여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
만성 골수성 백혈병 (CML) 치료에 tyrosine kinase 억제제 (TKIs)의 데모는 암 치료에 새로운 시대를 예 고 했다. 그러나, 세포의 작은 인구에 반응 하지 않는 TKI 치료 결과 최소 잔여 질병 (MRD); 이 세포를 근절 하기 위해 심지어는 가장 강력한 TKIs 실패. 이러한 MRD 세포 치료에 저항을 개발 하는 저수지 역할을 합니다. 왜 TKI 치료 MRD 셀에 대 한 효과 알 수 없습니다. TKI 치료 동안 MRD 세포의 생존을 지 원하는에 연루는 성장 인자 신호 하지만 기계적 이해 부족. 최근 연구는 높은 c-Fos와 Dusp1 집중 결과로 종양 표현과 MRD 셀에 신호 하는 성장 인자 중재 TKI 저항을 설명 했다. C-Fos와 Dusp1의 유전과 화학 억제 CML를 TKIs에 절 묘하게 과민 한 렌더링 하 고 두 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델에 CML을 치료. 우리는 TKI-민감하고-내성 세포에서 여러 microarrays를 사용 하 여이 대상 유전자 발견. 여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 마우스 모델을 사용 하 여 대상 유효성 검사 메서드를 제공 합니다. 이러한 메서드는 쉽게 유전자 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.
서론
BCR-ABL1 퓨전 oncogene의 제정 티로신 키 니 아 제 활동 하면 CML, 작은 분자 억제제 여 키 니 아 제 활동에 근거를 제공 한다. CML 환자 치료에 TKIs의 성공 타겟된 치료1,2의 개념을 혁명. 그 후, 안티 니 정밀 의학으로 치료는 단단한 종양을 포함 한 다른 여러 악성 종양에 대 한 개발 되었다. 지금까지, 30 개 이상의 kinase 억제제는 다양 한 악성 종양 치료를 위한 미국 국가 FDA에 의해 승인 되었습니다. TKI 치료 질병 억제에 매우 효과적 이다, 그러나 그것은 치료입니다. 게다가, 암 세포의 작은 인구는 치료 기간 동안 지속: MRD3,,45. 완전 한 사 함을 보여도 환자가 결국 결과에 재발 하지 않을 경우 지속적으로 억제 MRD 남아 있습니다. 그러므로, MRD 세포의 박멸 내구성 또는 치료 응답을 달성 하기 위해 필요 합니다. CML은 발암, 합리적인 대상 감독 치료제, 질병의 진행, 그리고 약물 저항 메커니즘, 정밀 의학의 개념을 정의 하기 위한 귀중 한 패러다임을 나타냅니....
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프로토콜
모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC)의 지침에 따라 실시 했다. 인간의 표본 (일반 BM 그리고 CML에서 (p210-BCR-ABL +) 백혈병) 기관 검토 위원회 승인 프로토콜을 통해 얻은 했다 (기관 검토 위원회: Federalwide 보증 #00002988 신시내티 아동 병원 의료 센터) 및 CCHMC, 신시내티 대학에서 기부자 정보 동의.
1. 실시간 정량 분석
- BaF3 셀 인터 루 킨-3 (IL-3)의 원천으로 10 %FBS 10% 지출 WEHI 문화 매체와 보충 RPMI에 성장에서 총 RNA 격리 합니다.
- 로그 단계 (99% 살아) 대우 (IL-3 및 imatinib) 뿐만 아니라 치료 샘플에서 세포를 수확 하 고 3 분 435 x g 에서 원심. 건강과 세포의 성장 단계는 그들의 유전자 식 프로필 극적으로 변경할 수 있습니다 중요 합니다.
- 총 RNA22를 정화 하 여 RNA를 분리. 계량 총 RNA; 그런 다음, DNase 치료23주제. 동일한 양의 RNA DNA-무료 변환 (2 µ g) cDNA 역전사<....
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결과
Oncogene 중독 TKIs의 치료 효능에 연루 되었습니다. 그러나, oncogene 의존 운전 메커니즘 이해 되지 않는다. 우리는 중독을 계획에 관련 된 유전자 구성 요소를 식별 하기 위해 여러 편견된 유전자 식 분석을 수행. 이러한 분석 3 유전자, c Fos, Dusp1, 및 Zfp36, 암 세포는 생존을 위한 종양 신호에 의존 하 고, 따라서, TKI 치료를 구분 하지 않습니다의 upregulation를 공개 했다. ShRNA 중재 최저에 의해 c-Fos와 Dusp1의 downregulation는 달리 TKI 방지에서 약물 감도 복원 하는 충분 한 세포.
백혈병의 치료 대상으로 c Fos와 Dusp1의 역할의 유효성을 검사 하려면 그들의 overexpression BCR ABL1 oncogene를 표현 하는 BaF3 세포를 사용 하 여 처음 확인 됐다. .......
