Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

Zusammenfassung

Eine HMCA-basierte Speicherfolie wird für Invasion Testleistung vorgestellt. Diese Platte erleichtert die Bildung von dreidimensionalen (3D) Tumor Sphäroide und die Messung der Krebs Zelle eindringen in die extrazelluläre Matrix (ECM). Die Invasion-Assay-Quantifizierung wird durch halbautomatische Analyse erreicht.

Zusammenfassung

Krebsmetastasen ist bekannt, 90 % der Letalität Krebs verursachen. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, der mit der Durchdringung/Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe initiiert. Somit ist Invasion ein entscheidender Schritt in Metastasen, machen die Invasion Prozessforschung und Entwicklung von Anti-metastatischen Drogen hochsignifikant. Um diese Nachfrage zu begegnen, besteht die Notwendigkeit, 3D in-vitro- Modelle zu entwickeln, die die Architektur von soliden Tumoren zu imitieren und ihrer Mikroumgebung am ehesten zu in Vivo Staat auf der einen Seite, aber zur gleichen Zeit werden reproduzierbar, robust und geeignet für hohe Ergiebigkeit und hohe Content Messungen. Derzeit, lehnen die meisten Invasion Assays auf anspruchsvolle mikrofluidischen Technologien, die ausreichend sind für die Forschung aber nicht für hochvolumige Drogen-Screening. Andere Tests mit Platte-basierten Geräten mit isolierten einzelnen Sphäroide in jede Vertiefung sind Material verbrauchen und geringen Stichprobengröße pro Zustand haben. Das aktuelle Protokoll soll eine einfache und reproduzierbare biomimetische zellbasierte 3D-System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide schaffen. Wir entwickelten ein 3D-Modell für Invasion Assay anhand HMCA Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Wirkstoffforschung. Dieses Gerät ermöglicht die Produktion von zahlreichen einheitliche Sphäroide pro Bohrloch (hohe Stichprobengröße pro Zustand) umgeben von ECM-Komponenten, während gleichzeitig und kontinuierlich beobachten und messen die Sphäroide bei einem Element Auflösung für mittlere Durchsatz-Screening von Anti-metastatischen Drogen. Diese Plattform wird hier durch die Produktion von HeLa und MCF7 Sphäroide zur Veranschaulichung einzelne Zelle und kollektive Invasion vorgestellt. Wir vergleichen den Einfluss der ECM-Komponente-Hyaluronsäure (HA) auf die invasive Kapazität von Kollagen um HeLa Sphäroide. Schließlich stellen wir Fisetin (Invasion Hemmer) HeLa Sphäroide und Stickstoffmonoxid (NO) (Invasion Aktivator), MCF7 Sphäroide. Die Ergebnisse werden von Inhouse-Software analysiert die halbautomatische, einfache und schnelle Analyse ermöglicht die Multi-Parameter-Prüfung erleichtert.

Einleitung

Krebstod ist vor allem auf die Verbreitung von metastasierenden Zellen an weit entfernten Orten zurückzuführen. Viele Bemühungen in der Krebsbehandlung auf targeting oder verhindern die Bildung von Metastasen Kolonien und das Fortschreiten der systemische Metastasen¹konzentrieren. Krebs Zelle Migration ist ein entscheidender Schritt in der Tumor-Metastasen-Prozess, also die Erforschung von Krebs Invasion Kaskade ist sehr wichtig und eine Voraussetzung zur Suche nach Anti-metastatischen Therapeutika.

Die Verwendung von Tiermodellen als Hilfsmittel für das Studium metastasierten Erkrankung wurde sehr teuer und nicht im....

Protokoll

(1) HMCA Platte Prägung

Hinweis: Der komplette Prozess für die Konstruktion und Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempel und HMCA Speicherfolie verwendet in diesem Protokoll wird im Detail in unserem vorherigen Artikel^15,16beschrieben. PDMS-Stempel (Negativform) wird verwendet, um die HMCA (positive Form) prägen besteht aus rund 450 MCs pro Bohrloch (Abbildung 1A). Wie in Abbildung 1 bgezeigt, die MCs jeweils eine Form einer abgeschnittenen Kopf quadratische Pyramide (Höhe: 190 µm, kleine Grundfläche: 90 µm X 90 µm ....

