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方法文章

用于产生疾病特异性抗体的抗原性脂质体

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DOI：

10.3791/58285

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2018年10月25日

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1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了抗原性脂质体纳米颗粒的制备方法及其在体外和体内刺激B细胞活化的应用。in vitro 和 in vivo 实验均诱导出稳定且强烈的抗体反应，从而建立了一种新的花生过敏模型。该抗原性脂质体制备方案可推广应用于不同抗原及免疫模型。

摘要

抗体反应为多种病原体提供了关键的保护性免疫。目前，人们仍高度关注如何通过疫苗接种诱导强效的抗体反应，以及了解在过敏和自身免疫性疾病中致病性抗体反应是如何产生的。诱导强效的抗原特异性抗体反应并不总是容易实现。在小鼠模型中，通常需要多次使用佐剂进行免疫，这会导致诱导抗体水平存在较大变异性。一个典型的例子是花生过敏的小鼠模型，若能建立更稳定且可重复、同时减少小鼠使用数量和佐剂使用的模型，将具有显著优势。本文介绍了一种高度可重复的花生过敏过敏性休克小鼠模型。该新模型依赖于两个关键因素：（1）将来自花生致敏小鼠的抗原特异性脾细胞过继转移至未经致敏的受体小鼠，从而在大量小鼠中标准化抗原特异性记忆B细胞和T细胞的数量；（2）随后用一种呈递主要花生过敏原（Ara h 2）的脂质体纳米颗粒形式的强效多价免疫原对受体小鼠进行加强免疫。该模型的主要优势在于其高度可重复性，最终减少了每项研究所需使用的动物数量，同时降低了接受多次佐剂注射的动物数量。这些免疫原性脂质体的模块化组装方式，使其能够相对容易地适配于其他涉及致病性抗体的过敏或自身免疫疾病模型。

引言

食物过敏影响着美国8%的儿童，且在过去十年中患病率呈上升趋势1。花生过敏影响约1%的儿童，且通常不会随年龄增长而自然缓解2。尽管目前已有多个针对食物过敏治疗的临床试验正在进行，包括口服免疫疗法（OIT）、舌下免疫疗法（SLIT）和表皮免疫疗法（EPIT），但尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的用于使花生过敏个体脱敏的治疗策略3,4,5,6,7,8。因此，过敏个体必须严格避免接触过敏原，以防发生过敏性休克。关于食物过敏的致敏途径及其发病机制，仍有许多问题有待阐明。

小鼠模型是研究过敏机制以及开发新的耐受性疗法和脱敏疗法的重要工具9,10,11,12。这一点尤为突出，因为人类中的主要花生过敏原（Ara h 2；Ah2）也是多种已建立的小鼠模型中的主导过敏原13,14。尽管花生过敏的小鼠模型在研究致敏和耐受机制方面具有不可估量的价值，但其缺点在于模型结果可能存在变异性，且通常需要使用佐剂。增强免疫原的效力是降低此类模型内在变异性的可行策略之一。由于B细胞可被多价抗原强烈激活，因此展示过敏原的抗原性脂质体是一种理想选择，因其不仅可通过B细胞受体（BCR）激活B细胞，还具备被抗原呈递细胞非特异性摄取后高效启动T细胞应答的特性。

本文介绍了一种简便且模块化的策略，用于将蛋白质抗原偶联至脂质体纳米颗粒的详细实验方案。利用抗IgM Fab片段作为替代抗原，我们展示了此类抗原性脂质体在刺激B细胞活化方面的强大能力。展示Ah2抗原的抗原性脂质体被用于建立一种新的小鼠敏感性模型。在该模型中，将经证实对花生过敏的小鼠的脾细胞（包含花生特异性记忆B细胞和T细胞）转移至未致敏的同源小鼠体内。通过向受体小鼠注射偶联了Ah2的脂质体，诱导产生针对Ah2的抗体，从而激发记忆性抗体应答。随后仅需一次可溶性Ah2加强免疫，这些小鼠在再次接触Ah2时，Ah2特异性抗体即可引发强烈的过敏性反应。由于发生过敏反应的小鼠表现出高度一致的反应性，且未接受佐剂处理，该方法是一种理想的小鼠花生过敏模型，研究结果提示该策略可能也适用于其他由针对过敏原甚至自身抗原的抗原驱动的小鼠模型。

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方案

将蛋白质与脂质偶联并将其整合到脂质体中的通用方法主要基于早期的研究工作15。下述所有动物实验程序均已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。用于花生过敏模型的所有小鼠均为购自3周龄的雌性BALB/cJ小鼠。阿尔伯塔大学动物护理和使用委员会（ACUC）已批准涉及使用至少6周龄C57Bl/6小鼠脾脏进行离体（ex vivo）分析的实验。

1. 蛋白质抗原与聚乙二醇化脂质的偶联

  1. 将3 g分子筛范围为1,500–30,000道尔顿（Da）的交联葡聚糖凝胶珠加入250 mL真空烧瓶中。加入60 mL磷酸盐缓冲液（PBS），并用磁力搅拌子持续搅拌。密封烧瓶后连接真空泵，在搅拌器上抽真空至少1 h以进行脱气。
  2. 在1.0 cm × 30 cm的玻璃层析柱中（旋塞关闭），加入PBS冲洗层析柱。打开旋塞，排空柱内液体。洗涤后，将脱气的珠状悬液加入层析柱中。持续加入悬液，直至填料高度达到约24 cm。
  3. 当柱子上方含有约4–5 cm的PBS液面时，准备好以下步骤。
    1. 通过测量一段足够长的管子，使其能够延伸至高出柱子顶部1–2英尺的架子，并形成一个从柱子底部附近下降后返回柱子顶部的回路，从而建立重力流动虹吸系统。在管子的一端安装一个翻转塞，使管子的一侧保持开放。将开放端插入装有500 mL PBS的瓶子中，并将瓶子放置在柱子上方的架子上。
    2. 取下带有翻转止流夹的一端，连接10 mL注射器。打开管路上的翻转止流夹阀门，通过导管吸取PBS。当PBS行进至导管四分之三长度时，迅速取下注射器，并将翻转止流夹安装到柱子顶端——此时液体应流入层析柱中。
      注意：柱子上方残留的 PBS 液面高度应保持在 1 至 3 cm 之间。洗涤柱子的最小体积为 3 个柱体积。
  4. 根据蛋白质的分子量（MW）确定需与脂质连接的蛋白质量（摩尔数）。
    注意：此处使用山羊抗小鼠IgM（其本身为IgG）的Fab片段作为B细胞多克隆刺激的通用替代抗原。因此，山羊IgG的Fab片段分子量约为48千道尔顿（kDa），市售总量为1.3 mg，故需连接的蛋白量为27.1 µmol。
  5. 测定目标蛋白的消光系数。若未知，可使用分光光度计测定蛋白在280 nm处的吸光度，并将A280 将该值除以步骤1.4中计算出的摩尔数。
    注意：山羊IgG的Fab片段在280 nm处的消光系数为64,600 M⁻¹·cm⁻¹。-1.
  6. 为确保去除含胺缓冲液的痕量残留，将蛋白质在步骤1.1–1.3中制备的层析柱上进行脱盐，并将蛋白质组分收集至1.5 mL微量离心管中（每管约500 µL）。
    1. 关闭连接到柱子顶部的翻转停止阀，并取下柱子的上部。如果柱子底部的翻转停止阀尚未打开，则将其打开，并等待 PBS 的液面升至凝胶珠顶部。
    2. 使用玻璃巴斯德吸管将目标蛋白缓慢加至珠子上层，注意尽量减少对珠子上层的扰动。
    3. 当蛋白溶液的“液面”到达凝胶珠顶部时，轻轻加入 1 mL PBS 通过 巴斯德移液管。重复三次。加入PBS以形成4–5厘米的液柱，并重复步骤1.3以洗涤层析柱。
      注意：如果确定不存在含胺缓冲液，则可跳过此步骤。
  7. 通过测定 A280 值确定含有蛋白质的组分，并合并蛋白回收率约为 90% 的组分。
    注意：此步骤通常会使蛋白质稀释1.5–2倍。合并后应测定蛋白质浓度。如有必要，可在此步骤使用离心浓缩装置对蛋白质进行浓缩。
  8. 加入2.5摩尔当量的异双功能交联剂至蛋白质中。
    1. 首先，称取约 5 mg 的琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯（SPDP，分子量 = 314 g/mol）至微量离心管中。为确定溶解 SPDP 所需体积，取蛋白质的摩尔浓度乘以 250 倍，以配制 100 倍浓缩液，使其在反应中达到 2.5 倍的摩尔过量。
      注意：例如，如果蛋白浓度为 50 µM，则需要 12.5 mM 的 SPDP 溶液。对于 5 mg 的 SPDP，相当于加入 1.27 mL 二甲基亚砜（DMSO）。
  9. 以1:100的稀释比例将SPDP加入目标蛋白中，在室温（RT）下置于振荡摇床上反应约1小时。