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토론
암 세포의 대량에 대 한 치료 응답 TKI은 티로신 키 니 아 제 oncoprotein 신호는 종양은 중독의 봉쇄에 의해 중재 됩니다. 그러나, 상대적으로 작은 MRD에 기여 하는 암 세포의 소수 oncogene 의존과 치료4를 탈출 하는 방법에 대 한 알려져 있다. 최근 연구는 백혈병에 단단한 기관 종양 약물 저항을 중재 성장 인자 신호 밝혀. 이 다양 한 분자 메커니즘 본질적인 저항10,,1112기초 수 있습니다 제안 합니다. 하는 메커니즘을 이해 하 고 유전자 치료 개발을 위한 목표를 식별, 우리는 포괄적인 전체-게놈 식 프로필 마우스 (BaF3)과 인간 (K562) 셀을 사용 하 여 수행 합니다. 우리, 기본 골 수 샘플은 상당히 이질적인, 그들은 것입니다 마스크 관련 유전자/대상의 신원을 의심 때문에 leukem.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자 BaF3 및 WEHI 세포를 제공 하기 위한 G. Q. 데일리 감사 이며 T. Reya MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP에 대 한 구성. 저자는 M. 캐롤 감사 CML 폭발 위기에서 환자 샘플을 제공 합니다. 이 연구 NCI (1RO1CA155091), 백혈병 연구 재단 및 V 재단, 그리고 NHLBI (R21HL114074-01)에서 석사를 교부 금에 의해 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
fl/fl -/-
558612553356555899554714554723554121트 , , , 의 마우스 코어 시설; ROSACreERT2/c-FosDusp1 제작 사 제작 대학교 대학 병원
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin 재조합 인간 피브로넥틴 단편 | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (마우스 CFU용 메틸셀룰로오스) | 줄기세포 | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (인간 CFU용 메틸셀룰로오스) | 줄기세포 | 4434 | |
| 4-하이드록시타목시펜 | 시그마 | H6278 | |
| 재조합 쥐 SCF | Prospec | CYT-275 | |
| 재조합 쥐 Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| 재조합 쥐 IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| 재조합 쥐 IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| 커큐민 | 시그마 | 458-37-7 | |
| NDGA | 시그마 | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | 애틀랜타 생물학적 | S11150 | |
| 트립신 EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-글루타민 | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL 물 |
| 스톡 Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | 시그마 | S9390 | |
| 프로타민 설페이트 | 시그마 | P3369 | 5 mg/mL 물 |
| 스톡 Trypan Blue 용액(0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro(corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 &뮤; M 아크로 디스크 필터 | PALL | 2016-10 | |
| 70 μ m nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | CO-RO | |
| 포스파타제 억제제 칵테일 2 | Sigma | P5762 | |
| 니트로쿨룰로오스 멤브레인 | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | ||
| CD117 APC | BD | ||
| BD Pharm Lyse | BD | ||
| BD Cytofix/Cytoperm (고정 및 투과화 솔루션) | BD | ||
| BD 펌/워시 (Phospho Flow를 위한 투과화 및 세척 용액) | BD | ||
| phospho p38 | 세포 신호 기술 | 4511S | |
| 총 p38 | 세포 신호 기술 | 9212 | |
| 마우스 IgG 제어 | BD | ||
| Alexa Flour 488 활용 | Invitrogen | A-11034 | |
| 염화칼슘 | Invitrogen | K278001 | |
| 2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| 혈액 모세관 | Fisher | 22-260-950 | |
| 혈액 채취 튜브 | Giene Bio-One | 450480 | |
| 신생아 송아지 혈청 | 애틀랜타 생물학적 | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| 인간 SCF | Prospec | CYT-255 | |
| 인간 IL-3 | Prospec CYT-210 | ||
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
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| MyeloCult (LTCIC 분석을 위한 미디어) | 줄기세포 기술 | 5100 | |
| 하이드로코르티손 나트륨 헤미숙시네이 | 줄기세포 기술 | 7904 | |
| MEM 알파 | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 인슐린 주사기 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 및 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in water |
| Bacto 한천(한천) | Difco | 214050 | |
| Terrific | broth Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| 독시사이클린 차우 | TestDiet.com | 52662 | 수정된 RMH1500, 오토클레이브 가능한 5LK8 0.0625% 독시사이클린 |
| 타목시펜 | 시그마 | T5648 | |
| 요오도니트로테트라졸륨 클로라이드 | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy 혈액 및 조직 키트 | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (녹색 로딩 염료가 함유된 taq 중합효소) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy 미니 키트 (RNA 분리 키트) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit(RT PCR을 위한 DNAse 처리) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis(cDNA 합성을 위한 역전사 효소) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green(qPCR을 위한 녹색 interchalating dye와 taq 중합효소 혼합물) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| 인간 장기 배양 시작 세포 분석 | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO 시리즈 8000 WJ CO2 인큐베이터 | Thermo scientific | ||
| 스윙 버킷 로터 cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 자동 세포 계수기 | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler, Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System(겔 및 웨스턴 블롯용 이미징 시스템) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet(볼드 카운터) | Drew-Scientific | ||
| LSR II(FACS 분석기) | BD | ||
| Fortessa I (FACS 분석기) | BD | ||
| FACSAriaII (FACS 분류기) | BD | ||
| 자석 스탠드 | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | 클라우디아 휘트너 박사 s 랩 | ||
| 보이J | CCHMC | ||
| C57Bl/6 | CCHMC의 Jackson Laboratory | ||
| NSGS | 마우스 코어 시설 | ||
| 사내에서 | |||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | 내에서 | ||
| Cells | |||
| BaF3 | George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ 및 Normal CD34+ cells | 신시내티 |
참고문헌
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. E....
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재인쇄 및 허가
