Summary
Un anión intercambio método basado en la resina, adaptado para muestreo de bioaerosol basado en el choque de los virus se demuestra el líquido. Cuando se combina con detección molecular aguas abajo, el método permite la detección fácil y sensible de virus de bioaerosoles.
Abstract
Este protocolo muestra un método de muestreo de bioaerosol modificado para requisitos particulares en busca de virus. En este sistema, resina de intercambio aniónico es junto con dispositivos de muestreo de aire líquido basado en el choque para la concentración eficaz de virus cargado negativamente de bioaerosoles. Así, la resina sirve como un paso adicional de la concentración del flujo de trabajo de muestreo de bioaerosol. Extracción de ácidos nucleicos de las partículas virales se realiza directamente en la resina de intercambio aniónico, con la muestra que resulta adecuada para los análisis moleculares. Además, este protocolo describe una cámara de un bioaerosol capaz de generar bioaerosoles cargados de virus en una variedad de condiciones ambientales y que permite el monitoreo continuo de variables ambientales como temperatura, humedad, velocidad del viento y concentración masiva de aerosoles. La principal ventaja de utilizar este protocolo es el aumento de la sensibilidad de la detección viral, evaluada mediante comparación directa con un impactor de líquido convencional sin modificar. Otras ventajas incluyen el potencial de concentrar diversos virus cargado negativamente, el bajo costo de la resina de intercambio aniónico (~$0.14 por ejemplo) y la facilidad de uso. Desventajas incluyen la incapacidad de este protocolo para evaluar la infectividad de resina adsorbe las partículas virales, y potencialmente la necesidad de la optimización de la solución de muestreo líquido utilizado en el impactor.
Introduction
El propósito de este método es proporcionar una plataforma de muestreo de bioaerosol altamente sensible para facilitar la detección molecular de virus cargado negativamente de bioaerosoles. Microorganismos, incluyendo partículas virales, pueden sobrevivir en bioaerosoles durante largos períodos de tiempo1. Bioaerosoles pueden viajar distancias relativamente largas y mantener la viabilidad e infectividad, evidenciada por un brote de legionelosis que se originó de Torres ubicados a una distancia de 6 km de los individuos afectados de refrigeración industrial y dio lugar a 18 fatalidades2. Transmisión indirecta del virus a los seres humanos mediados por bioaerosoles puede ocurrir en múltiples escenarios y se ha demostrado para brotes de norovirus en escuelas y restaurantes3,4. Del mismo modo, bioaerosol transmisión del virus puede ocurrir en ambientes agrícolas como en las granjas de cerdos y aves de corral, con esta ruta de transmisión se considera como un factor importante en el movimiento del virus entre producción instalaciones5, 6 , 7 , 8 , 9.
Efectivo muestreo de bioaerosoles cargados de virus permite la mejora en el diagnóstico rápido y la preparación para la prevención del brote, como se muestra en las manifestaciones en que H5 de bioaerosoles en el animal vivo se detectaron un virus de la influenza los mercados en China y la Estados Unidos10,11. Tecnologías de muestreo de bioaerosol actuales implican a una serie de principios de captura de partículas diferentes y se pueden categorizar ampliamente en impingers, impactadores, ciclones y filtros12. Está más allá del alcance de este protocolo para cubrir exhaustivamente todas las ventajas y desventajas de estas plataformas para muestreo de virus de bioaerosoles; sin embargo, se puede afirmar que la mayoría de estos dispositivos de muestreo no ha sido optimizada para la colección de virus y bacteriófagos13. Además, infectividad de las partículas virales se afectados a menudo negativamente, con impingers líquidos considerados mantener infectividad viral más eficazmente que muestras como impactadores o filtros sólidos14. Sin embargo, una desventaja de choque líquida es el efecto de dilución del blanco, que ocurre porque el virus se recogen en volúmenes relativamente grandes (normalmente ≥ 20 mL) de líquido en el recipiente de colección. Otra desventaja importante implica la eficacia subóptima de impingers líquidos a concentrar partículas < 0,5 μm de tamaño15. Sin embargo, la eficiencia de captura de estos dispositivos puede mejorarse mediante inmovilización en matrices sólidas, como inmovilización puede mejorar la preservación de los ácidos nucleicos virales y de infectividad viral16,17.
