa se piensa para desempeñar un papel importante en la resistencia a los insecticidas en los insectos varios. Varios genes de la carboxilesterasa fueron encontrados para arriba-regulados en la cepa mosca de casa resistente, mientras que seguía habiendo sus papeles en que confieren resistencia a los insecticidas para ser explorado. Aquí, hemos diseñado un protocolo para la caracterización funcional de carboxilesterasas. Se presentan tres experiencias de ejemplo: (1) expresión y aislamiento de proteínas de la carboxilesterasa a través de un insecto mediada por baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) sistema de expresión celular; (2) torneo de mesas múltiples basadas en células (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromuro) ensayo de citotoxicidad para medir la tolerancia de las células de insecto permethrin diferentes tratamientos; y (3) en vitro estudios metabólicos para explorar las capacidades metabólicas de carboxilesterasas hacia permetrina. El gen de la carboxilesterasa MdαE7 fue clonado de una casa resistente a mosca cepa ALHF y utilizados para construir un baculovirus recombinante para la infección de las células Sf9. Las viabilidades de célula contra permethrin diferentes tratamientos fueron medidos en el ensayo MTT. La tolerancia de la célula mejorada del grupo experimental (células de MdαE7 recombinante baculovirus infectadas) comparado con los de los grupos de control (CAT-recombinante baculovirus infectadas células y GFP-recombinante baculovirus infectadas células) a la permetrina tratamientos sugieren las capacidades de MdαE7 en metabolizan insecticidas, protegiendo las células contra los daños químicos. Además, carboxilesterasa proteínas fueron expresadas en células Sf9 insectos y aisladas para llevar a cabo un estudio metabólico en vitro . Nuestros resultados indican una significativo en la vitro eficiencia metabólica de MdαE7 hacia la permetrina, indicando directamente la participación de carboxilesterasas en metabolizan insecticidas y así que confieren resistencia a los insecticidas en casa vuela.

Introduction

Resistencia a los insecticidas es actualmente un grave problema de casa control de moscas en todo el mundo1,2. Esfuerzos para determinar el mecanismo de resistencia a los insecticidas facilita la mejor comprensión de este tema y así proporcionar nuevas estrategias para efectivamente prevenir o minimizar la propagación de resistencia desarrollo3. Carboxilesterasas, como una de las enzimas de desintoxicación más importantes, han atraído mucho la atención por su participación en el secuestro y metabolizan insecticidas en varios insectos4,5,6. Nuestro estudio anterior ha identificado múltiples carboxilesterasas en casa vuelan y sus niveles de expresión no sólo fueron constitutivamente para arriba-regulados en la cepa ALHF resistente pero también pueden ser inducido a mayores niveles en respuesta a los tratamientos de permetrina7 . Sin embargo, la caracterización funcional de estos genes carboxilesterasa en metabolizan insecticidas aún explorarse.

Desde el primer informe de principios de la década de 19808, un sistema de expresión de baculovirus-mediada gen extranjero ha sido empleado ampliamente debido a su eficiencia de producción de alto valor proteico y proteína eucariota procesamiento capacidades9. Este sistema binario se compone de dos elementos esenciales: el baculovirus recombinante construcción entrega de genes foráneos en las células del huésped y la expresión a gran escala de proteínas interesadas por las células infectadas por el baculovirus recombinante. En las últimas décadas, el sistema de expresión de baculovirus mediada por células ha sido ampliamente utilizado para producir miles de proteínas recombinantes, que van desde enzimas citosólicas a las proteínas de membrana-limitan en insectos y mamíferos las células10. Nuestro estudio anterior ha expresado con éxito múltiples enzimas CYP450 en insectos células Sf9 con este sistema11. En este estudio, construido un baculovirus recombinante carboxilesterasa para infectar insectos células Sf9, exploró la tolerancia celular a permetrina diferentes tratamientos y a gran escala carboxilesterasa expresa proteínas en vitro para funcional exploración. En lugar de investigar múltiples mezclas de isoenzima carboxilesterasa de insectos homogenados adoptados por anteriores estudios12,13, este sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada permite la expresión concreta y aislamiento de proteínas específicas para la mejor caracterización de sus propiedades bioquímicas y estructurales.

El ensayo basado en la sal de tetrazolio (MTT) es un método colorimétrico de alto rendimiento desarrollado y optimizado para medir la viabilidad de las células. Este ensayo se basa en el mecanismo que sólo las células vivas son capaces de metabolizar el reactivo MTT de color amarillo a un precipitado precipitado de color púrpura oscuro, que puede ser analizado por después de disuelto en solventes orgánicos14, 15. Varios más preciso pero requiere mucho tiempo métodos, como la exclusión azul de tripano y la timidina titulación ensayo16,17, se han desarrollado en los últimos años. Sin embargo, el ensayo MTT celular aún en la actualidad es reconocido como el método más rápido y fácil manejo para detectar rápidamente la viabilidad celular. Aquí, utilizamos el ensayo MTT para explorar la tolerancia de la célula contra los tratamientos insecticidas. La mayor tolerancia de las células cuando infectadas con baculovirus recombinante carboxilesterasa fuertemente apoya las funciones metabólicas de carboxilesterasas a los insecticidas, que a su vez, sugiere su participación en la resistencia a los insecticidas.

Además, un ensayo en vitro metabólica también se realizó en este estudio. En comparación con ensayos de carboxilesterasa general que utilizan sustratos comunes tales como acetato de α-napthyl (α-NA) y β-naftil acetato (β-NA) para reflejar actividades hidrolíticas de carboxilesterasas, estudio metabólico en vitro es considerado como una forma precisa medir directamente actividades de carboxilesterasas hacia insecticidas18. Este método se ha empleado con éxito en varios insectos para caracterizar varios cytochrome P450s en asociación con insecticida resistencia11,19,20. Sin embargo, este método ha no aún ha aplicado en estudios de la carboxilesterasa. Con la disponibilidad de la carboxilesterasa proteínas producidas por el sistema de expresión de baculovirus-mediada, podemos realizar un estudio metabólico en vitro de carboxilesterasas hacia permetrina, que puede proporcionar más fuerte evidencia de la participación de carboxilesterasas en confiriendo resistencia a piretroides en casa vuela.

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Protocol

1. expresión y aislamiento de proteínas de la blanco con un sistema de expresión celular de insecto Baculovirus-mediada