  10. 为去除多余的SPDP并保护后续还原步骤中蛋白质内的内源性二硫键，使用pH 5.5的100 mM醋酸钠（NaOAc）缓冲液对步骤1.1–1.3中制备的层析柱进行平衡和洗涤，或单独制备一个仅用于该缓冲液的相同层析柱。
  11. 孵育1小时后，将蛋白质在预平衡的柱子上用100 mM NaOAc进行脱盐。此步骤的操作方式与步骤1.6完全相同，唯一区别是使用100 mM NaOAc（pH 5.5）作为洗脱液。收集各组分，测定A280，合并上清组分。用 PBS 洗涤层析柱。
  12. 用双蒸水配制 2.5 M 的 DTT（分子量 = 154 g/mol）溶液2O). 向合并的蛋白组分中加入 25 mM DTT，孵育 5–10 分钟。
  13. 测量 A280 蛋白质的浓度，并将其除以消光系数。同时，测定A343. 根据蛋白质的摩尔浓度计算连接比率（A280）和连接子（A343).
    注意：若使用 Nanodrop 分光光度计，请关闭 A340 自动校准功能。A343 测量代表吡啶-2-硫酮基团的吸光度（消光系数 = 7550 M⁻¹·cm⁻¹）-1) 可被 DTT 从 SPDP 交联剂上解离下来。在多种蛋白质上使用 2.5 倍摩尔过量的 SPDP 进行反应时，通常可达到 1.2–1.5 的连接剂与蛋白质摩尔比。
  14. 将混合的组分通过已用 PBS 洗涤过的层析柱（方法如上所述）。收集各组分，测定 A280，合并上层组分。合并后通过A280测定蛋白质浓度。
  15. 制备DSPE-PEG(2000)-Maleimide（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]-马来酰亚胺）。该试剂将以10:1的摩尔比加入蛋白质中。配制DSPE-PEG(2000)-Maleimide的100倍浓缩储备液以达到所需浓度。
    1. 例如，如果在步骤1.14后蛋白浓度为10 µM，则配制10 mM的DSPE-PEG(2000)-Maleimide储备液。准确称取DSPE-PEG(2000)-Maleimide（分子量 = 3000 g/mol），加入适量DMSO溶解。可多次轻柔涡旋并超声处理，以确保其完全溶解。
  16. 确定步骤1.14中各组分的总体积，并小心将溶液转移至一个小的（10–25 mL）圆底烧瓶（RBF）中。向蛋白溶液中加入适量的100倍浓缩DSPE-PEG(2000)-Maleimide，使终浓度为1倍、摩尔过量10倍。轻轻涡旋混合溶液，确保DMSO充分分散。
  17. 在氮气氛围下，于密封的圆底烧瓶中过夜反应。使用橡胶隔膜密封，并置于通风橱中。
    1. 用连接真空泵的3 mL注射器（装有20 G针头）刺穿管路末端的隔膜以抽出内部气体，开启真空泵抽气3–5秒。
    2. 用氮气置换气氛。将连接在已截去一半的3 mL注射器上的气球充满氮气，并接上20 G针头。穿刺隔膜，向圆底烧瓶内通入氮气以置换瓶内气氛。重复抽换气体一次，即再次抽除空气并充入氮气，随后将充满氮气的气球保持连接过夜。
  18. 在1.0 cm × 50 cm的玻璃层析柱中，另制备一根分离范围为4,000–150,000 Da的交联葡聚糖凝胶珠柱（参照步骤1.1–1.3）。
  19. 次日，将步骤1.17中准备的圆底烧瓶中的蛋白质取出，并按照步骤1.6所用方法，通过步骤1.18中的交联葡聚糖凝胶珠柱进行层析。
    注意：上样至层析柱的总体积不应超过 2 mL。若反应体系较大，应分为两份分别上样至两个独立的层析柱，或使用直径更大的层析柱进行纯化。
    1. 收集组分，测定 A280合并上层组分，并测定蛋白质浓度。脂质的存在不会影响测定结果。
  20. 将最终合并的脂质结合蛋白组分于 4 °C 保存，直至使用前。