Previamente hemos demostrado que la resina del intercambio de aniones es una herramienta eficaz para la captación y concentración de virus en matrices líquidas, incluyendo F-RNA bacteriófagos, virus de la hepatitis A, adenovirus humano y rotavirus18,19 ,20. Según lo definido por el fabricante, la resina de intercambio aniónico utilizada en este trabajo es una resina de intercambio de anión base fuerte poliestireno macroreticular en que amina cuaternario funcionalizados grupos medie atracción y captura de aniones en un medio líquido21 . En consecuencia, la resina de intercambio aniónico se espera capturar virus con cargas superficiales neto negativo, incluyendo muchos de los virus entéricos, virus de la influenza y otros virus relevantes para la salud pública y animal.
El protocolo actual consiste en la adición de resina de intercambio aniónico para un líquido impinger. En este sistema, la resina sirve como paso secundario de la concentración de partículas virales en el líquido impinger. Los ácidos nucleicos pueden ser eluidos directamente en volúmenes pequeños, proporcionando una muestra concentrada para análisis moleculares. Así, la principal ventaja de este método es la mejora en sensibilidad de detección viral, principalmente a través de la reducción en el volumen de la muestra. Además, debido a la inherente captura no específicos de virus cargado negativamente, el método es probable aplicable para la detección de un gran número de virus de interés. Aquí, el método se demuestra cepas vacunales de virus de la influenza tipo B, tipo A y el FRNA colifago MS2 (MS2). Estos virus son detectados posteriormente usando análisis de qRT-PCR estándar como se describió anteriormente22. El usuario final no debe esperar dificultades en la realización de este método, debido a modificaciones existentes en la actualidad equipos no constituyen importantes interrupciones en el flujo convencional de bioaerosol muestreo y análisis.
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Protocol
1. configuración de la cámara de Bioaerosol (ver figura 2)
-
Cargue previamente el líquido impingers con 20 mL de 0.01 M tamponada fosfato salino, pH 7,5 (PBS).
- Añadir 0,5 g de resina de intercambio aniónico y suspender en el PBS de uno de los impingers líquidos, con otro líquido impinger que sirve como control.
- Impingers líquidos de posición en paralelo dentro de la cámara de bioaerosol utilizando soportes de abrazadera con entradas de aerosoles hacia el nebulizador.
Nota: Véase la figura 2 para detalles adicionales. - Ubicar a un monitor de lectura directa aerosoles cerca de los impingers líquidos para medir la concentración en masa (mg/m3) del bioaerosol.
- Ubicar el instrumental de lectura directa adicional (aire interior calidad monitor y Termo Anemómetro) cerca de los impingers líquidos para monitorear las variables ambientales, como temperatura, humedad relativa y viento velocidad, dentro de la cámara del bioaerosol.
- Funcionamiento de ventiladores axiales en las esquinas de la cámara de bioaerosol para facilitar la mezcla del aerosol.
Nota: Los ventiladores axiales corren a una velocidad fija y no ajustables.
2. modelo Bioaerosolization experimentos (ver figura 3)
- Realizar entregas, 10 veces las diluciones de vacuna contra la influenza y bacteriófago MS2 deseado concentraciones en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Nota: Para demostrar el método, 103.5 FFU/mL del tipo A y B influenza virus vacuna cepas y 10 se utilizan5 PFU/mL del bacteriófago MS2. Para determinar los títulos de los inóculos, bacteriófagos son propagados en Escherichia coli HS (pFamp) R y enumerados como se describió anteriormente20. La vacuna comercial contiene cantidades conocidas de cuatro cepas de virus de la gripe atenuados vivos, dos tipo un virus de la influenza y dos virus de influenza tipo B, expresados en unidades de foco fluorescente o FFU. - Preparación de inóculos en el recipiente de vidrio de un nebulizador de chorro de 6 colisión mediante la creación de suspensiones de deseado concentraciones de partículas virales en 100 mL de PBS e instale dentro de la cámara de bioaerosol personalizado.
- Iniciar la instrumentación para medir las variables dentro de la cámara de bioaerosol, tales como temperatura, % de humedad relativa, concentración de dióxido de carbono y viento (generado usando un ventilador axial). Usar a un monitor de lectura directa aerosol concentración en masa dentro de la cámara de bioaerosol de la pista y establecer coherencia en y entre los ensayos.
- Sellar la cámara de bioaerosol y purgar por 10 min con aire filtrado por HEPA.
- Entregan aire filtrado y seco en el nebulizador funciona a 6,9 kPa.
- Generar una concentración objetivo de bioaerosoles viral (vía nebulizador) en cada cámara de bioaerosol ensayo. Para esta demostración, se generan bioaerosoles con una concentración de 5 mg/m3 .
- Una vez alcanzada la concentración en masa del aerosol objetivo, detener la nebulización.
- Operar una bomba de muestreo de aire para cada impinger líquido que ha sido calibrado para un caudal de 12,5 L/min conducta calibración con un estándar primario de flujo antes y después de cada evento de muestreo para garantizar la consistencia en el volumen de muestreo. Fuente de dilución de aire usando una línea de filtrado HEPA situada cerca de la ampolla y mantener presión constante en la cámara.
- Activamente de la muestra la atmósfera de la cámara de bioaerosol durante un período de 40 minutos para lograr un volumen de muestreo de 500 L por muestra.
Nota: Toma de muestras durante 40 min a 12,5 L/min con dos bombas en paralelo permite para muestreo de 1.000 L del bioaerosol. Así, al finalizar el experimento, se espera que la mayoría del aire presente en la cámara de bioaerosol ha sido muestreada y liberados en el medio ambiente mediante un sistema de filtrado HEPA. Esto se evidencia por la disminución en la concentración de partículas. Posterior al experimento, las superficies son descontaminadas con el 10% hogar blanqueador y el 70% de etanol. Indicadores se utilizan en esta demostración; sin embargo, si se conocen organismos patógenos se utilizan en este sistema, medidas de bioseguridad adicionales pueden implementarse según sea necesario.
3. extracción y detección de qRT-PCR
-
Aislar los ácidos nucleicos de resina de intercambio aniónico y, para fines comparativos, el líquido utilizado en impingers líquidos. En este ejemplo, se describe un procedimiento de aislamiento de RNA, pero un protocolo similar podría ser utilizado para el virus de la DNA.
- Aislamiento de ácidos nucleicos de la resina de intercambio aniónico.
- Transferir todo el líquido que contiene la resina del anión intercambio de impactor líquido a un tubo cónico estéril 50 mL.
- Permite la resina para instalarse y decantar lentamente la muestra líquida de la resina de intercambio aniónico. Utilice una pipeta de 1 mL para eliminar todo el líquido restante de la resina de intercambio aniónico.
- De un kit de aislamiento de RNA viral, agregar 560 μl de tampón de lisis viral que contiene RNA transportista directamente a la resina de intercambio aniónico e incubar 10 min a temperatura ambiente con mezcla de periódico.
- Utilizando una pipeta de 1 mL, transferir el viral lisado (el tampón de lisis viral) a una estéril 1,5 mL cónico del tubo y proceder con el ARN aislamiento utilizando un aislamiento de RNA viral kit (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante, excepto que el RNA se eluyó en un volumen total de 60 μL de tampón de elución.
- Aislamiento de ácidos nucleicos de impingers líquidos.
- Pipetee 140 μl de la muestra líquida en un tubo cónico de 1.5 mL estéril y realizar aislamiento de RNA utilizando el kit de aislamiento de RNA viral con arreglo a las instrucciones del fabricante, con la excepción de liberador de RNA en un volumen total de 60 μL de tampón de elución.
Nota: 140 μl es el volumen máximo de la muestra que puede ser procesado con el kit de aislamiento de viral específico de la RNA que empleado aquí en una solo paso preparación.
- Pipetee 140 μl de la muestra líquida en un tubo cónico de 1.5 mL estéril y realizar aislamiento de RNA utilizando el kit de aislamiento de RNA viral con arreglo a las instrucciones del fabricante, con la excepción de liberador de RNA en un volumen total de 60 μL de tampón de elución.
- Aislamiento de ácidos nucleicos de la resina de intercambio aniónico.
- Realizar qRT-PCR para la detección de MS2 y influenza A y B virus como se describió anteriormente23,24. En esta demostración, se utilizan 5 μl de ácido nucleico eluatos por qRT-PCR.
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Representative Results
Figura 1 muestra el principio de captura basados en la carga de virus de bioaerosoles mediante inserción de resina en base líquida impingers. La figura 2 muestra la configuración de la cámara de un bioaerosol. Figura 3 se describen los pasos necesarios para configurar el experimento de aerosolización y medidas para control de calidad. La figura 4 muestra curvas de amplificación para la detección de qRT-PCR de virus cargado negativamente de bioaerosoles. La tabla 1 muestra los cebadores y sondas para qRT-PCR para el virus de ejemplo utilizado en este estudio.