  1. Direccionalmente clon punta Roma los productos PCR de las proteínas blanco de moscas domésticas.
    1. Diseño de cartillas de la polimerización en cadena de la proteína verde fluorescente (GFP) y el gen de MdαE7 mosca de la casa basado en sus secuencias y las necesidades especiales del vector elegido (tabla 1).
    2. Utilice una ADN polimerasa termoestable, corrección de textos y cartillas de paso 1.1.1 para realizar una reacción de PCR 150 μL (30 μl de tampón de reacción, 3 μl de 10 mM dNTPs, 1,5 μl de ADN polimerasa, 6 μl de ADN plantilla mosca de casa, 7.5 μl de cebador forward 7.5 μl de cebador inverso, con agua hasta un volumen final de 150 μL). Calor de la reacción de PCR a 98 ° C por 30 s, seguido de 35 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 53 ° C por 30 s y 72 ° C durante 60 s y una extensión final a 72 ° C por 2 min).
      1. Correr un gel de agarosa 1% con 150 μL del producto de PCR.
    3. Impuestos sobre los fragmentos de DNA de la blanco de la agarosa del gel con un bisturí afilado y limpio: 1317 bp MdαE7 y 858 bp para GFP. Purificar el DNA usando el kit de extracción de gel disponibles en el mercado siguiendo el protocolo del fabricante (Tabla de materiales). Disolver el ADN purificado en 15 μl de agua destilada.
    4. Correr un gel de agarosa 1% con 1 μl de DNA purificado para comprobar integridad. Use otro 1 μl de DNA purificado para medir concentraciones con el espectrofotómetro.
  2. Construir un plásmido de entrada para las proteínas blanco
    1. Configurar la reacción de clonación. Mezcla recién purificado productos de DNA del paso 1.1.3 y comercialmente disponible entrada vectores que contienen attL-sitios (Tabla de materiales) en una proporción molar de 1:1 (0.5-2 μl de producto fresco de la PCR a concentraciones de 70-200 ng/μl: vector μl 0.5). Luego añadir 1 μl de solución de sal disponible en el mercado (1,2 M NaCl2 y 0,06 M de MgCl2) y agregue agua hasta un volumen final de 6 μl. mezclar suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
    2. Transferir 4 μL de la clonación de productos de la reacción en el paso 1.2.1 en 50 μl de químicamente competentes de e. coli las células. Incubar en hielo durante 30 minutos shock térmico las células durante 30 s en un baño de agua de 42 ° C sin agitación.
    3. Volver a poner el tubo en hielo para otro 2 minutos Añadir 250 μl de medio de novedosa de temperatura (2% triptona Extracto de levadura 0.5% 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; glucosa 20 mM). Incubar a 37 ° C durante 1 h con agitación suavemente.
    4. Extensión 50-200 μL del cultivo bacteriano en el paso 1.2.3 en las placas selectivas de LB (1 g de triptona 1 g de NaCl 0.5 g de extracto de levadura; 1,5 g de agar disuelto en 100 mL de agua destilada. Autoclave y agregar 0.1% de kanamicina 50 mg/mL). Incubar las placas LB de 16 h a 37 ° C para el crecimiento de la Colonia.
    5. Recoger 5-10 colonias y vuelva a suspenderlos individualmente en 5 μl de agua destilada.
    6. Realizar PCR mediante la adición de 5 μl de tampón de reacción, 0.5 μl de 10 mM de dNTPs, 0.25 μl de ADN polimerasa, 1 μl de colonias suspendidas, 1.25 μl de cebador forward de 10 μm M13, 1.25 μl de cebador inversa de 10 μm del gene de la blanco y agua hasta un volumen final de 25 μl. calor de la polimerización en cadena reacción a 98 ° C por 30 s, seguido de 35 ciclos de 98° C durante 10 s, 53 ° C por 30 s y 72 ° C durante 60 s y una extensión final a 72 ° C por 2 min (tabla 1).
    7. Volver a cultura 3 μl de colonias suspendidas de paso 1.2.5 en medios TB (100 mL de tampón fosfato que contiene 0,17 M KH2PO4 y 0,72 M K2HPO4 con 450 mL de caldo base medio que contenga 6 g de triptona, 12 g de levadura y 2 mL de glicerol, esterilizado, que contiene kanamicina 50 mg/mL de 0.1%) para 16 h. extraer ADN de plásmido ultra puro siguiendo el protocolo del fabricante.
    8. Uso 200 ng/μl plásmido ultra-pura del paso 1.2.7 para comercial Sanger secuenciación con cebadores de avance y retroceso de M13. Verificar la correcta Insercion del gen Diana en vector basado en el mapa de la secuencia proporcionado por el fabricante.
    9. Almacenar las muestras de ADN de plásmido ultra pura secuencia verificada de MdαE7 y GFP en-20 ° C.
      Nota: Estos son los plásmidos ADN de MdαE7 de entrada y GFP.
  3. Construir un baculovirus recombinante mediante la realización de la reacción de recombinación (LR) Lambda.
    1. Respectivamente, mezclar 1 μl del plásmido de entrada de 300 ng/μl ADN de GFP, MdαE7 de paso 1.2.7 o entrada plásmido DNA del gene de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) proporcionado por el kit de transfección celular con 5 μl de comercialmente disponibles (que contiene sitios attL) C término lineal ADN (que contienen sitios attR) en tubos PCR de 250 μl. Añadir el tampón para hacer un volumen total de 8 μl de TE.
      Nota: Las reacciones de GFP y gato fueron utilizadas como grupos de control.
    2. Añadir 2 μl de comercios Lambda recombinación (LR) enzima mezcla (Tabla de materiales) en cada mezcla de paso 1.3.1 para catalizar la reacción de LR. Suavemente mezclar e incubar a 25 ° C durante la noche (≈16 h).
      Nota: La reacción de LR facilita la recombinación de un attL que contiene entrada ADN plásmido con una attR que contiene DNA linear C plazo para generar un virus expresando que contiene B att. Este paso produce el baculovirus recombinante para cada proteína de la blanco.
    3. Diluya 1 μl de los productos de la reacción de LR en el paso 1.3.2 20 X. Realizar la polimerización en cadena usando una cartilla adelante Polyhedrin y V5 atrás primer (tabla 1). Utilice 5 μl de los productos PCR para correr un gel de agarosa al 1% para comprobar la calidad. La figura 1 muestra un ejemplo de producto de la reacción de LR del gen MdαE7.

