Summary
Dostum koruma davranışı cinsi Tigriopusgelgit kopepodların çoğaltılması içinde önemli bir rol oynar. Ancak, bu davranış eğitim yöntemleri de açıklanan olmamıştır. Burada biz yöntemleri tarif: bakire Tigriopus hayvan ve 2) kantitatif analiz dostum koruyan davranışlarının 1) bireysel kültür.
Abstract
Kayalık gelgit havuzlarında ortak Plankton olan kopepodların cinsi Tigriopus, nerede bir erkek bir çift oluşturmak için bir potansiyel dostum tokalar precopulatory dostum koruma davranışı gösterir. Bu fenomen araştırmacılar ilgi çekti iken, yöntemleri, analizleri için de açıklanan olmamıştır. Burada için yordamlar açıklar: 1) bireysel kültür ve Tigriopus gençler ve yetişkinler ve 2) video tabanlı analiz dostum koruyan davranışlarının yerleştirme. Kodlamayla yöntemi deneyim hayvanlar yanı kendi geliştirme davranış testleri önce izleme özelliği soyma, deneysel kontrol sağlar. Analiz yöntemi kantitatif değerlendirilmesi birkaç erkek girişimleriyle yakalama ve dostum koruyan çiftleri yörüngesini yüzme gibi dostum koruma davranışı yönlerini sağlar. Her ne kadar bu yöntemler aslında Tigriopusethological araştırmalar kuruldu, uygun değişiklikleri ile onlar da diğer plankton fizyolojisi, toksikoloji, gibi farklı araştırma alanlarındaki çalışmaları için uygulanabilir ve ekolojik genetik.
Introduction
Cinsi Tigriopus gelgit kopepodların yaygın olarak kayalık yüksek gelgit havuzlarında birkaç kıtada1arasında dağıtılır. Bu kopepodların dostum koruma nerede yetişkin bir erkek yakalar bir potansiyel dostum (çocuk ya da yetişkin) onların üreme bir parçası olarak davranışlar onun çengel ilk anten birleşme (resim 1 ve Şekil 2) önce kullanan2 ,3,4,5. Bu olay on yıl2,3,6,7, bu davranış, çalışmaları için ayrıntılı yordamlar için ethological ve biyokimyasal çalışmaların bir konu olsa da dahil olmak üzere Bakire hayvanların bireysel kültür ve ölçüt dostum koruyan bir girişimi olarak görülen davranış olayların henüz de açıklanmıştır. Böylece, burada çalışmaları kontrollü bir deneysel ortamda altında davranışının etkinleştirmek için yöntemleri kurmak.
Bireysel kültür ve hayvanların yerleştirme
Tigriopus üreme önceki çalışmalarda geleneksel yöntem gençlere (copepodids) ve yetişkin kadın davranış testleri için hazırlamak için ayırma ve deneyleri3,8,9 doğurmak bir çift istihdam ,10. Ancak, bu yöntem hayvanlar formu çiftleri için ve potansiyel olarak hayvan5davranış özelliklerini değiştirebilir (ITO 198811' de anlatılacak), testleri önce benim için izin verir. Buna ek olarak, ayrıca belirgin vücut büyüklüğü evreleme için itimat gibi geleneksel protokollerle kopepodların gelişim aşamalarında yanlış değerlendirmek için bir potansiyel mevcuttur. Bu yazıda, biz Tigriopus californicus5hayvan eşleştirme deneyim kontrol ve gelişimlerini izleme bu sınırlamaları gidermek için tasarlanmış, son çalışma kullanılan tek tek bir kodlamayla Yöntem tarif Yetişkin aşamaları için copepodid.
Kantitatif analiz dostum koruyan davranış
Tigriopus türler dostum koruyan davranışını sadece etoloji2,6 alanında aynı zamanda ecotoxicology ve evrimsel genetik3,4, gibi diğer alanlara okudu 7 , 8 , 9 , 10. ancak, önceki çalışmalarda formlar için teknik engel oluşturan davranış ve yöntemleri, eğitim için anahat için yeterli görsel resimler olmadan yazılı ders özellikle içinde bu davranışının açıkladı var. çoğaltma ve çalışmalar ilerlemesi. Burada, bazı dergi tarafından desteklenen Tigriopus kopepodların dostum koruyan davranışını önemli olaylar ayrıntılı açıklamalar sağlar. Ayrıca ekipman ve kantitatif analiz davranış yöntemlerini göstermektedir. Bu yöntemlerin tam olarak çoğaltılmış deneylerde hayvanların davranış özellikleri değerlendirme dostum koruma girişimleri sırasında izin.