Utilizando virus MS2 y gripe contenidos en la vacuna contra la influenza como modelos en la cámara de medida bioaerosol, impingers líquidos modifican con resina de intercambio aniónico para aproximadamente 3 x a 9 mejoría de detección viral, según el virus, en comparación con la prueba directa de choque líquida22. Como se muestra en las curvas representativas de qRT-PCR amplificación (figura 4), detección de tipo de que un virus de la gripe podría alcanzar hasta 3,26 ciclos antes cuando se utilizó la resina de intercambio aniónico en comparación con la prueba directa del líquido choque. Teniendo en cuenta que en qRT-PCR que es 100% eficiente, una ganancia de un TC corresponde a un aumento de 2 dobleces en concentración objetivo, esta diferencia es equivalente a una mejora de 9.58 x en la detección.
Figura 1: choque líquido junto con resina de intercambio aniónica. Cada uno de los dispositivos de muestreo de bioaerosol modificado incorpora una resina de intercambio aniónico en su diseño. Cada grano de resina es una esfera de 0.5 a 1.0 mm con una superficie porosa, una característica que aumenta la superficie de intercambio de aniones. Grupos funcionales amonio cuaternario permiten captura de iones en medios líquidos, mediando captura de virus con cargas superficiales neto negativo, incluidos los virus influenza y colífagos MS2, que se utilizan en el presente Protocolo como organismos modelo (una colas Bacteriófago se dibuja aquí como un ejemplo de virus capturados). Aislamiento de ácidos nucleicos se realiza directamente en la resina (usando kits disponibles en el mercado), con la muestra conveniente para las estrategias de detección más moleculares (qRT-PCR aquí). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cámara de bioaerosol Custom PDF. A: 6-jet nebulizador suministrado con aire filtrado y seco a una presión de generación de 6,9 kPa; B: ventiladores axiales de para facilitar la mezcla uniforme bioaaerosol; C: monitor de aerosoles identificar las concentraciones de bioaerosol relativa; D: líquido impinger con resina; E: líquido impinger sin resina; F: térmica anemómetro para medir la velocidad del viento; G: monitor de calidad de aire para medir otras variables ambientales como temperatura, dióxido de carbono y porcentaje de humedad relativa; H: bombas de muestreo activo de calibradas a 12,5 L/min; I: puertos de guante neumática sellada para el posicionamiento de equipos de muestreo dentro de la cámara de bioaerosol; J: ventana de observación de. Esta figura fue reutilizada de trabajo previo con el permiso del editor22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: flujo de trabajo del experimento de bioaerosolization. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: resina de intercambio aniónico mejora la qRT-PCR basado en detección de virus cargado negativamente en bioaerosoles. En este ejemplo, virus de la gripe tipo A en una concentración de inóculo de 103.5 FFU/mL fueron aerosolized en la cámara de bioaerosol personalizado hasta la concentración en masa bioaerosol 5 mg/m3. Impingers líquidos con y sin resina participaron simultáneamente a cada muestra (500 L) del bioaerosol. El ARN viral fue obtenido de la resina de intercambio aniónico o del líquido de la impactor y analizarse por qRT-PCR. El experimento fue repetido por triplicado. Los ácidos nucleicos obtenidos de muestras de resina fueron detectados en un Ct medio del 26.76, mientras que muestras de líquido impinger fueron detectadas en un Ct promedio de 30.02 (ΔCt de 3.26). Esta diferencia de Ct es equivalente a una mejora de 9.58 x en la detección de uso de la resina de intercambio aniónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Virus | Nombre de la cartilla | Secuencia de primer | Referencia | |
| MS2 | Fwd GI | 5'-ATCCATTTTGGTAACGCCG-3' | 23 | |
| Sonda de GI | 5'-(6-FAM)-TAGGCATCTACGGGGACGA-(BBQ)-3' | |||
| Rev de GI | 5'-TGCAATCTCACTGGGACATAT-3' | |||
| IAC Fwd (46F) | 5'-GACATCGATATGGGTGCCG-3' | |||
| Sonda IAC | 5'-(Cy5) - CACATTCACCAGGGAGACGCATGAGA-(barbacoa) -3 ' | |||
| Rev de IAC (186R) | 5'-CGAGACGATGCAGCCATTC-3' | |||
| virus de la influenza tipo A | Un virus de influenza universal CDC adelante primer | 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3' | 24 | |
| Un virus de influenza universal CDC inversa primer | 5' AGG ACG TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3' | |||
| Prueba de virus de influenza universal A CDC | 5'-(FAM) - TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-(BHQ1) -3 ' | |||
| virus de la influenza tipo B | Primer avance de CDC universal influenza B virus | 5'-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3' | 24 | |
| CDC influenza universal B virus inversa la cartilla | 5'-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3' | |||
| Sonda de CDC universal influenza B virus | 5'-(JOE) - CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-(BHQ1) -3 ' | |||
Tabla 1: cebadores y sondas utilizadas en este estudio. Todos los cebadores y sondas eran de Friedman et al. 201123 y Selvaraju & Selvarangan 201024.