2. 脂质体的制备

  1. 称取以下脂质：DSPE-PEG(2000)（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]，分子量 = 2805.5 g/mol）；胆固醇（3β-羟基-5-胆甾烯，5-胆甾烯-3β-醇），分子量 = 386.7 g/mol；以及 DSPC（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱），分子量 = 790.1 g/mol。用氯仿分别配制浓度为 5 mg/mL 的 DSPC 溶液、4 mg/mL 的胆固醇溶液和 2 mg/mL 的 DSPE-PEG(2000) 溶液。
  2. 确保脂质体中各脂质的摩尔比为：57% DSPC、38% 胆固醇和 5% DSPE-PEG(2000)，如表1所示。
    注意：控制脂质体上抗原的量非常重要，通常范围为 0.01–0.1%。在表1中，使用了 0.1% 的与聚乙二醇化脂质连接的山羊抗小鼠 IgM Fab 片段。必须考虑在步骤 1.15 中加入蛋白时所添加的 DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺的 10 倍摩尔过量，以确保聚乙二醇化脂质的总量不超过 5%。
  3. 在制备用于挤出的脂质时，需考虑最终脂质的总量（µmol）。参见表1，了解如何计算总脂质浓度为 1.25 µM 的脂质体制备过程中各脂质的摩尔浓度。
  4. 在计算出每种脂质所需加入的准确量后，将所有脂质溶液转移至一支 12 mL 的硼硅酸盐玻璃试管中。
  5. 小心吹除氯仿。
    1. 使用步骤 1.17.1 中准备好的导管和带针头的 3 mL 注射器，小心地用氮气吹除试管中的氯仿。一手轻轻将氮气流吹向溶液，同时另一手缓慢旋转试管。注意避免溅出或使液体沿管壁上升过高，否则在下一步中可能难以完全溶解。
  6. 向每支试管中加入 100 µL DMSO，并将溶液在-80 °C 冷冻后进行过夜冻干。用防静电实验室擦拭纸覆盖试管口，用橡皮筋固定后置于 -80 °C 冷冻。

3. 脂质体挤出

  1. 将含有脂质连接蛋白的 1 mL PBS 加入含有脂质的 12 mL 管中。在超声水浴中对溶液超声处理约 30 秒至 1 分钟。每次超声后休息 5 分钟或更长时间，重复 3–4 次。
  2. 按照制造商说明准备挤出器。
    1. 将滤膜支撑片放入内层膜支撑结构中，在石蜡膜上滴加数滴 PBS（每滴 10 µL）。使用镊子夹住滤膜支撑片边缘，将其浸入 10 µL 液滴中。
    2. 将滤膜放入 O 型圈内，两侧均需如此操作。用镊子夹住 0.8 µm 滤膜边缘，浸入 10 µL 液滴中，并用 PBS 涂覆 O 型圈外侧。将 0.8 µm 滤膜轻轻放置在 O 型圈上，确保滤膜不超出内层膜支撑结构的边缘。
  3. 将挤出器加热块置于加热板上以预热挤出器。将加热板调至低温档，使加热块升至所需温度。为避免蛋白质聚集的潜在问题，加热温度不得超过 37 °C。
  4. 将超声处理后的样品加载至已安装在挤出器中的一个挤出用注射器内。将另一支空注射器插入挤出器的另一端。确保空注射器的活塞处于零刻度位置。当脂质通过聚碳酸酯 0.8 µm 膜被挤出时，空注射器将逐渐充满。尽量避免气泡反复通过滤膜。
  5. 将组装好的挤出器放入加热块中。轻轻推动装有脂质的注射器活塞，使液体进入空注射器。根据脂质浓度不同，推动可能较为费力。重复此过程 20 次。
  6. 从加热块中取出组装好的挤出器。缓慢将装有样品的注射器从挤出器上取下，注意收集取下过程中可能泄漏的脂质。将脂质体转移至洁净小瓶中。使用聚碳酸酯 0.2 µm 和 0.1 µm 滤膜重复步骤 3.4–3.6。
  7. 制备一根尺寸为 0.7 x 50 cm2、分离范围为 0.7–10 兆道尔顿（MDa）的交联琼脂糖珠层析柱，并用 PBS 平衡。加入脂质体并按步骤 1.6 进行操作。含有脂质体的组分在 250–400 nm 波长范围内的光透射率会降低。
  8. 将脂质体在 4 °C 下保存，切勿冷冻。