Bu yöntemler ile cins Tigriopusdostum koruma davranışı üzerinde kontrollü ve tekrarlanabilir çalışmalar bir metodolojik olarak sunmayı amaçlamaktadır.
Protocol
1. hazırlanması bakire hayvan davranış gözlem için
- Döllenmiş yumurta elde etmek ve çatlamaya izin.
- Gravid kadın açık turuncu (Yani, döllenmiş ve gelişmiş geliştirme aşamalarında) yumurta (Şekil 3 c) Pasteur pipet ile hisse senedi bir kültürden taşıyan toplamak. Dişiler tarafından yavaşça onları temiz kültür aktarımı yumurtadan nauplial larva kültüründe de dahil olmak üzere diğer hayvanların önlemek için orta pipetting yıkayın.
Not: Bu protokol için bir tuzluluk % 35 ile yapay deniz suyu kültür ortamı olarak kullanılır. Bir deney amacına bağlı olarak farklı ortama (Örneğin yapay deniz suyu ile daha yüksek tuzluluk ya da ek bir çözünen) kullanın.
Not: Barreto vd. 201512 laboratuvar kültür stokları kurulması için bir yöntem ve Pereira ve ark. 201613 toplama sitelerinde T. californicusdoğal nüfus örnekleri için bakınız. Peterson ve ark. , enlem ve boylam bilgileri9 T. californicus, T. fulvusve T. japonicus toplama sitelerinde de bildirdi. Plastik pipetler yaklaşık 30-50 mL kapasiteli Tigriopus kopepodların rock havuzlarından toplamak için kullanın. - Her kadın ayrı ayrı bir 6-şey hücre kültür plaka temiz kültür orta (Şekil 4, solda) ile bir kuyu yerleştirin. (Nauplial larva dahil olmak üzere) hiçbir diğer hayvan iyi kirletici emin olun.
- Plakayı bir kuluçka yumurta kesesi bırakana dişiler kültür için 12 saatlik koyu döngüsü ile 20 ° C'de ayarla korumak. Bu adım genellikle tür ve embriyoların gelişim aşamalarında bağlı olarak 1'den 10 gün sürer. Bu arada, gravid her erkek iki taneleri ince zemin (yaklaşık < 0.5 mm çapında) balık yemi ile haftada iki kez besleme ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız).
Not: farklı sıcaklıklarda ve deney amacına bağlı olarak hafif döngüleri kullanın. Daha yüksek sıcaklıklarda daha hızlı geliştirme embriyoların kolaylaştırabilir.
Not: aşırı gıda wells çürüyen bırakmamak. Gıda artıkları çürümeye başlarsa pipette bu kuyu dışına Pasteur pipet ile. - Yumurta kesesi serbest sonra kadın kültür wells Pasteur pipet ile kaldırın.
Not: Tohumlama dişiler yavru2,3birden çok debriyajlar yumurtlama yeteneğine sahiptirler. Gerekirse, dişiler daha fazla güç toplamak için diğer kuyu aktarın.
- Gravid kadın açık turuncu (Yani, döllenmiş ve gelişmiş geliştirme aşamalarında) yumurta (Şekil 3 c) Pasteur pipet ile hisse senedi bir kültürden taşıyan toplamak. Dişiler tarafından yavaşça onları temiz kültür aktarımı yumurtadan nauplial larva kültüründe de dahil olmak üzere diğer hayvanların önlemek için orta pipetting yıkayın.
- Copepodids bireysel kültür için toplamak.
- Taranmış nauplii ile plakalar da kuluçka makinesine tutmak ve onlar ilk copepodid (CI) sahne alanı'na (Şekil 4, orta) geliştirmek kadar nauplii kültür. Bu adım genellikle bir ila iki hafta sürer. Her birkaç ince zemin taneleri ile iyi yem balık yiyecek her iki günde CI hayvanlar için arama yaparken. Buharlaştırılmış yetiştirme su distile su ile doldurma.
Not: Eğer yüzen enkaz görünümü engellenmemesine, bu küçük bir parça kağıt havlu ile yağsız. - CI hayvanlar ortaya çıkmaya başlar başlamaz, P-10 micropipette ile kuyulardan pipetting hacmi yaklaşık 8 µL bir stereomicroscope 10 X 40 X büyütme (Şekil 4, sağ) altında ayarlamak ile koleksiyon yapıyorum. Yavaşça içinde temiz yapay deniz suyu pipetting tarafından her CI hayvan yıkama ve 2-3 mm Derinlik (yaklaşık 400-600 µL) yapay deniz suyu içeren 24-şey hücre kültür kalıbının kuyuya yerleştirin.
Not: nauplial exuviae veya bireysel kültür için kuyu içine diğer hayvanlar üzerinde taşıyan kaçının.
- Taranmış nauplii ile plakalar da kuluçka makinesine tutmak ve onlar ilk copepodid (CI) sahne alanı'na (Şekil 4, orta) geliştirmek kadar nauplii kültür. Bu adım genellikle bir ila iki hafta sürer. Her birkaç ince zemin taneleri ile iyi yem balık yiyecek her iki günde CI hayvanlar için arama yaparken. Buharlaştırılmış yetiştirme su distile su ile doldurma.
- Bireylerin gelişim molted exuviae sayarak izlemek.
- Molted exuviae için her şey içinde (gerekirse frekansını ayarla) her iki üç günde bir karanlık alan aydınlatma 10 X 40 X büyütme altında stereomicroscopic gözlem tarafından inceleyin. Copepodids exuviae şeffaf ve tanınabilir bacaklar kabardı, bir çift kaudal rami (Yani, çıkıntılı yapıları kaudal sonunda ince) ve/veya bölümleme prosome ve urosome (Şekil 5). Odak ve aydınlatma farklı derinliklerde exuviae bir kuyu (Şekil 6A) algılamak için değiştirin.
Not: Molted exuviae onları molted animal küçüktür. Bir hayvan ve görece yeni exuviae ve üst karakter için daha düşük büyütme muayene büyük (Yani, asgarî) exuviae için daha yüksek büyütme başlar.
Not: exuviae bir kuyu içinde bozuksa, gelişim dönemleri hata önlemek için daha fazla gelişimsel izleme kuyudan ortadan kaldırmak.
Not: Eğer yüzen enkaz görünümü (Şekil 6B) engelleyen, bu küçük bir parça kağıt havlu ile yağsız. - Bir toplam copepodid exuviae (Şekil 7) plaka kapağındaki taksitli işareti bulunan her iyi kaydedin. Yeni bir exuviae kuyuda bulundu gibi bir çizgi işareti ekleyin.
Not: nauplial exuviae kuyuda kontamine varsa, onları sayımdan ortadan kaldırmak. - Her bireyin iki taneleri ile ince zemin yem balık yiyecek. Buharlaştırılmış yetiştirme su tuzluluk korumak için distile su ile doldurma.
Not: copepodids tüketen ve potansiyel gelişim aşaması (adım 1.3.4) tahmini etkileyebilir molted exuviae zarar engellemek için 2-3 günde bir yem. - Exuviae sayısına göre hayvan gelişim aşamasında tahmin ediyoruz. Yok exuviae ise, bireysel CI aşamada olduğu tahmin edilmektedir. Birden dörde kadar exuviae varsa, bireysel CII CV aşamalara olduğu tahmin edilmektedir. Beş exuviae varsa, bireysel bir yetişkin olduğu tahmin edilmektedir.
- Molted exuviae için her şey içinde (gerekirse frekansını ayarla) her iki üç günde bir karanlık alan aydınlatma 10 X 40 X büyütme altında stereomicroscopic gözlem tarafından inceleyin. Copepodids exuviae şeffaf ve tanınabilir bacaklar kabardı, bir çift kaudal rami (Yani, çıkıntılı yapıları kaudal sonunda ince) ve/veya bölümleme prosome ve urosome (Şekil 5). Odak ve aydınlatma farklı derinliklerde exuviae bir kuyu (Şekil 6A) algılamak için değiştirin.
- Morfoloji üzerinde dayalı yetişkin seks tanımlayın.
- Onların morfolojisi inceleyerek seks hayvanlar. Yetişkin Tigriopus erkek geniculate ilk anten çengel ve küresel yapıdaki distal uçta (Şekil 3A) sahip. Yetişkin kadın daha yumuşak ve nispeten ince ilk anten (3B rakam) bu erkeklerin daha sahip. Bazı kadınlar da koyu yeşil renk (Şekil 3B, 3D) vücudunda gonad lipid gelen sergi.
- Kuyu (Şekil 7B) kapağını açık cinsiyet işaretleyin.
2. davranışsal Test ve dostum koruma davranışı, Video kayıt
- Test gününde hayvanlar istenen sahne ve seks için davranışsal bir test seçin.
- Seçilen bireylerin kültür Wells ince zemin balık gıda ile yem ve 30 dakika boyunca yemek izin. Bu arada, adım 2.1.2 test odaları hazırlamak için devam edin.