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Discussion
Este protocolo describe un método para la captura de viral sensible de bioaerosoles utilizando impingers líquidos modificados. El método se ha optimizado para la detección y cuantificación de la carga viral en bioaerosoles. La modificación específica demostrada aquí consiste en la adición de resina de intercambio aniónico líquido contenida en un impinger líquido común. Este método fue desarrollado por su sencillez en el procesamiento de las muestras aguas abajo, mientras que otras técnicas de procesamiento de muestra tales como centrifugación, filtración y métodos basados en la precipitación no ofrecen una gran ventaja. Extracción de ácidos nucleicos se realiza directamente en la resina, obviando la necesidad de elutions de alto volumen y varios pasos de preparación de muestra, en última instancia contribuir a la sensibilidad de detección mejorada del método por reducción de la muestra efectiva volumen. Además, se ha demostrado que inmovilización de partículas virales en sólida superficies pueden contribuir a aumentar la estabilidad del ácido nucleico viral o retención de infectividad viral17,25. Inmovilización puede contribuir más a la captura de mayor eficiencia reduciendo las pérdidas por reaerosolization16. El método puede acoplarse fácilmente con análisis moleculares posteriores (qRT-PCR demostrada aquí). La resina de intercambio aniónico puede campo extraído y enviada a un laboratorio de referencia para el análisis, mientras que el equipo de muestreo de aire puede permanecer dedicado a monitoreo en el área de muestreo. Como el principio detrás del procedimiento consiste en la captura no específicos de virus llevando una carga superficial negativa de red, el método se espera que sea susceptible a la detección de varios virus patógenos de importancia para la salud humana y veterinaria. Como revisando Michen y Graule26, un gran número de virus importantes para la salud pública y animal tiene cargos superficiales neto negativo, con pocas excepciones conocidas, tales como ciertas cepas de rotavirus y poliovirus.
Este protocolo no evalúa directamente el efecto de las condiciones ambientales sobre la sensibilidad de detección; sin embargo, cuando el muestreo de aire se lleva a cabo sobre el terreno, es concebible que variables como humedad relativa y la temperatura pueden afectar la eficiencia de colección en varios tipos de muestreadores de aire12. Así, las condiciones dentro de la cámara de bioaerosol pueden modificarse para adaptarse a estos parámetros ambientales según sea necesario. El método de resina de intercambio aniónico se ha demostrado que efectivamente se concentran varios virus de muestras de agua con una amplia gama de propiedades fisicoquímicas, indicando interferencia de partículas, bacterias y otros ambientales contaminantes debe ser mínimo18. Además, buffers de colección pueden requerir optimización para virus específicos, como en algunos casos se ha demostrado que optimizando el búfer de colección pueden conducir a retención mejorada de estabilidad viral27. Una desventaja principal del método tal como se presenta es el hecho de que no se puede determinar la infectividad viral. Otra desventaja de este protocolo es la incapacidad para evaluar los efectos potencialmente negativos de nebulización y aire de muestreo en estabilidad viral, desecación, corte y adsorción no específica a bioaerosol cámara superficies22.
Los dispositivos de muestreo de bioaerosol modificado podrían ser susceptibles de muestreo sobre el terreno en múltiples escenarios, incluyendo hospitales, escuelas, actividades agrícolas y otros lugares. Debido a modificaciones a equipos de muestreo de aire existentes, se espera que los dispositivos modificados sería fácilmente adoptables por los operadores actualmente muestreo de bioaerosoles en busca de virus. El protocolo es demostrado aquí en un compartimiento de un bioaerosol utilizando virus MS2 y gripe, que son objetivos útiles para el desarrollo de método debido a que representan ejemplos de virus envueltos y no-envueltos, MS2 es reconocido como un sustituto de virus entéricos y son comúnmente empleadas en la evaluación de impingers22,26,27,28,29.
Trabajo futuro implicará la optimización de las condiciones de muestreo (es decir, velocidad de muestreo de aire, amortiguadores de colección) y la inclusión de virus adicionales relevantes en protocolos de prueba.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de la CDC/NIOSH alta llanura Intermountain centro de Sanidad Agropecuaria e inocuidad (5U54OH008085) y el Colorado Bioscience descubrimiento evaluación programa (14BGF-16).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
References
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