Denne protokol beskriver en netto skimmel-baseret metode for at oprette tre-dimensionelle stillads-fri hjerte væv med tilfredsstillende strukturelle integritet og synkron slå adfærd.
Denne protokol beskriver en roman og let netto skimmel-baseret metode til at oprette tre-dimensionelle (3-D) hjerte væv uden yderligere stillads materiale. Human-induceret pluripotente stamceller-celle-afledte cardiomyocytes (iPSC-CMs), menneskelige hjerte fibroblaster (HCFs) og menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs) er isoleret og bruges til at generere en cellesuspension med 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs. De er co kulturperler i et ultra-lavt vedhæftet fil “hængende drop” system, som indeholder micropores til kondenserende hundredvis af spheroids ad gangen. Cellerne samlede og danner spontant slå spheroids efter 3 dage med fælles kultur. Spheroids er høstet, seedet i en roman støbeform hulrum og kulturperler på en shaker i rugemaskinen. Spheroids blevet en moden funktionelle væv ca. 7 dage efter såning. De deraf følgende lag væv består af sammenvoksede spheroids med tilfredsstillende strukturelle integritet og synkron slå adfærd. Denne nye metode har et lovende potentiale som en reproducerbar og omkostningseffektiv metode til at oprette manipuleret væv til behandling af hjertesvigt i fremtiden.
Målet med aktuelle hjerte vævsmanipulering er at udvikle en behandling for at udskifte eller reparere struktur og funktion af tilskadekomne Myokardie væv1. Metoder til at skabe 3D-hjerte væv modeller udstiller de vigtige kontraktile og elektrofysiologiske egenskaber af indfødte hjerte væv har hastigt ekspanderende2,3. En række forskellige strategier er blevet undersøgt og anvendes i undersøgelser4,5. Disse metoder spænder fra brugen af specifikke syntetiske og naturlige bioaktive hydrogels, såsom gelatine, kollagen, fibrin og peptider6, at bio-blæk deposition teknologier2 og bioprinting teknologier7.
Det har vist sig at stillads-gratis metoder kan producere sammenlignelige væv som biomateriale-baserede metoder, uden ulemperne at integrere udenlandske stilladser materiale8. Oren Caspi et al. demonstreret, at indarbejdelsen af forskellige typer af celler giver mulighed for generation af stærkt vaskulariserede human engineering hjerte væv9. Hagen et al. udviklet en 3-D udskrivningsmetoden for kardiale patch skabelse fra spheroids. Resulterende patches er sammensat af cardiomyocytes, fibroblaster og endotelceller i en 70:15:15 forholdet10. Spheroids har vist sig at være effektiv “byggesten” af stillads-fri hjerte væv skabelse, som de er resistente mod hypoxi og besidder tilstrækkelig mekanisk integritet for implantation11,12. Tidligere undersøgelser har påvist flere fabrikation metoder til oprettelse af sfæroide, herunder brug af hængende drop metode, spinner kolber13, mikrofluid systemer14og ikke-tilhænger kultur overflader ubestrøget eller bestrøget med Agarosen mikro-forme15. I denne protokol, vi bruger hængende drop enhed, som indeholder micropores til kondenserende hundredvis af spheroids ad gangen.
Denne undersøgelse præsenterer en roman og effektiv stillads-fri metode til oprettelse af hjertets væv, som omfatter manuelt såning af spheroids i en firkantet støbeform hulrum og inkubere væv på en shaker til modning. Under sædvanlige statisk kultur er ilt diffusion begrænset til de ydre aspekter af væv konstruktion, hvilket resulterer i central nekrose. Dog med den netto mug, er alle spheroids seedede i formen nedsænket i medierne med en konstant fluidic bevægelse, giver mulighed for øget udbredelse af næringsstoffer og ilt. Derudover denne skimmel-baseret metode giver mulighed for samtidig oprettelse af forskellige størrelser væv pletter med minimal manuelle indsats og den deraf følgende væv let kan fjernes fra formen. Denne nye metode giver mulighed for effektiv og reproducerbare oprettelsen af stillads-fri, flerlaget hjerte pletter.
Betydningen af denne metode ligger i dens reproducerbarhed og effektiviteten af den resulterende flerlaget hjerte væv. I feltet i hjertets vævsmanipulering er en af de nuværende mål at identificere en metode til at konstruere slå, flerlaget og funktionelle 3D-hjerte patches. Vi rapporterer en effektiv og reproducerbar metode til oprettelse af flerlaget hjerte væv af direkte manuel såning af spheroids sammensat af cardiomyocytes, endotel celler og fibroblaster i en roman netto støber. Netto formen anvendes i denne…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender den følgende finansieringskilde: magi at sager fonden for hjerte-kar-forskning.
Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |