本文报道了dynamin的免疫荧光定位，以说明在石蜡包埋的小鼠附睾组织切片以及永生化附睾细胞系（mECap18）中检测蛋白质的实验方案。我们还描述了从附睾液和细胞条件培养基中分离分泌蛋白的实验方法。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物附睾产生的管腔内液体是所有内分泌腺中最复杂的液体之一，旨在支持精子在睾丸后的成熟与储存。这种复杂性源于上皮衬里细胞的联合分泌与吸收活性。本文重点介绍以动力蛋白（DNM）机械酶这一模型蛋白家族为例，分析附睾蛋白合成与分泌的技术。DNM是一类大型GTP酶，具有调控双向膜运输事件的潜力。针对附睾组织中蛋白表达的研究，我们描述了一种可靠的免疫荧光标记方法，用于检测石蜡包埋切片中的靶蛋白，并通过免疫荧光显微镜观察这些蛋白的空间分布。我们还介绍了优化的外泌体样囊泡（即附睾体，epididymosomes）的分离与表征方法。附睾体分泌至附睾管腔中，参与与成熟中精子细胞的细胞间通讯。作为一种补充方法，我们还描述了在SV40永生化的小鼠附睾头部上皮细胞系（mECap18）中进行靶蛋白免疫荧光检测的技术。此外，我们讨论了mECap18细胞系作为研究附睾上皮功能的合适模型的实用性 体外 可用于研究附睾分泌活性调控的模型。为此，本文描述了mECap18细胞系的培养条件，以及可影响其分泌蛋白谱的选择性药理学抑制方案的应用。后者可通过收集条件培养基，采用三氯乙酸/丙酮沉淀法浓缩分泌蛋白，随后经SDS-PAGE和免疫印迹分析进行检测。我们认为，这些联合方法适用于分析其他附睾蛋白靶点，为阐明其在精子成熟和/或储存中的功能作用奠定基础。
引言
所有哺乳动物物种的精子在通过附睾这一雄性睾丸外导管系统中的高度特化区域的长期下行过程中，获得表现出前向进行性运动能力和使卵子受精的潜能，这一过程可能需要7至14天（取决于物种）1。由于精子在睾丸内发生细胞分化时父源染色质高度浓缩，并丢失了大部分细胞质，其后续的功能成熟完全依赖于与附睾微环境的相互作用。而该微环境则由附睾衬里体细胞的分泌和吸收活动所形成，并表现出显著的区段间差异1。因此，在蛋白质合成和分泌方面最活跃的区段位于附睾的近端部分（即头段和体段）2。这种活动模式与精子的功能特征相呼应：精子在通过附睾头段后，开始表现出功能成熟的关键标志（即，进行性运动能力以及结合酸溶解带状糖蛋白的能力）3。这些功能特性继续发育，直至精子到达远端附睾区段（尾段）时达到最佳水平，精子在此以静息状态储存，为射精做好准备。这一精子储存库的形成与维持也与衬里上皮密切相关，在附睾尾段，上皮主要表现出强烈的吸收活性4,5。尽管已有解剖学差异的报道6,7,8
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方案
所有涉及动物组织采集的实验操作均经纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准。
1. 石蜡包埋附睾切片的免疫荧光染色（图1和图2）
- 在通过 CO₂ 处死成年小鼠后立即进行后续操作2 吸入麻醉（Swiss小鼠，8周龄以上），用手术剪和镊子仔细解剖附睾，去除表面的结缔组织和脂肪，然后浸入Bouin固定液中（> 十倍体积/组织重量的固定液进行过夜固定。
- 用70%乙醇洗涤组织2次× 每日更换一次，持续2天，然后依次通过梯度乙醇（70%、95%和100%）脱水，以备后续浸润并包埋于石蜡块中。
- 将石蜡包埋块切成4-6 μm厚度的切片 µm 并置于载玻片上，以备免疫荧光染色。
- 在通风橱中，向切片罐中加入足量二甲苯以完全浸没组织切片，对附睾石蜡切片进行脱蜡处理（3次，每次5分钟）× 每次5分钟。
- 通过将组织切片浸入用纯化水稀释的梯度浓度乙醇溶液中进行复水2O（100%乙醇5分钟，100%乙醇5分钟，90%乙醇1分钟，80%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟，50%乙醇1分钟）。
- 用足量的磷酸盐缓冲液（PBS）在切片缸中清洗切片一次，每次5分钟，确保完全浸没整个组织切片（后续所有清洗步骤均按此方法进行）。
- 倾倒适量的抗原修复液（即，10 mmol/L 柠檬酸钠，50....
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结果
图1 和 图2展示了DNM在小鼠附睾头部中免疫荧光定位的代表性结果。所研究的三种DNM亚型各自表现出不同的定位模式。因此，DNM1在初始段和附睾头部的附睾细胞中均呈现相对较弱的弥散性标记（图2A）。相比之下，DNM2亚型首先在初始段细胞的基底侧和顶膜邻近区域被检测到，随后在相邻下游附睾头部区段（即第2–5区）的细胞中重新定位至核上区（i.e., 第2–5区）（图1B, C）。值得注意的是，DNM2标记的强度在附睾头部第2至第5区之间逐渐减弱，这一结果基本反映了这些附睾区段的分泌活性21（图1B, C）。因此，DN.......