- Chambers'ı test olarak iki 48-şey düz dipli hücre kültür tabak hazırlamak; bir tabak (bundan sonra "a tabak" olarak da adlandırılır) Erkekler için olduğunu ve diğer ("B") için hedef (Örneğin copepodids, Yetişkin kadın, yetişkin erkekler) plakadır. 400 µL temiz yapay deniz suyu tuzluluk Wells plakaların % 35 olarak ekleyin. Tabakları yarı şeffaf akrilik sedye ile hafif bir difüzör (Şekil 8) kaplı bir LED ışık yastık yerleştirin.
Not: farklı ortama bağlı olarak bir deneme amacı kullanın.
Not: aşırı ısı önlemek için akkor veya flüoresan lambalar bir arka ışık kullanmayın. - 30-dak besleme saat sonra 2.1.1 içinde açıklanan, her hayvan yavaşça içine dört kuyu temiz yapay deniz suyu (etkilenmişimdir enkaz ve kültür kuyulardan exuviae önlemek için,Şekil 9) ile dolu bir 24-şey plaka yapımı bir arkaya tarafından pipetting yıkayın.
- LED ışık panelindeki A ve B plakaların Wells durulanır bireyler yerleştirin. Hayvanlar kuyuları için düzeltilmesi için 30 dakika izin verin.
- Bir video kamera üzerinde plaka A ayarlama dönemi (Şekil 8) sırasında ayarlayın. Bir tripod veya bir stand kamera tutmak için kullanın.
- Kamera plaka bir gözlem anten izin için A içinde erkek odaklanmak.
Not: film arka ışık titrek azaltmak için küme bir kare hızına eşit veya bir elektrik frekansı yarısı ve daha uzun bir çekim hızı kullanmak. Ayrıca, 2.1.2. adımda açıklandığı gibi şeffaf akrilik sedye ile kaplı LED ışık pad tutun.
- 2.1.4. adımda anlatılan ayarlama dönemi sonra video kaydı ve davranış testi başlatın.
- Hedefleri plaka B plaka A Pasteur pipet ile aktarın. Deneme hassas ortamda kimyasal bileşenleri için ise, pipetler test etme her çifti için değiştirin.
Not: su bozukluğu hayvan teşvik ve aşırı hareketini öğrenmek gibi bir hayvan plaka B pipetting zaman, bu Pasteur pipet ile suda takip. Biraz su yüzeyi üzerinde pipet ucu tutun ve ucu altında gelmek birey için bekleyin. Yavaşça pipette o kadar yapay deniz suyu küçük bir miktar ile ve sonra plaka A. üzerinde bir kuyuya çıkartın - Deneysel bir plana göre bir erkek ve bir hedef aktarımdan sonra bir istenen süre gözlem (Örneğin 10 dakika) için her kuyuya etkileşimine izin verir.
- Gözlem süre sonra video kaydı durdur. Gerekirse, download kameradan bilgisayara kaydedilen filmler.
- Hedefleri plaka B plaka A Pasteur pipet ile aktarın. Deneme hassas ortamda kimyasal bileşenleri için ise, pipetler test etme her çifti için değiştirin.
3. el ile analiz davranış özellikleri
- Her hedef plaka A. kuyuya aktarıldığında film zamanlaması için inceleyin
- Başlatma ve sonlandırma zamanlama ilgi etkinlikleri incelemek ve süresi, gecikme süresi ve olayları sıklığı hesaplamak.
- İnisiyasyon bir erkek tarafından koruma girişiminin bir kişiyi hedef (Şekil 10, sol üst) herhangi bir vücut parçası ile erkeğin anten tanımlamak için kullanılır. Antennal iletişim genellikle bir swift tarafından öncesinde (< 0,5 s) takip ya da pençe.
- Her iki anten erkek bir hedef (Şekil 10, sağ üst) vücuttan ayırdığınızda fesih koruma girişiminin bir noktası olarak tanımlayın. Gibi girişimleri koruyan frekansını hesaplamak:
- Birleşme inisiyasyon bir urosome karşı bu kadın (Şekil 10, sağ alt) yinelenen bir basın tarafından takip bir erkek dorsal vücut eğimli tanımlayın. Saniyede birkaç kez basarak sıklığıdır.
Not: Koruma bir erkek bir kadının vücut birleşme (Şekil 10, sol alt) önce kaudal sonu aşağı dökülüyor. - Birleşme sona ermesi urosomes dekolmanı 3.2.4 içinde anlatılan olayların sonra tanımlayın.