Figure 1
Figura 1: resultados de ejemplo de reacción de MdαE7 LR por análisis PCR. Diluir 2 μl de reacción de LR 200-fold y 2 μl de dilución junto con el primer avance Polyhedrin y cartilla reversa V5 para realizar una PCR de 25 μl. Utilice 5 μl de los productos PCR para ejecutar el gel de agarosa al 1% para comprobar la calidad de la reacción de LR. un

  1. Transfectar células Sf9 de los insectos
    1. Cultura insecto Sf9 células con 5 mL de medio de crecimiento de célula completa (medio libre de suero con 10% suero bovino fetal (FBS)) en T25 tratan frascos a 27 ° c.
    2. Quite el sobrenadante y lave células conexión inferior con 3 mL de medio de cultivo fresco de la célula completa. Transferir 0,5 mL de células suspendidas de nuevo en un nuevo frasco de T25 tratados. Agregar 4,5 mL de medio de cultivo completo. Incubar a 27 ° C durante 3-4 días hasta la siguiente transferencia.
    3. Semilla 2 mL de insecto fase logarítmica de crecimiento Sf9 células cultura (≈3.0-5.0 × 106 células) uniformemente en el cultivo celular bien. Permitir a las células unir al menos 3 h a temperatura ambiente en la campana.
    4. Compruebe la sujeción del celular, observando con un microscopio de fase invertido 250 X. Retire el medio de cultivo celular y reemplazar con 2 mL de medio insectos de gracia.
    5. Preparar solución de mezcla A transfección (8 μl del reactivo de infección de células disponibles comercialmente (Tabla de materiales) con 100 μl de medio insectos de Grace) y transfección mezcla B de cada gene de la blanco (9 μl de los productos de la reacción de LR en el paso 1.3 con 100 μl de medio insectos sin suplemento de Grace) en 1,5 mL tubos de centrífuga, respectivamente.
    6. Mezcle suavemente mezcla de transfección A y B golpeando los tubos. Incubar a temperatura ambiente durante 35 min en la campana.
    7. Uniformemente, agregar la mezcla del paso 1.4.6 gota a gota sobre las células sembradas de paso 1.4.4. Sello de pozos con cintas e incubar a 27 ° C durante la noche.
    8. Vuelva a colocar 2 mL de medio insectos de gracia con 2 mL de medio de cultivo completo. Añadir 100 μm ganciclovir en cada pozo para seleccionar negativamente contra no-recombinante baculovirus. Pozos con la cinta del sello e incubar a 27 ° C durante 72 h.
    9. Recoge 72 h post infección medio de cultivo celular de cada pocillo y transferir a tubos de centrífuga de 1.5 mL. Centrifugar a 1.500 x g durante 5 min a 4 ° C para extraer células o basura grande.
    10. Transferir el sobrenadante a tubos de centrífuga de 1.5 mL nuevo. Almacenarlas a 4 º C con protección de la luz.
      Nota: Estas son las soluciones madre del virus P1 para cada gene de la blanco.
    11. Amplificar la acción viral de bajo título P1 (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) a una acción viral de alto título P2 (5 × 107-1 × 108 pfu/mL).
    12. Semilla 2 mL de insecto fase logarítmica de crecimiento Sf9 células cultura (≈3.0-5.0 × 106 células) uniformemente en el cultivo celular bien. Permitir a las células unir al menos 3 h a temperatura ambiente en la campana.
    13. Sembrar 5 μl de P1 virus stock obtenido en el paso 1.4.10 en la celda sembrada de paso 1.4.12, respectivamente. Luego, añada 100 μm ganciclovir a cada pocillo. Sello de pozos e incubar a 27 ° C durante 72 h.
    14. Recoge P2 virus soluciones de 72 h post infección. Almacenar a 4 ° C con protección de la luz.
      Nota: Estas son las soluciones P2 virus para cada gene de la blanco.
    15. (Opcional) Repita los pasos 1.4.12-1.4.14 con 5 μl del stock de virus P2 para recoger soluciones P3 virus.
      Nota: Estas son las soluciones stock de P3 virus para cada gene de la blanco.
    16. Almacenar todos los baculovirus construidos a 4 ° C con protección de la luz.
      Nota: El gen de la GFP y gato sirvieron como grupo control. Figura 2 demostraron las muestras de células cuando infectan por baculovirus recombinante GFP en las etapas de amplificación diferentes.

Figure 2
Figura 2: ejemplo de muestras infectadas de Sf9 células en etapas de amplificación de baculovirus diferentes. La figura muestra las células de baculovirus recombinante GFP bajo luz natural y fluorescente luz. En la etapa de infección de P1, la proporción de infección es baja. En la etapa de infección P2, mejoró significativamente la proporción de infección. En la etapa de infección de P3, casi todas las células mostraron síntomas de desprendimiento de la placa de cultivo celular, aumenta de diámetro de la célula, así como el cese del crecimiento celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Expresión a gran escala de las proteínas de la blanco en células Sf9 de los insectos
    1. Cultura 10 mL de células de insecto Sf9 con medio de cultivo completo en frascos no tratadas T25 de registro en la crecimiento de fase.
    2. Añadir 200 μL de solución stock de virus P2 (obtenido en paso 1.4.14) para infectar cultivos de células en el paso 1.5.1 para 72 h.
    3. Recoge el medio de cultivo de 72 horas post infección celular. Centrifugar a 1.500 x g durante 5 min a 4 ° C.
    4. Deseche los pellets sobrenadante y lavar dos veces con 1 mL de tampón de PBS de 0,1 M (pH 7.5).
    5. Completamente disolver el pellet celular con 1 mL de extracción de proteínas de células de insecto y tampón de lisis (Tabla de materiales). Agregar 10% de glicerol en lisis celular. Almacenar inmediatamente a-80 ° C.
    6. Repita los pasos 1.5.1-1.5.5 con P2 solución virus de proteínas CAT para servir como el grupo de control.
      Nota: Repita el paso 1.5 por triplicado para los preparados de proteínas diferentes.