4. 钙流检测抗原性脂质体诱导的B细胞活化

  1. 根据机构标准操作程序，通过二氧化碳（CO2）或过量异氟烷对小鼠实施安乐死。通过颈椎脱位确认小鼠已安乐死。
  2. 使用70%乙醇对手术器械和小鼠尸体进行消毒。使用10 cm长、0.8 mm尖端的弯头虹膜镊，将覆盖胸腔的皮肤与肋骨分离。使用10 cm长的直头解剖剪进行远端双侧切口。
  3. 使用弯头虹膜镊和解剖剪从腹腔中取出脾脏。去除脾脏周围的脂肪组织，然后将其放入含有RPMI1640培养基（含1%胎牛血清（FCS）和青霉素-链霉素）的15 mL聚苯乙烯锥形管中。
  4. 将脾脏和培养基转移至置于50 mL锥形管上的40 µm细胞筛网上。使用3 mL注射器活塞的橡胶端轻轻研磨脾脏。用培养基冲洗40 µm细胞筛网。重复此过程，直至筛网上仅剩脂肪组织。用3–5 mL培养基冲洗筛网，以提高细胞回收率。
  5. 将细胞匀浆在室温下以300 × g离心5分钟。离心后弃去上清液，向沉淀中加入10 mL 1×红细胞裂解缓冲液。用移液器吹打混匀，在室温下静置2–3分钟，然后在室温下以300 × g离心5分钟。
  6. 弃去上清液，将去除红细胞的脾细胞重悬于10 mL培养基中。使用血细胞计数板或其他细胞计数设备测定总细胞数。按上述方法通过离心收集细胞。
    注：脾细胞负载Indo-1的理想终浓度为10–20 × 106 个细胞/mL，但也可使用较低浓度。
  7. 将脾细胞以15 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于钙流负载缓冲液中（RPMI1640培养基含1% FCS、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM 氯化镁（MgCl2）、1 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）和5%青霉素-链霉素）。加入1.5 µM Indo-1（来自1 mM DMSO储备液），反复倒置混匀。避光，于37 °C水浴中孵育30分钟。
  8. 30分钟孵育后，加入5倍体积的钙流负载缓冲液。在室温下以300 × g离心7分钟。
  9. 为对B细胞设门，将细胞与1:200稀释的抗小鼠CD5-PE和1:200稀释的抗小鼠B220-PE/Cy7在0.5 mL负载缓冲液中于4 °C避光染色20分钟。
  10. 用钙流负载缓冲液洗涤脾细胞，在室温下以300 × g离心7分钟。将细胞重悬于钙流运行缓冲液（含1% FCS、1 mM MgCl2和1 mM 氯化钙（CaCl2）的Hank’s平衡盐溶液（HBSS））中，浓度为10–20 × 106 个细胞/mL。置于冰上避光保存，直至准备上流式细胞仪检测。
  11. 使用未染色和单染对照设置流式细胞术补偿。
    1. 运行染色后的细胞以正确设置门控（见图2A）。设置Indo-1（紫光）vs. Indo-1（蓝光）散点图，调节Indo-1通道的电压，使细胞染色呈45–60°斜率，以最大化B细胞刺激后Indo-1紫光与蓝光比值变化的信噪比。
      注：确保电压不过高，避免大量细胞（>5%）堆积在图的顶端。
    2. 创建一个对角门，覆盖图中左上区域（Violet+Blue-），确保未刺激时门内细胞比例<10%，理想情况下刺激后应升至>75%。
  12. 将0.5 mL细胞加入带盖的5 mL圆底聚苯乙烯管（荧光激活细胞分选（FACS）管）中，在水浴中37 °C预热3–5分钟。将FACS管放入连接循环水浴的37 °C水套室中。
    1. 将FACS管置于水套中上流式细胞仪，开始采集数据（不存储数据），流速约为5,000–10,000 个事件/秒。待细胞信号稳定（15–30秒）后，开始数据采集并至少记录10秒以建立基线。
    2. 在第10秒时，迅速将FACS管从流式细胞仪中取出，加入刺激物（5–50 μM抗原性脂质体，体积2–20 μL），短暂涡旋混匀，立即将FACS管放回流式细胞仪。在此期间持续采集并存储数据，持续记录3–5分钟。
  13. 在适当的数据分析软件中使用动力学功能分析数据。

5. 花生提取物的制备

  1. 通过将花生粉与磷酸盐缓冲液（PBS）按1:5（重量:体积）的比例混合，并加入1 M氯化钠（NaCl），提取花生蛋白。在室温下用磁力搅拌器搅拌溶液2小时，同时维持pH值为8.5。
  2. 在4 °C条件下以3,000 × g离心45分钟。倾出上清液，并依次通过0.4 µm滤膜和0.2 µm滤膜进行过滤除菌。使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，通过双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。
  3. 在含有十二烷基硫酸锂、pH为8.4的缓冲液中，加入50 mM二硫苏糖醇（DTT）对花生蛋白样品进行还原和变性处理，此pH条件有利于还原剂发挥最大活性，并在70 °C加热10分钟。
  4. 将10 µg变性后的花生蛋白上样至Bis-Tris 4–12%预制聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶设计用于实现最佳分离梯度，并使用分子量预染标准蛋白进行电泳。
  5. 用二磺酸三苯甲烷染色凝胶，并用ddH2O脱色。在提取物中鉴定已知的主要花生过敏原Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3。Ara h 1出现在63 kDa处，Ara h 2应显示为17和19 kDa的两种同工型，Ara h 3出现在37 kDa处（酸性亚基）。