Ergebnisse

Die einzigartige HMCA imaging-Platte wird für die Invasion-Assay von 3D Tumor Sphäroide verwendet. Der gesamte Test, mit der Sphäroid Bildung beginnend und endend mit der Invasion und zusätzliche Manipulationen erfolgt innerhalb der gleichen Platte. Für die Bildung der Sphäroid HeLa-Zellen werden in das Array Becken geladen und siedeln in der Hydrogel MCs durch die Schwerkraft. Das Hydrogel MCs, die Anhänger/niedrige Anlage Eigenschaften haben, erleichtern die Zell-Zell-Interaktion und di.......

Diskussion

Es ist gut dokumentiert, dass lebende Organismen, zeichnet sich durch ihre komplexe 3D mehrzelligen Organisation ziemlich eindeutig aus den gängigen 2D Monolage kultivierten Zellen sind, entscheidende betonend, zelluläre Modelle verwenden die Funktionen besser imitieren und Prozesse des lebenden Organismus für Drug screening. Vor kurzem wurden mehrzelligen Sphäroide, organotypischen Kulturen, Organellen und Organe-on-a-Chip eingeführt⁸ für den Einsatz in standardisierten Wirkstoffforschung. Allerd.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6 Mikrowell-Glasbodenplatten mit 14 mm Mikrowell-#1,5-Deckglas	Cellvis	P06-14-1,5-N	Kommerzielle Glasbodenplatten, die für die HMCA-Prägung verwendet werden
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	Eine Lösung von 6% Agarose wird auf 80 & Grad erwärmt; C vor dem Gebrauch wird eine Lösung von 1% Agarose auf 37 μg erwärmt; C
Trypsin EDTA-Lösung B	Biological Industries	03-052-1A	Erwärmt auf 37 μg; C vor Gebrauch
DMEM mittel, hoher Glukosegehalt	Biologische Industrie	01-055-1A	Erwärmt auf 37 μg; C vor Gebrauch
Spezielles Serum für neugeborene Kälber (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Hitzeinaktiviertes
DPBS (10x), kein Kalzium, kein Magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Vor Gebrauch auf Eis aufbewahrt
NaOH, wasserfrei	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Wird zur Herstellung von 1 M NaOH-Lösung
verwendet Cultrex Typ I Kollagen aus Rattenschwanz, 5 mg/mL	Trevigen	3440-100-01	Gebrauch auf Eis gelegt
Hyaluronsäure Natriumsalz	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Vor Gebrauch auf Eis aufbewahrt
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Dem Nährmedium Invasionshemmer
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Dem Nährmedium zugesetzt, Stickstoffmonoxid-Donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Wird bei sehr geringer Konzentration ohne Waschen verwendet
Dymax 5000-EC UV-Flutlicht-Komplettsystem mit Lichtschutz & Dymax 400 Watt EC-Netzteil	Dymax Corporation	PN 39823	Wird für die Sterilisation von HMCA-Platten mit dem inversen UV-Mikroskop
IX81	verwendet Olympus		Wird für die automatische Bildaufnahme
verwendet Inkubator für Mikroskope	Life Imaging Services		Unverzichtbar für Zeitrafferexperimente mit Bildaufnahme, voreingestellt auf 37 & Grad; C, 5% CO2 und Aufrechterhaltung einer befeuchteten Atmosphäre
Submikron motorisierter Tisch Typ SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Wird zur Vorbestimmung von Bildaufnahmebereichen verwendet, für die automatische Bildaufnahme
14-Bit, ORCA II C4742-98 gekühlte Kamera	Hamamatsu Photonics		wird für die Bildgebung
verwendet Fluoreszenzfilterwürfel für die PI-Detektion	Chroma Technology Corporation		Spezifikationen des Filterwürfels: Anregungsfilter 530-550 nm, dichroitischer Spiegel 565 nm Langpass- und Emissionsfilter 600-660 nm
Die Olympus Cell^P Betriebssoftware	Olympus		Software zur Steuerung von Mikroskop, motorisiertem Tisch, Kamera und Bilderfassung
Matlab R2014B Analysesoftware	Mathworks		Wird verwendet, um eine hauseigene grafische Benutzeroberfläche für die Bildanalyse
zu entwickeln Excel-Software	Microsoft		Wird für Datenverwaltung, Berechnung, Diagrammerstellung und Statistik verwendet

Vor zugesetzt Hochempfindlich,