2. un ensayo de citotoxicidad celular MTT

  1. Cultura 5 mL de registro fase crecimiento (1.5-2.5 × 106 células/mL) insecto Sf9 las células con medio de cultivo completo en frascos no tratadas T25.
  2. Añada 25 μl de la solución madre de P1 virus (obtenido en paso 1.4.14) para infectar cultivos de células en el paso 2.1 durante 48 h con agitación suave a 27 ° c.
  3. Preparar 100 mM soluciones estándar permetrina en acetonitrilo. Utilizar acetonitrilo a diluir hasta 50 mM, 25 mM, 12,5 mM y 6,25 mM mediante la adición de 250 μl, 125 μl, 500 μl y 62.5 μl permetrina solución en un volumen total de 1000 μl, respectivamente.
  4. Uniformemente la semilla 200 μL de las culturas de célula infectada del paso 2.2 complementado con 300 μL de medio de cultivo completo en placa de 24 pozos a una densidad de 2 × 105 células/mL.
  5. Añadir 4 μL de solución estándar de permetrina (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM y 50 mM) en cada pozo para hacer una concentración final de 50 μm, 100 μm, 200 μm y 400 μm, respectivamente. Sólo añadir 4 μL de acetonitrilo en pozos para el cálculo de viabilidad de la célula (figura 3).
  6. Sellar las placas con cintas e incubar a 27 ° C durante 48 h con la protección de la luz.
  7. Preparar el reactivo MTT (bromuro de Tetrazolium azul Thiazolyl) 5 mg/mL disuelta en tampón (2,0 g de NaCl, 0,05 g de KCl, 0,36 g de NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g de NaH2PO4, 0,05 g de KH2PO4 disuelto en 200 mL de agua destilada agua, pH 7.5).
  8. Quitar medio de cultivo celular en el paso 2.6 después de la incubación de 48 h sin tocar la capa de células de conexión inferior. Añadir 200 μL de reactivo MTT en el paso 2.7 en cada pocillo. Incubar a 37 ° C por 4 h hasta que precipitados de formazán púrpura oscuro forman en cada pozo (figura 3).
  9. Incubar a 37 ° C por 4 h hasta que el precipitado violeta oscuro precipitados forma en cada pozo. Añadir 500 μl de DMSO completamente disolver precipitados (figura 3).

Figure 3
Figura 3: ejemplo de MTT resultados. Después de 48 h post infección con solución P1 virus de solución de baculovirus recombinante de gato, uniformemente semilla 500 μl las células que expresan genes de gato en una placa de cultivo celular de 24 pozos. Respectivamente, añadir 4 μL permetrina en dosis diferentes (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM y 50 mM) en cada fila para hacer la concentración final de 400 μm, 200 μm, 50 μm y 100 μm. La fila de control fue tratada con acetonitrilo solamente y marcada como CK en la placa. (A) después de 48 h de incubación a 27 ° C, desechar el medio de cultivo de células en la capa superior y reemplazar con 200 μL de reactivo MTT color amarillo. Luego incubar a 37 ° C por 48 h. púrpura oscuro color reducción precipitados forma en cada bien que indica que las células de la supervivencia son capaces de metabolizar el color amarillo reactivo MTT en el precipitado de color púrpura oscuro. (B) 500 μl de disolvente DMSO fue agregado en cada pocillo para disolver el precipitado formado. El valor de absorbancia de cada uno también fue detectado por el espectrofotómetro a 540 nm. Como aumenta la concentración de permetrina, el color poco a poco cambiará de rojo oscuro a rojo claro, lo que sugiere que poco a poco disminuyeron las viabilidades de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Transfiera 200 μL de solución disuelto en placa de 96 pocillos. Medir la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de microplacas (Tabla de materiales).
  2. Calcular la viabilidad celular mediante la comparación de los valores de absorbancia de permetrina tratada células con las de sólo células de acetonitrilo tratado.
  3. Para el grupo control, repita todos los pasos con P2 solución virus de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) baculovirus recombinante obtenida en el paso 1.4.
  4. Repetir 4 veces para las preparaciones de virus diferentes.

3. in Vitro análisis metabólico

  1. Preparar 100 mM soluciones estándar permetrina en acetonitrilo. Utilizar acetonitrilo a diluir hasta 50 mM, 25 mM, 12,5 mM y mM 6,25. Detectar el área de pico correspondiente debajo de cada concentración utilizando HPLC. Crear y calcular la curva estándar de basado en el área de pico con concentraciones diferentes de permetrina permetrina.
  2. Medir las concentraciones de proteína en el paso 1.5 con Bradford métodos21.
  3. Preparar 700 μl de la reacción metabólica con estándar de permetrina de 40 μm y 1 mg de proteínas obtenidas en el paso 1.5 disuelto en solución tampón 0,2 M Tris-HCl (pH 7.4). Incubar a 30 ° C por 2 h con agitación suave. Proteger de la luz.
  4. Calmar la reacción al añadir 700 μl de acetonitrilo helada. Incubar a 30 ° c por otros 30 minutos con agitación suave. Proteger de la luz.
  5. Centrifugar a 16.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente la mezcla de reacción. Recoger el sobrenadante y el filtro membrana 0.45 μm. Transferir el filtrado en frascos de cristal marrón ultraclean para análisis de HPLC.
  6. Ejecutar el HPLC bajo las condiciones óptimas de cromatografía (fase móvil A: 90% acetonitrilo y agua al 10%; Fase móvil B: 5% acetonitrilo ajustada a pH 2.3 con ácido fosfórico al 85%). Gradiente de eluir con un caudal de 1 mL/min y medida en una longitud de onda de 232 nm.
  7. Calcular el porcentaje de agotamiento de permetrina comparando con reacciones sin muestra de proteína añadida.
  8. Utilizar proteína CAT obtenida en el paso 1.5.6 para servir como control.
  9. Repita todos los pasos con preparaciones diferentes de proteínas en paso 1.5.7.