Not: Çiftleşme genellikle T. californicus ve T. japonicusdurumlarda birkaç dakika için yer alır.
4. iki boyutlu izleme bireyler ve çiftleri
- Faiz (Örneğin ilk 3 bir koruma girişimi s) dizisinin bir adım 2 film düzenleme yazılımı ile kaydedilen film çıkararak featuring bir video klibi oluşturmak.
- ImageJ14 den yükleyin: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. O zaman MTrackJ, ImageJ15, hareket izleme eklentisi tarafından üzerinde talimatları download: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
- Açık ImageJ ve içe ilgi bir film (Örneğin, Dosya > içe > kullanarak QuickTime; görüntü işleme için gerekli bellek miktarını azaltmak için "Convert 8 bit gri tonlama" seçin).
- Kayma ve zaman kalibrasyon gerçekleştirin.
- ImageJ penceresinde kayma kalibrasyon için düz çizgi seçim aracını seçin.
- Bilinen uzunluğu (Örneğin bir kuyu çapı) olan bir nesne boyunca bir seçim çizgi film penceresinde çizmek.
- "Ölçeği Ayarla" menüsünü açın (Analyze > Ölçeği Ayarla). Bilinen "Mesafe rengin bilinen" kutusunu ve onun birim (Örneğin mm) "Uzunluk birimi" kutusuna girin. Ölçeğin diğer video kırpmak için kullanmak için "Global" onay kutusunu tıklatın.
- "Özellikler" menüsünü açın (görüntü > Özellikler) zaman kalibrasyon için. Çerçeve aralığı (kare hızı karşılıklı) "Çerçeve aralığı" kutusuna girin.
- İzleme MTrackJ ile yapılandırın.
- MTrackJ eklenti eklentileri açmak > ImageJ üzerinde MtrackJ. Bir izleme açmak için MTrackJ iletişim penceresinde "İzleme" düğmesini tıklatın Yapılandırma menü.
- Küme bir izleme aralığı "nokta ekledikten sonra sonraki zaman dizin taşımak" kontrol ederek ve yapılandırma iletişim penceresi "Zaman adım boyu" kutusuna bir sayı girerek. Kare kare izleme gerçekleştirmek için "1" "Zaman adım boyu" kutusuna girin.
- "İzleme sırasında yapışma Uygula yerel imleç" kontrol edin ve bir ek özelliği olarak "karanlık centroid" seçin. Bu seçenek bir algılama kare ("ek aralığı") etrafında bir imleç içinde karanlık bir nesne (Örneğin, bir birey ya da bir çift) centroid bir otomatik olarak algılanmasını sağlar. Tüm çift veya hayvan film (Örneğin 31 x 31 pixels) kapsayacak şekilde kare boyutunu seçin.
- Seçtiğiniz seçenekleri uygulamak için "Tamam" düğmesini tıklatın.
- İki boyutlu izleme gerçekleştirmek.
- İzlemeyi başlatmak için MTrackJ iletişim penceresinde "Ekle" düğmesini tıklatın.
- Bir imleç (algılama kare) bir per veya bireyin izlenmesi gereken kapsayacak şekilde yerleştirin. Kare içindeki nesnenin karanlık centroid bulmak için tıklatın.
- 4.6.2 istenen bir kare sayısı için yineleyin.
- Veri tabloları üretmek için MTrackJ iletişim penceresinde "Ölçü" düğmesini tıklatın. Veriler iki pencerede görüntülenir: "MTrackJ: parça" pencere izlenen iki boyutlu yörünge bir özetini gösterir ve "MTrackJ: puan" her zaman için ayrıntılı verileri gösterir. Her tabloyu kaydetmek için dosyayı seçin > Save as... ImageJ menüsünden.
Not: her veri sütun tanımları için geliştirici (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) tarafından sağlanan çevrimiçi el kitabına bakın. - Renkli bir çizgi olarak çizilmiş izlenen bir yörünge ile bir film üretmek için MTrackJ iletişim penceresinde "Film" düğmesini tıklatın. Oluşturulan film kaydetmek için dosya seçin > Save as... ImageJ menüsünden.
- Tüm sonuç kaydedin. MTrackJ iletişim penceresinde (adım 4.6.4) veri ve izlenen iki boyutlu yörünge (adım 4.6.2 ve 4.6.3) de dahil olmak üzere sonuçları kaydetmek için "Kaydet" düğmesini tıklatın.
Representative Results
1. adımda açıklanan bireysel kodlamayla yöntemi hazırlık ve eşleştirme önce hiçbir deneyiminiz olmadan bakire hayvanların evreleme sağlar.