6. 小鼠对花生的致敏

  1. 将1 mg霍乱毒素溶于1 mL超纯水中。用PBS配制200 µL稀释的花生提取物，其中含2 mg花生蛋白和10 µg霍乱毒素。
  2. 给予200 µL含有霍乱毒素的花生提取物（含2 mg花生蛋白和10 µg霍乱毒素） 通过 对每只4–5周龄的BalB/cJ雌性小鼠进行灌胃给药，每周重复一次，连续三周（即， 第0、7和14天
  3. 注射300 µL稀释的花生提取物（含5 mg花生蛋白和10 µg霍乱毒素） 通过 在第四周对每只小鼠进行口服灌胃即， 第21天

7. 用花生提取物激发小鼠

  1. 第28天，将花生提取物用PBS配制至终浓度为1 mg/mL。使用直肠温度计测量基础体温（约为37.5–38.5 °C）。给予200 µL（200 µg）花生提取物 通过 腹腔（i.p.）注射
  2. 注射后每15分钟用直肠温度计测量体温一次，持续1小时。体温下降提示对花生过敏。
    注意：低体温是小鼠过敏性反应的典型特征。本激发试验将证明小鼠对花生过敏。通常，经过致敏方案的 Balb/cJ 小鼠中有 90% 在激发时会出现过敏反应，表现为体温下降至少 2–3 °C。

8. 过敏小鼠脾细胞的分离与过继转移

  1. 从未经致敏的小鼠和花生过敏小鼠中分离脾细胞。
    1. 第30天，通过给予3 L/min的CO₂对未致敏和确诊花生过敏的小鼠实施安乐死2 在气体麻醉室中实施安乐死。通过双侧开胸法确认小鼠死亡。使用70%乙醇对手术器械和小鼠尸体进行消毒。用镊子将覆盖胸腔的皮肤与肋骨分离。用直解剖剪在左右两侧进行切口，切断左侧和右侧肋骨。
    2. 使用镊子和解剖剪从腹腔中取出脾脏。在将脾脏置于装有10 mL RPMI 1640培养基的聚苯乙烯15 mL锥形管中之前，去除脾脏周围的脂肪组织。
    3. 在无菌超净工作台中，将脾脏和培养基倒入一个35 mm的聚苯乙烯培养皿中。在细胞分离过程中，将未致敏和过敏的脾细胞分别置于不同的培养皿和培养基中。使用灭菌镊子和解剖剪将脾脏剪成三份，然后放回培养皿中。
    4. 使用两片载玻片粗糙的磨砂边缘，在 RPMI 中轻轻研磨脾组织碎片，直至载玻片间仅剩白色组织。每组之间更换载玻片。
    5. 将细胞裂解液从培养皿中通过装有70 µm细胞筛网的50 mL锥形管转移。用1 mL注射器的推杆将剩余的脾组织碎片过筛。用5 mL RPMI冲洗筛网，以最大程度回收细胞。将滤液转移至聚苯乙烯15 mL锥形管中，离心（450 x g，10 分钟，室温。
    6. 吸弃上清液，加入2 mL红细胞裂解缓冲液（含0.83%氯化铵的10 mM Tris缓冲液，pH 7.2），重悬细胞沉淀。混匀后室温孵育2–3分钟。加入10 mL PBS-2% FBS，300 × g离心 g 室温下孵育7分钟。
    7. 用 12 mL PBS-2% FBS 再次洗涤细胞，以彻底去除残留的氯化铵，随后在 300 x g 室温孵育7分钟。将细胞沉淀重悬于2 mL RPMI 1640培养基中。使用血细胞计数板或自动血液分析仪进行细胞计数。
  2. 使用1 mL胰岛素注射器配备27 G、5/8英寸针头，经静脉注射15 x 106 如上所述提取的致敏或未致敏脾细胞（200 µL） 通过 尾静脉注射至未致敏小鼠。

9. 使用花生过敏原Ara h 2脂质体对小鼠进行注射

  1. 制备含有0.1% Ah2、脂质浓度为2.5 mM的Ah2脂质体。计算蛋白质浓度时，Ah2的消光系数为15,000 M⁻¹cm⁻¹。-1将脂质体用无菌 PBS 稀释至 300 µM。
  2. 过继转移致敏或未致敏脾细胞后一天（第31天），经尾静脉注射200 µL PBS或含Ah2抗原性脂质体（300 µM），其中Ah2总量为1.38 µg 通过 步骤8.2中接受脾细胞的BALB/cJ小鼠的尾静脉

