वयस्क Zebrafish के ओरल इंटुबैषेण: एक मॉडल के लिए एक अति सक्रिय यौगिकों के आंत्र का मूल्यांकन
Summary
प्रोटोकॉल एक जीवविज्ञान के साथ intubating वयस्क zebrafish का वर्णन; इसके बाद cytometry, फोकल माइक्रोस्कोपी और qPCR के लिए आंत को विदारक और तैयार करते हैं । इस विधि की अनुमति देता है, सक्रिय यौगिकों के प्रशासन को आंतों के ऊपर की निगरानी और स्थानीय प्रतिरक्षा उत्तेजना पैदा की । यह मौखिक prophylactics के आंत्र गतिशीलता परीक्षण के लिए प्रासंगिक है ।
Abstract
अधिकांश रोगजनकों उनके म्यूकोसा के माध्यम से जीवों पर आक्रमण । यह मछली में विशेष रूप से सच है के रूप में वे लगातार एक माइक्रोबियल युक्त पानी के माहौल को उजागर कर रहे हैं । immunostimulants या टीके, जो संक्रामक रोगों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने के मौखिक वितरण के लिए प्रभावी तरीकों का विकास अत्यधिक वांछनीय है । नियत्रंण उपकरण तैयार करने में, अच्छे प्रयोगात्मक मॉडल उनके प्रदर्शन का परीक्षण करने की जरूरत है । यहां, हम वयस्क zebrafish के मौखिक इंटुबैषेण और प्रक्रियाओं का एक सेट के लिए एक विधि दिखाने के लिए काटना और cytometry, फोकल माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) विश्लेषण के लिए आंत तैयार करते हैं । इस प्रोटोकॉल के साथ, हम ठीक ५० µ एल तक मात्रा प्रशासन कर सकते है लगभग 1 जी बस और जल्दी से वजन मछली, पशुओं को नुकसान पहुंचाए बिना । इस विधि हमें आंतों की श्लेष्मा झिल्ली और इंटुबैषेण के बाद स्थानीय साइट पर इस तरह के तर्कों की इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता द्वारा फ्लोरोसेंट बला यौगिकों के vivo में प्रत्यक्ष का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । इस तरह के प्रवाह cytometry, प्रोटोकॉल, qPCR और आंत्र ऊतक के फोकल माइक्रोस्कोपी के रूप में बहाव के तरीकों के संयोजन से, हम समझ सकते हैं कि कैसे immunostimulants या टीकों आंत्र श्लैष्मिक बाधाओं को पार करने में सक्षम हैं, लेमिना propria के माध्यम से पारित, और मांसपेशियों तक पहुँचने, आंतों श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रणाली पर एक प्रभाव डालती. मॉडल के लिए उंमीदवार मौखिक prophylactics और वितरण प्रणाली या किसी भी मौखिक रूप से प्रशासित सक्रिय यौगिक के स्थानीय प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है ।
Introduction
इस अनुच्छेद के लक्ष्य को गहराई में वर्णन करने के लिए zebrafish के मौखिक इंटुबैषेण के लिए एक सरल विधि है, साथ उपयोगी संबंधित बहाव प्रक्रियाओं के साथ । मौखिक इंटुबैषेण का उपयोग zebrafish संक्रामक रोग गतिशीलता के अध्ययन में एक व्यावहारिक मॉडल बन गया है, मौखिक वैक्सीन/immunostimulant, दवा/nanoparticle और प्रभावकारिता, और आंत्र श्लैष्मिक उन्मुक्ति । उदाहरण के लिए, माइकोबैक्टीरियम marinum और माइकोबैक्टीरियम peregrinum संक्रमण1के अध्ययन में zebrafish ओरल इंटुबैषेण का उपयोग किया गया है । Lovmo एट अल. इसके अलावा सफलतापूर्वक इस मॉडल का इस्तेमाल किया वयस्क zebrafish2के गैस्ट्रो आंत्र पथ को नैनोकणों और एम marinum उद्धार । इसके अलावा, चेन एट अल. प्रयुक्त zebrafish ओरल इंटुबैषेण दिखाने के लिए कि दवाओं नैनोकणों द्वारा समझाया, जब गैस्ट्रो आंत्र पथ के माध्यम से प्रशासित, रक्त मस्तिष्क बाधा3भर में ले जाया गया । इन लेखकों Collymore एट अल द्वारा वर्णित gauvage विधि के आधार पर इंटुबैषेण प्रदर्शन किया । कुछ संशोधनों के साथ 4 । हालांकि, वे एक अत्यधिक विस्तृत मौखिक इंटुबैषेण प्रक्रिया का वर्णन प्रोटोकॉल प्रदान नहीं किया । यहां, हम Collymore एट अल पर वयस्क zebrafish इमारत के ओरल इंटुबैषेण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । 4 हम आगे cytometry, फोकल माइक्रोस्कोपी और qPCR द्वारा प्रासंगिक बहाव के विश्लेषण के लिए आंत की तैयारी शामिल हैं ।