2. adımda açıklanan davranış testi video kayıt ve Tigriopus kopepodların dostum koruyan davranışlarının gözlem verir. 3 ve 4 numaralı adımlarda açıklanan yöntemleri ile kaydedilen video aşağıdaki incelenmesi Şekil 1' de gösterilen davranış çeşitli yönlerini kantitatif analiz sağlar.
Şekil 11 girişimleri arasında kadın-erkek çiftleri ve T. californicuserkek-erkek çift koruma ortalama süresi bir fark gösterir. El ile bir analiz erkek-erkek çifti kadın-erkek çiftleri eşleştirme nispeten daha kısa süre gösterdi gösterdi.
Hız analiz temsilcisi sonucu Şekil 13' te gösterildii ve analiz yöntemi ile izlenen yörüngeleri örnekleri Şekil 12 ' karşılaşır. T. californicus yeni kurulan koruma çiftleri iki boyutlu kayma izleme ortaya erkek-erkek çift erkek-erkek çifti daha yüksek hız ilk 3'te göstermek eğiliminde girişimleri denetim koruma s.
Resim 1: Mate koruyan davranışlara Tigriopus. (A) (mavi oklarla gösterilen) ilk anten ile bir çocuk (copepodid) clasping yetişkin bir erkek. Çubuk = 1 mm. (B) bir taslağını dostum koruma davranışı. Bir erkek bir hedef bireysel (solda) yakalamak çalışır ve bu (orta) ile bir çifti oluşturur. Erkek-erkek çifti ve bazı kadın-erkek çifti, bir koruma girişimi birleşme sona erer. Bu rakam Tsuboko-lshii ve Burton 20175değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Gelişim aşamalarında Tigriopus. Tigriopus türler genellikle altı nauplius aşamaları (dan NI in için), beş copepodid aşama (gelen CV CI) ve bir yetişkin sahne (CVI)16tabi. Erkek koruma copepodids (CI T. japonicus ve T. fulvus6,17) ve CII T. californicus3erken bir aşamada gelen gençlere yanı sıra her iki cinsiyette5 Yetişkin girişimde . Bu rakam Tsuboko-lshii ve Burton 20175değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Morfoloji yetişkinlerin (T. californicus). (A) yetişkin erkek. (B) yetişkin kadın. (C) Gravid bir yumurta sac (Açık turuncu) yumurta döllenmiş ve gelişmiş ile yetişkin kadın var. (D) Gravid yetişkin kadın döllenmemiş veya gelişmemiş bir yumurta kesesi ile (koyu yeşil) yumurta. Oklar yumurta kesesi gösterir. Çubuk 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: anahat bireysel kültür için hazırlık. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Molted exuviae. CV aşamalarında T. californicustek bir hayvan için (A) Exuviae CI üzerinden. Çubuk 1 mm. (B) = CV için gelen CI Exuviae aşamalarında bireysel bir kültürde de. Beyaz enkaz dışkı (resimde gösterilmemiştir) iyi kültürlü bir hayvan var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: arama için bir stereomicroscope altında exuviae. Barlar = 1 mm. (A) odak değişimi exuviae farklı derinliklerde algılanması için bir stereomicroscope. Kırmızı oklar, odaklı exuviae gösterir ve gri oklar odaklanmamış exuviae gösterir. En iyi görüntü, kuyunun dibinde batık olduğu sol exuviae üzerinde odaklanır. Alt görüntü orta yüzeyin altında yüzen doğru exuviae üzerinde duruluyor. (B) en iyi görüntü orta yüzeyinde yüzen enkaz tarafından muayene tıkanıklık bir örneği gösterilir. Yeşil ok enkaz altında gizli bir exuviae gösterir. Alt görüntü yüzey kağıt havlu küçük bir parça ile temizleme sonucu gösterir. Bir exuviae (yeşil okla gösterilen) temizlendikten sonra görülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: hazırlama ve hayvanların seks. Mark exuviae sayısı ve kültür plaka kapağındaki hayvanların seks ilgili örnekler. (A) için beş exuviae ve yetişkin bir hayvan içeren iyi bir örnek. Hedeften hiçbir iz işareti kapağındaki satırlarının sayısı kuyuda bulundu exuviae sayısını temsil eder. Exuviae sayısı beş ulaştığında, hayvan seks üzerinde anten morfoloji göre belirlenebilir (Ayrıca bkz: Şekil 3). (B) işaretli bir kapak bir kültür plaka örneği. Büyük (CIV Yetişkin) hayvanlar üst satırları içeren ve Genç (Yani, yeni toplanan) hayvanlar (CIII CI) alt satırlar içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: davranış test planı. Kur dostum koruma davranışı (solda), video kayıt ve bir taslağını davranış testi (sağda). Bu rakam Tsuboko-lshii ve Burton 20175değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: durulama davranışsal bir denemedir önce hayvanların Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10: el ile yapılan analizde muayene olayların tanımı. Çizimler olayların dostum koruma ile ilgili olarak gözlendi. Tanımlanan ve 3. adımda analiz olayların adları vurgulanır. Noktalı bir çizgi içine olaylar bazı dostum koruma girişimleri görülmektedir değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 11: Fark erkek-erkek çifti ve T. californicuserkek-erkek çift arasındaki süre koruma. Her üçgen sembol test edilmiş iki tane verileri temsil eder. Barlar ve bıyık medians ve interquartile aralığı sırasıyla temsil eder. Yakalama ortalama süresi için erkek-erkek çift büyük (kadın-erkek (n = 22), erkek-erkek (n = 29); **p < 0,01 Mann-Whitney U testi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 12: yörüngeleri çiftlerinin ilk üç saniye içinde girişimleri denetim koruma. Kadın-erkek çiftleri (solda) ve erkek-erkek çift (sağda) T. californicusizlenen iki boyutlu yörüngeleri örnekleri. Yörüngeler noktalar zaman puan (saniyede 30 kare) temsil eder. Barlar 10 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 13: Kadın-erkek çiftleri ve T. californicuserkek-erkek çift arasında koruma başlatma sonra ortalama hız farkı. Her üçgen sembol test edilmiş iki tane verileri temsil eder. Barlar ve bıyık medians ve interquartile aralığı sırasıyla temsil eder. Ortalama hız olarak ilk 3 çiftinin s girişimleri denetim koruma için erkek-erkek çift büyük (kadın-erkek (n = 13), erkek-erkek (n = 35). ***p < 0,001 Mann-Whitney U testi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 1: tedavi Tigriopusdavranışını durulama etkisi. Her daire veya üçgen sembol bir test tek tek veya çift veri temsil eder. Barlar ve bıyık medians ve interquartile aralığı sırasıyla temsil eder. Dışında ki "durulanır değil" Grup 30 dakika ayarı saatinden (adım 2.1.4) durulama tedavi (adım 2.1.3) deneyimim olmadı "durulanır" ve "değil durulanır" gruplar bireylerde aynı şekilde ele. (A) durulanır erkeklerin ortalama hız değil durulanır erkekler daha büyük olma eğilimi (durulanır (n = 6), değil durulanır (n = 6), NS: anlamlı bir fark Mann-Whitney U tarafından tespit edildi test). Hız için 30 ölçüldü videoları dayalı s ayarlama süre sonra kaydedildi. (B) durulanır kadın ortalama hız değil durulanır dişiler daha büyük olma eğilimi (durulanır (n = 6), değil durulanır (n = 6), NS: anlamlı bir fark Mann-Whitney U tarafından tespit edildi test). Hız için 30 ölçüldü videoları dayalı s kaydedilmiş ayarlama süre sonra adım 4 takip (izleme aralığı 0.5 = s). (C) frekans girişimleri denetim koruma için durulanır bireylerin çiftleri büyük (durulanır (n = 6), değil durulanır (n = 6). ** p < 0,01 Mann-Whitney U testi). (D) girişimleri denetim koruma süresi için durulanır bireylerin çiftleri daha büyük olma eğilimi (durulanır (n = 6), değil durulanır (n = 6), NS: anlamlı bir fark Mann-Whitney U tarafından tespit edildi test). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bireysel kültür ve sahne ve cinsiyet belirlenmesi
Burada bizim önceki çalışma5 ' bakire Tigriopus hayvan eşleştirme deneyimlerini kendi geliştirme (Şekil 4 ve Şekil 7) izleme sırasında kontrol ile hazırlamak için kullanılan yöntem açıklanmıştır. Tigriopus türler toksikoloji16,18, ekolojik Fizyoloji19,20,21, gibi çeşitli biyolojik alanlara modeli hayvanlar gibi kullanıldıkça ve evrimsel genetik13,22,23,24, bu yöntem çevresel ve genetik faktörlerin etkisi bu kopepodların, yaşam döngüsü değerlendirmek için değerli bir araç sağlamak için bir potansiyele sahiptir.