10. 使用Ara h 2对小鼠进行加强免疫与激发

  1. 在注射 Ah2 脂质体两周后（第 45 天），使用 4 mm 动物采血针从小鼠颌下交界处采集 50–200 µL 血液。将血液收集至不含肝素的血清分离管中；以 6,000 x g 离心 15 分钟分离血清。后续用于检测抗原特异性抗体。
  2. 在第 46 天，即小鼠注射脂质体两周后（步骤 9.2），通过腹腔注射 200 µL PBS 或 200 µg 可溶性 Ah2（按先前所述方法纯化16）对小鼠进行加强免疫。
  3. 在第 60 天，从小鼠颌下交界处采集 50–200 µL 血液，并按前述方法处理血液。
  4. 在第 61 天，对每组小鼠进行腹腔注射 200 µL 含 300 µg 可溶性 Ah2 的溶液以进行攻击。参照第 7 节方法，每 15 分钟使用直肠探针测量一次体温。

11. 通过 ELISA 定量检测 Ara h 2 特异性 IgE 和 IgG1

  1. 用包被缓冲液（50 mM 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）将 HSA-DNP（2,4-二硝基苯基半抗原偶联人血清白蛋白，20 µg/mL）或 Ah2（5 µg/mL）稀释后，每孔加入 100 µL，包被适用于 96 孔酶联免疫吸附试验（ELISA）的板，用于标准曲线或步骤 10.1 和 10.3 中采集的血清样本，于 4 °C 过夜或 37 °C 孵育 >1 h。
  2. 用 200 µL PBS-T（含 0.05% Tween-20 的 PBS）洗涤三次，每孔加入含 2% BSA 的 PBS-T 200 µL，在 37 °C 封闭 >2 h。
  3. 进行 Ah2 特异性 IgE ELISA 时，每孔加入 50 µL IgE-抗-DNP 标准品（2–0.002 µg/mL，通过 1:2 倍比稀释制备）或小鼠血清样本（1:20 稀释），于 4 °C 孵育过夜。进行 Ah2 特异性 IgG1 ELISA 时，每孔加入 100 µL 纯化的 IgG1-抗-DNP 标准品（2–0.002 µg/mL，通过 1:2 倍比稀释制备）或小鼠血清样本（1:500 稀释），于 4 °C 孵育过夜或 37 °C 孵育 1 h。
  4. 用 200 µL PBS-T 洗涤三次。进行 Ah2 特异性 IgE ELISA 时，每孔加入 100 µL 羊抗小鼠 IgE（0.5 µg/mL），37 °C 孵育 1 h。进行 Ah2 特异性 IgG1 ELISA 时，每孔加入 100 µL HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG1（用 PBS-T-2% BSA 稀释至 1:40,000），37 °C 孵育 1 h。
  5. 用 200 µL PBS-T 洗涤三次。进行 Ah2 特异性 IgE ELISA 时，每孔加入 100 µL 生物素化驴抗羊 IgG（0.5 µg/mL），37 °C 孵育 45 min。进行 Ah2 特异性 IgG1 ELISA 时，跳至步骤 11.7。
  6. 用 200 µL PBS-T 洗涤三次。进行 Ah2 特异性 IgE ELISA 时，每孔加入 100 µL 中性亲和素-辣根过氧化物酶（例如，NeutrAvidin-HRP，0.3 µg/mL），37 °C 孵育 30 min。
  7. 每孔加入 100 µL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）底物，孵育 10–15 min，或直至样本变为深蓝色，然后加入 100 µL TMB 终止液。在 450 nm 处读取吸光度。

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结果

通过还原SDS-PAGE电泳可证明目标蛋白与DSPE-PEG(2000)的偶联，表现为与未偶联蛋白相比分子量增加。 图1A 显示了抗小鼠IgM F(ab)片段与PEG-DSPE偶联的代表性凝胶结果，变性蛋白出现约2–3 kDa的条带迁移。需要注意的是，约50%的蛋白发生修饰，这在Fab片段（由重链和轻链组成的异源二聚体）上实现1:1化学计量比的情况下是预期结果。 图1B 展示了Ah2与PEG-DSPE偶联的代表性凝胶图。为评估抗原性脂质体刺激B细胞后引起的钙流变化，需注意两个关键因素：（1）仪器设置需调整至能够检测到Indo-1荧光钙离子比率的变化；2+ 结合（紫色）与未结合（蓝色）形式，并采用恰当的设门策略评估B细胞活化。 图2A 展示了基于流式细胞术的钙流实验的设门方案。在SSC-A中圈选活的淋巴细胞 与 FSC-A（左图），在 FSC-W 中排除双联...