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Representative Results

La viabilidad de las células hacia la permetrina diferentes tratamientos (ensayo MTT)

La citotoxicidad de la permetrina fue examinada en las células MdαE7-recombinante baculovirus infectadas Sf9 (grupo experimental) y CAT-recombinante baculovirus (proporcionado por el kit de baculovirus infectadas) infectado células (grupos control). Las tolerancias de célula mejorada a la permetrina en MdαE7 expresando fuertemente las células soportan las funciones metabólicas de este carboxilesterasa contra insecticidas y así proteger las células contra los daños químicos. En nuestro estudio, la viabilidad de las células contra permethrin diferentes concentraciones (50, 100, 200 y 400 μm) se calculó en comparación con las células tratadas con acetonitrilo solamente. Nuestros resultados mostraron que la viabilidad de MdαE7 expresando las células fue significativamente mayor (desde 86.00% 101.92%) (Figura 4B) que el de las células control (desde 67.59% a 81.43%) (Figura 4A) cuando se expone a la permetrina en diferentes concentraciones, indicando el papel importante de MdαE7 en metabolizar permetrina en células de los insectos.

Figure 4
Figura 4: las viabilidades de insecto células Sf9 bajo tratamientos de permetrina diferentes. (A) la viabilidad de las células del control infectado por baculovirus recombinante gato (B) la viabilidad de las células experimentales infectados por baculovirus recombinante MdαE7. Se realizaron cuatro repeticiones para cada concentración de permetrina. Datos se muestran como media ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

In vitro el metabolismo de la permetrina por MdαE7

Metabolismo de la permetrina fue probada por incubación de 40 μm permetrina solución patrón junto con proteínas de MdαE7 extraído de las células Sf9 infectadas. Las reacciones con las proteínas CAT sirvieron como controles. Se calculó el porcentaje de agotamiento de permetrina en comparación con las reacciones sin enzima añadida. Las reacciones fueron supervisadas por HPLC de fase inversa después de un período de incubación de 120 min. Puesto que la permetrina estándar es en realidad una mezcla de isómeros cis y trans-, dos picos fueron observados en los perfiles cromatográficos de HPLC, con tiempos de elución de 10,67 min y min 10,87 permetrina trans y cis-permetrina, respectivamente (figura 5). El porcentaje de agotamiento de permetrina por las proteínas MdαE7 (39.18±3.78%) fue significativamente más alto que el de proteínas de gato (7.29±0.81%) (Figura 6), que no sólo sea compatible con MTT resultados pero también demuestra las capacidades de MdαE7 en metabolizar permetrina en vitro.