Daha sonraki aşamalarında koleksiyon hayvanlar mis evreleme neden olabileceğinden başarılı evreleme, normal arama ve CI topluluğu elde etmek için copepodids bir kitle kültüründen (adım 1.2) önemlidir. Buna ek olarak, exuviae (adım 1.3) için ayrıntılı bir arama da doğru evreleme için esastır. Toplama ve molts arasındaki aralığı 1 ila birkaç gün tür bağlı olarak değişir gibi gerekirse, evreleme ve koşul2,25,26yetiştirme frekans artırmak. Anten morfoloji copepodids ve yetişkin kadın arasındaki farkları bazı tür ve Tigriopus16,25içinde gözle görülür önemli değildir. Bu nedenle, seks öncesinde evreleme yetişkin kadın her iki cinsiyetten gelişmiş copepodids ayırt etmek yararlıdır.
Davranış testleri ve davranışsal özellikleri el ile Analizi
Genel olarak, ethological çalışmaların en önemli parçalarından biri tanımı ve ilgi etkinlikleri açıklaması var. Bu raporda sunulan yöntemleri ilk bizim son çalışma5 için geliştirilmiş olup, birleşme ve görsel araçlar (Şekil 10) açıklama ile desteklenmiştir. Buna ek olarak bu tutarlılık hayvan işlemedeki davranış deneylerde de önemli bir rol oynar. Örneğin, kopepodların durulama potansiyel olarak onların davranış (Tamamlayıcı Şekil 1) bazı yönlerini kolaylaştırabilir ve bu nedenle örnekleri, aşağıdaki gibi adım 2.1.3 standart arasında tutarlı bir şekilde gerçekleştirilmesi için arzu edilir. Biz bu yazıda sağlanan malzemeler kontrollü ve tekrarlanabilir çalışmalar Tigriopusyüksek gelgit havuzları, bol bu sakini üreme ve ekolojik çalışmaların teşvik, dostum koruyan davranışları üzerinde size yardımcı olacaktır bekliyoruz.
Bir olası bu yöntemle elde edilen görüntülerin düşük büyütme kısıtlamadır. Sistemimiz ile kaydedilen filmler urosomes ve erkek ilk antenler de dahil olmak üzere önemli vücut yapıları tanımlaması olanak, ancak bir değil istihdam beri bizim yöntemi ile daha fazla ince yapıları gibi bacaklar ve genital gözlemlemek mümkün olmayabilir mikroskobik büyütme video kaydı için. Onlar erkek T. japonicus dişilerini 100 X büyütme (kaydedilen video) mikroskobik bir gözlem altında transfer spermatophore gözlemlemek başardık Kelly ve ark. rapor ederken7, biz henüz gözlemlemek mümkün bir Belki de görüntü çözünürlüğü sınırlaması nedeniyle bizim filmlerde spermatophore.
Çiftleri iki boyutlu izleme
Bu yöntem hayvanların üç boyutlu izleme izin vermez, ancak bu sağlar plankton iki boyutlu yörünge Analizi kimyasal olarak hayvanlar (cf. etiketleme olmadan Ve ark. 201027domuz yağı) tarafından ücretsiz dağıtılan programları kullanmak. Film dosyasının boyutu ImageJ içinde işlenecek çok büyükse, bir dosyanın çözünürlüğünü azaltmak ve bir gri ölçekli film haline dönüştürmek. Açıklanan yöntemi was orijinal Gelişmiş- T. californicus (Şekil 12 ve Şekil 13) Yetişkin çifti için iken, ayrıca yetişkin-çocuk çift ve tek birey (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak kullanılabilir de diğer Tigriopus tür olarak ilke. Biz daha fazla plankton uygun ayarlamalar ile diğer özellikleri (gelen ikinci zaman ölçekler için milisaniye) kısa dönem için geçerli yörünge analizi için yöntem bekliyoruz.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Sumitomo Vakfı, Japonya dan gelen hibe tarafından desteklenmektedir (temel bilim ve araştırma projelerine, erişim izni verme numarası: 150932) ve araştırma deniz omurgasızlar Enstitüsü, Japonya (2018 bireysel araştırma bursu) Şti ve RSB ve bir hibe için ABD Ulusal Bilim Vakfı (DEB-1556466) RSB. Bayan Kiana Michelle Woodward kodlamayla ve hazırlama yöntemi geribildirim için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
- Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
- Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
- Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
- Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
- Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
- Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
- Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
- Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
- Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
- Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
- Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
- Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
- Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
- Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
- Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
- McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
- Hagiwara, A., Lee, C. -S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
- Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
- Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
- Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
- Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
- Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
- Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
- Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).