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讨论
这些研究采用了经Bouin固定液固定的附睾组织，该组织经过石蜡包埋及标准切片流程处理。Bouin固定液由甲醛、苦味酸和乙酸混合而成，其中各组分具有特定且互补的功能：甲醛与伯胺反应形成蛋白质交联；苦味酸缓慢渗透组织，形成盐类从而导致碱性蛋白质凝固；而乙酸则快速渗透组织，引起核酸凝固。这些综合作用使Bouin固定液成为保存组织形态学细节的首选固定剂，在附睾相关文献中被广泛使用。然而，Bouin固定液也存在局限性，包括可能引起固定液自身荧光以及甲醛诱导的交联反应，后者可能掩盖目标抗原。
背景荧光的可能性要求使用严格的阴性对照，本研究中的阴性对照包括：省略一抗、省略二抗，以及在试剂可获得的情况下，使用针对其来源免疫肽段预先吸附过的一抗。此类对照的应用细节已在我们先前关于小鼠附睾中动力蛋白DNM表达的研究中得到示例。21理想情况下，这些结果还应通过敲除动物来源的组织进行验证，然而这类材料并非总是易于获得。为应对交联或化学修饰导致的靶抗原次级问题，通常需要进行某种形式的抗原修复，以暴露因固定而改变的表位，从而恢复其与抗体结合的能力。所采用的修复方.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢澳大利亚国家卫生与医学研究委员会项目资助 APP1103176 对本工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动力蛋白1抗体 | Abcam | ab108458 | 宿主物种: 兔, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 动力蛋白2抗体 | Santa Cruz | sc-6400 | 宿主物种: 山羊, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 动力蛋白3抗体 | Proteintech | 14737-1-AP | 宿主物种: 兔, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| ATP6V1B1抗体 | Santa Cruz | sc-21206 | 宿主物种: 山羊, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| CD9抗体 | BD Pharmingen | 553758 | 宿主物种: 大鼠, 同种型: IgG, 类别: 单克隆 |
| Flotillin-1抗体 | Sigma | F1180 | 宿主物种: 兔, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| ALOX15抗体 | Abcam | ab80221 | 宿主物种: 兔, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| TUBB抗体 | Santa Cruz | sc-5274 | 宿主物种: 小鼠, 同种型: IgG, 类别: 单克隆 |
| PSMD7抗体 | Abcam | ab11436 | 宿主物种: 兔, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 抗兔Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | 宿主物种: 山羊, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 抗山羊Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | 宿主物种: 驴, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 抗山羊Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | 宿主物种: 驴, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 抗大鼠Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | 宿主物种: 山羊, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 抗兔HRP | Millipore | DC03L | 宿主物种: 山羊, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 抗大鼠HRP | Millipore | DC01L | 宿主物种: 山羊, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 抗小鼠HRP | Santa Cruz | sc-2005 | 宿主物种: 山羊, 同种型: IgG, 类别: 多克隆 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma | D9564 | |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A7906 | |
| 胎牛血清（FBS） | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo | 25030-081 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-雄烷-17β-醇-3-酮C-IIIN | Sigma | A8380 | |
| 丙酮酸钠 | Thermo | 11360-070 | |
| 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma | T4049 | |
| 多聚甲醛（PFA） | EMS | 15710 | |
| 二甲苯 | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| 乙醇 | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | P4417 | |
| 柠檬酸钠 | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷 | Sigma | D2522 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P4832 | |
| 吐温X-100 | Sigma | 78787 | |
| 台盼蓝 | Sigma | T6146 | |
| 三氯乙酸 | Sigma | T9159 | |
| 丙酮 | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| 蔗糖 | Sigma | S0389 | |
| 聚乙烯醇 | Sigma | P8136 | |
| D-葡萄糖 | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep密度梯度介质 | Sigma | D1556 | |
| 荧光显微镜 | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| 超速离心机 | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 培养箱 | Heracell | 150 | |
| 大型轨道摇床 | Ratek | OM7 | |
| 微波炉 | LG | MS3840SR /00 | |
| 实验室pH计 | MeterLab | PHM220 | |
| 防液体滑落载片标记笔 | Daido Sangyo | Mini | |
| 盖玻片 | Thermo | 586 | |
| 6孔板 | CELLSTAR | 657160 | |
| 12孔板 | CELLSTAR | 665180 | |
| 载玻片 | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm滤膜 | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes无尘纸 | KIMTECH | 34155 | |
| 超速离心管（2.2 ml，11 × 35 mm） | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| 超速离心管（3.2 ml，13 × 56 mm） | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| 细胞滤网 70 µm 尼龙 | FALCON | 352350 | |
| 带卡环的35 × 10 mm培养皿 | SARSTED | 82.1135.500 | |
| 染色缸 | TRAJAN | #23 319 00 |
参考文献
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F.
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重印与许可