आंत और विशेष रूप से इसके म्यूकोसा संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है और पोषक तत्व की प्राथमिक साइट5। जब उपकला कोशिकाओं और प्रतिजन-श्लैष्मिक बाधाओं के भीतर कोशिकाओं को पेश खतरे संकेतों अनुभव, एक तत्काल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू हो रहा है. अगला, अत्यधिक विशिष्ट अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया टी और बी लिम्फोसाइटों6,7द्वारा स्थापित किया गया है । मौखिक टीके का विकास vaccinology में एक वर्तमान फोकस क्षेत्र है । इस तरह के टीके एक प्रभावी उपकरण म्यूकोसा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट प्रतिक्रिया के कारण उजागर साइटों पर जीव की रक्षा करने के लिए होगा-जुड़े लसीकावत् ऊतकों (माल्ट)8,9. जलीय कृषि में, श्लैष्मिक टीके इंजेक्शन टीके की तुलना में स्पष्ट लाभ है । वे बड़े पैमाने पर टीकाकरण के लिए व्यावहारिक हैं, कम श्रम गहन, कम मछली के लिए तनावपूर्ण हैं, और युवा मछली के लिए प्रशासित किया जा सकता है । फिर भी, श्लैष्मिक वैक्सीन उंमीदवारों को मौखिक वातावरण में विकृत किया जा रहा बिना दूसरा आंत खंड तक पहुंचने चाहिए । वे भी श्लैष्मिक बाधाओं को पार करने के क्रम में पहुंच प्राप्त करने के लिए प्रतिजन कोशिकाओं (APCs) पेश करने के लिए स्थानीय और प्रेरित/ इसलिए, श्लैष्मिक के परीक्षण उंमीदवार मौखिक एंटीजन और उनके वितरण प्रणाली, साथ ही साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा द्वारा हासिल की, मौखिक टीके के विकास में आवश्यक है ।
एक बायोमेडिकल संदर्भ में, मौखिक इंटुबैषेण के बाद यौगिकों के जैविक प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक मॉडल विकसित करने के लिए बढ़ती ब्याज की है । आंत के संरचनात्मक और शारीरिक सुविधाओं के कई bilaterian वंश के बीच संरक्षित कर रहे हैं, स्तनधारियों और बोनी11मछलियों के साथ. बहाव विश्लेषण से जुड़ा यह मौखिक इंटुबैषेण मॉडल मानव जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक उपकरण हो सकता है, साथ ही vivo मेंजैव तर्क या अन्य यौगिकों के लिए एक परीक्षण जमीन.
मौखिक इंटुबैषेण प्रोटोकॉल एक ऑपरेटर द्वारा किया जा सकता है, उदाहरणके लिए, सफलतापूर्वक एक उच्च जीवित रहने की दर के साथ, 1 जी वजन मछली के लिए प्रोटीन nanoparticle निलंबन के ५० µ एल अप करने के लिए एडमिनिस्ट्रेटिंग । प्रक्रिया को स्थापित करने और जल्दी सरल है; १ एच में ३० मछलियाँ intubated जा सकती हैं. आंत तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल बाद के विश्लेषण के लिए गुणवत्ता सेल और ऊतक नमूने प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है । बहाव के परिणाम के उदाहरण दिए गए है जो आंतों के ऊपर से संबंधित डेटा प्राप्त करने में प्रोटोकॉल की उपयोगिता दिखा रहे है और qPCR के लिए अलग गुणवत्ता आरएनए में । प्रोटोकॉल एक उपयुक्त मॉडल की जरूरत उन लोगों के लिए महान उपयोग की होगी के लिए मौखिक prophylactics या आंत में अंय यौगिकों की गतिशीलता का परीक्षण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल Collymore एट अल द्वारा मौखिक इंटुबैषेण के लिए पहले वर्णित तकनीक का एक सुधार है । 4 हमारे प्रोटोकॉल मौखिक इंटुबैषेण विधि विस्तार में वर्णन करता है और बहाव के विश्लेषण के लिए आंत की तै?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्पेनी विज्ञान मंत्रालय, यूरोपीय आयोग और AGAUR कोष से NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER और 2014SGR-३४५ AGAUR) के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । आर टी AGAUR (स्पेन) से एक पूर्व डॉक्टरेट छात्रवृत्ति आयोजित करता है, जेजे चीन छात्रवृत्ति परिषद (चीन) से एक पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित था और NR रामोन y Cajal कार्यक्रम (RYC-2010-06210, २०१०, MINECO) द्वारा समर्थित है । हम Torrealba प्रोटीन उत्पादन में विशेषज्ञ सलाह के लिए डॉ., बरबा “Servei de Microscopia” और डॉ एम कोस्टा से “Servei de Citometria” Universitat Autònoma de बार्सिलोना के लिए सहायक तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
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