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讨论

本文所述方法是一种将蛋白质与脂质偶联的通用方案，可用于在脂质体纳米颗粒表面展示该蛋白质。对于非常大的多亚基蛋白质，本方案的应用可能受限。理想的方法是引入一种位点特异性标签，从而实现生物正交化学连接策略。如果通过重组方式表达蛋白质，则可利用现有的位点特异性技术17，并结合市售的、带有多种官能团的聚乙二醇化脂质末端进行连接。因此，本方案主要针对从天然来源分离的蛋白质，适用于广大不一定熟悉化学和生物化学转化技术的科研人员。

进行钙流实验时，一个需要强调的关键环节是：在上流式细胞仪检测前，细胞不应被提前激活。如果无菌操作未被严格执行，将导致细胞被非特异性激活，从而产生较高的背景信号（Indo-1 荧光偏向其在紫光通道的发射波长）。同样，在进行检测前应将细胞保持在冰上，以避免 Indo-1 通道出现异常水平的背景信号。此外，在流式细胞术数据采集前以及整个刺激过程中，必须确保细胞在上机前已预热 2–3 分钟。如果在数据采集期间未能将细胞维持在 37 °C，细胞将无法产生最大化的响应。由于小鼠体内抗原特异性 B 细胞数量极低，使用替代性抗原刺激小鼠...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国防部资助（项目编号：W81XWH-16-1-0302 和 W81XWH-16-1-0303）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Model 2110 组分收集器BioRad7318122
胆固醇SigmaC8667Sigma 级，纯度 99%
SPDP赛默飞世尔科技21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG马来酰亚胺Avanti880126
挤出机Avanti6100001 mL注射器配支架/加热块
过滤器 0.1 µmAvanti610005
过滤器 0.8 µmAvanti610009
10 mm 滤膜支撑架Avanti6100014
玻璃圆底烧瓶SigmaZ100633
终止剂赛默飞世尔科技P-301398
导管赛默飞世尔科技P-198194
勒尔·洛克赛默飞世尔科技k4201634503
Sephadex G50 葡聚糖凝胶珠GE Life Sciences17004201
Sephadex G100 葡聚糖凝胶珠GE生命科学17006001
热灭活胎牛血清赛默飞世尔科技10082147
HEPES (1 M)赛默飞世尔科技15630080
EGTASigmaE3889
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）赛默飞世尔科技15140122
1x 红细胞裂解缓冲液赛默飞世尔科技00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSS赛默飞世尔科技14170112不含钙和镁
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab抗小鼠IgM杰克逊免疫研究实验室115-007-020
F(ab')2 抗小鼠 IgM杰克逊免疫研究实验室115-006-020
花生粉Golden Peanut Co.52127112% 脂肪轻度烘焙，50% 蛋白质
动物喂食针Cadence Science792022g × 1.5"，1.25 毫米 - 直头
微探针温度计PhysitempBAT-12
小鼠直肠探针PhysitempRet-3
霍乱毒素，来自 霍乱弧菌List Biological Laboratories, Inc.100B无叠氮化物
BCA 蛋白质测定试剂盒皮尔斯23225
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液SigmaC3041
TMB终止液KPL50-85-06
SureBlue TMB 微孔过氧化物酶底物KPL5120-0077
96孔Immulon 4HBX板赛默飞世尔科技3855
纯化的可溶性Ara h 2N/AN/A纯化方法见：Sen， 等，2002年，《免疫学杂志》
HSA-DNPSigmaA-6661
小鼠 IgE 抗 DNP精确化学BYA60251
羊抗小鼠 IgE结合位点PC284
生物素标记的驴抗羊IgG精确化学JNS065003
NeutrAvidin 蛋白，HRP赛默飞世尔科技31001
小鼠 IgG1 抗 DNP准确的化学方法MADNP105
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL 胰岛素注射器BD329412U-100 胰岛素，0.40 毫米（27 G）× 16.0 毫米（5/8）")
Superfrost 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-1425 mm × 75 mm × 1.0 mm
ACK裂解缓冲液Life Technologies 旗下的 GibcoA10492-01100 mL
RPMI 1640培养基赛默飞世尔科技11875093500 mL
细胞筛康宁35235070 μm 尼龙，白色，无菌，独立包装
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶InvitrogenNP0322BOX10 块凝胶
NuPAGE LDS 缓冲液，4×InvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 预染标准蛋白 MarkerInvitrogenLC5925500 µL
NuPAGE MES/SDS 电泳缓冲液，20倍浓缩液InvitrogenNP0002500 mL
GelCode 蓝染色剂赛默飞世尔科技24590500 mL

参考文献

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