Figure 5
Figura 5: Perfil de la CLAR de permetrina estándar. La permetrina estándar utilizada en este estudio es una mezcla de los isómeros trans permetrina y permetrina cis. Las flechas rojas indican los picos para el isómero trans permetrina y permetrina cis isómero, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: metabolismo In vitro de permetrina por proteínas recombinantes MdαE7 y gato. Se calcularon los porcentajes de agotamiento de permetrina por las proteínas MdαE7 y CAT. Se realizaron tres repeticiones para cada concentración de permetrina. Datos se muestran como media ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En las últimas décadas, sistemas de expresión heteróloga se han utilizado ampliamente para expresar y para aislar grandes cantidades de proteínas, permitiendo la determinación bioquímica y funcional y caracterización de enzimas en vitro. Hasta la fecha, varios sistemas de modelo diferente, incluyendo Escherichia coli, Sacccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisy Spodoptera frugiperda han sido adaptados para la expresión de la proteína recombinante y la elección de la sistema in vitro es crucial para la generación a gran escala de proteínas interesados22,23,24,25. En nuestro estudio, el sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada para generar carboxilesterasas mosca de casa fue elegido porque ofrece un entorno intracelular similar a células de los insectos y mantiene algunas capacidades de procesamiento eucariotas importante 9. a pesar de las ventajas del sistema de expresión mediada por baculovirus, sus limitaciones deben también abordarse. El sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada puede producir proteínas de destino sólo si las células de los insectos fueron infectadas con baculovirus recombinantes construidos. El desarrollo actual de la creación de líneas celulares de insectos estable transformada ha hecho posible no sólo para producir constitutivamente interesadas proteínas en ausencia de infección de baculovirus, sino también para mejorar las capacidades de la célula de glycosylating y plegable proteínas generadas a través de ingeniería de modificaciones de9.

Para investigar mejor los papeles de carboxilesterasas metabolizan insecticidas en las células y protege las células contra los daños químicos, se llevó a cabo el ensayo MTT para medir la citotoxicidad de la célula contra permethrin diferentes tratamientos. Durante este proceso, un montón de parámetros experimentales asociados con el metabolismo de la célula, tales como composiciones medio celular, tasa de crecimiento de la célula, la concentración y consumo de metabolitos de la fuente de energía, puede influir en la reducción de MTT y provocar tal modo inexacto resultados. Para reducir al mínimo la subestimación del ensayo MTT, mantenga el medio de cultivo celular, estado de crecimiento celular y las condiciones de incubación consistente entre diferentes tratamientos experimentales26. Con el fin de determinar los efectos de la viabilidad de la célula causados por la infección de baculovirus en lugar de permetrina, demostró que el proceso de la infección de baculovirus recombinante GFP a células Sf9 de los insectos y encontró que en la etapa de infección P2, las células tienen el más alto proporción de infección con el cociente más bajo de la muerte de la célula comparado con otras etapas de la infección (figura 2). Esto puede explicar mejor la razón de elegir las células en fase de infección P2 para llevar a cabo el ensayo MTT.

Comparando las viabilidades de las células cuando infectan por baculovirus recombinantes MdαE7 y gato en un estudio MTT, encontramos una mayor viabilidad de las células cuando la expresión de proteínas MdαE7, que pueden apoyar mejor a las funciones metabólicas de carboxilesterasas a la permetrina en células de los insectos y proteger las células contra los daños químicos (figura 4). El en vitro Estudio metabólico, que es reconocido como un método directo para reflejar las capacidades metabólicas de carboxilesterasas hacia insecticidas, debe también sido explorado para compensar las limitaciones del ensayo MTT en la mejor caracterización de la proteína funciones metabólicas.

En este estudio, la expresión heteróloga de carboxilesterasas en insectos células Sf9 con un sistema de expresión de baculovirus-mediada, la medición de viabilidades de la célula hacia permetrina diferentes tratamientos por el ensayo MTT y la caracterización de carboxilesterasas a través de un metabolismo en vitro ensayo todos trabajar juntos para proporcionar una estrategia sistemática, científica y precisa para investigar el papel de las enzimas de desintoxicación en los insectos, facilitando así una mejor comprensión del insecticida mecanismos de resistencia y así desarrollar estrategias innovadoras para el manejo de plagas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

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References

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Bioquímica número 138 resistencia a los insecticidas carboxilesterasas sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada ensayo de citotoxicidad análisis de metabolismo in vitro
Caracterización funcional de carboxilesterasas en casa resistente al insecticida moscas, <em>Musca Domestica</em>
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Feng, X., Liu, N. Functional… More

Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

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