Summary
Este protocolo describe el uso de virutas de plástico a la cultura y compartimentar primarias neuronas murinas. Estos chips son confecciones, fácil de usar y compatible con alta resolución, en directo y la proyección de imagen de la fluorescencia. Este protocolo describe cómo las neuronas hippocampal de la rata dentro de estos chips de la placa y realizar la inmunotinción, axotomía y aislamiento fluídica.
Abstract
Recientemente métodos para compartimentar las neuronas se han convertido en herramientas esenciales para muchos neurocientíficos. Este protocolo describe el uso de una viruta plástica premontada disponible comercialmente para compartimentar las neuronas hippocampal cultivadas rata primaria. Estas virutas de plástico, dentro de la huella de un portaobjetos de microscopio estándar, son compatibles con alta resolución, en directo y la proyección de imagen de la fluorescencia. Este protocolo muestra cómo retrógrada neuronas etiqueta vía axones aislados usando un virus de la rabia modificado codificando una proteína fluorescente, crear microambientes aislados dentro de un compartimiento y realizar axotomía e inmunocitoquímica de la en-viruta. Las neuronas se cultivan por > 3 semanas dentro de las virutas de plástico, que ilustra la compatibilidad de estos chips para culturas neuronales a largo plazo.
Introduction
Cultura tradicional de la neurona acerca a resultado en consecuencia aleatoria de axones y dendritas, que impiden el estudio de las neuronas en su singular morfología polarizada. Dispositivos multicompartment recientemente se han convertido en herramientas de investigación bien establecido y usado para neurocientíficos en los últimos 10-15 años (alto perfil publicaciones son referencia1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). estos dispositivos compartimentar las neuronas y proporcionan un método para físicamente y químicamente manipular regiones subcelulares de las neuronas, incluyendo Somas, dendritas, axones y sinapsis18,19. También brindan múltiples paradigmas experimentales que no son posibles con las culturas al azar, incluyendo estudios de transporte axonal, la síntesis de proteínas axonal, lesión y regeneración del axón y axón al soma de señalización. La configuración básica de 2 compartimientos consiste en dos canales de microfluidos paralelas separados por una serie de pequeños micro-ranuras perpendicular. Neuronas primarias o derivadas de células madre se platean en uno de los canales de microfluidos, instalarse y fije a la superficie inferior del dispositivo y neurites se extienden a lo largo de días. Muchos conos de crecimiento encuentran su camino en las micro-ranuras, que son lo suficientemente pequeños que impiden que los cuerpos de célula entrando. Porque los conos de crecimiento son físicamente restringidos y no pueda girar alrededor en las micro-ranuras crecen directamente en el compartimiento adyacente (compartimiento axonal) donde están aisladas.
Históricamente, estos dispositivos han sido moldeados con poly(dimethylsiloxane) (PDMS) de un molde maestro photolithographically modelado y hechos internos en laboratorios de investigadores o adquiridos comercialmente. Uno de los principales inconvenientes del uso de PDMS es su hidrofobicidad20. PDMS pueden ser hidrofílicas temporalmente, pero luego rápidamente se vuelve hidrofóbico dentro de horas en un ambiente no acuoso20. Debido a esto, los dispositivos deben fijarse a un cubreobjetos de cristal o de otro sustrato adecuado en el momento de uso. Chips multicompartment plástico premontados ahora están comercialmente disponibles (e.g., XonaChips) en plástico moldeado por inyección. Estos chips son hidrofílicas permanentemente, simplificar el dispositivo humectante y permitiendo al premontaje de la viruta con una fina película de copolímero de olefina cíclica (COC) que incluye los microfluidos canales en la parte inferior. Estos chips son fabricados en un plástico ópticamente transparente adecuado para imágenes de fluorescencia de alta resolución.
El propósito de este protocolo es demostrar el uso de los chips microfluídicos premontado de plástico para múltiples paradigmas experimentales realizados con neuronas de hipocampales o corticales murinas. Este protocolo describe cómo retrógrado las neuronas de la etiqueta usando un virus de la rabia modificado dentro de la viruta. Axotomía estudios de lesión del axón y de la regeneración también se describen. Por último, este protocolo muestra cómo realizar immunostaining de fluorescencia con el dispositivo.
Protocol
Nota: Un esquema de la viruta multicompartment plástica se muestra en la figura 1A, B. El chip es del tamaño de un portaobjetos de microscopio estándar (75 mm × 25 mm). Las características de la viruta, incluyendo canales principales o compartimientos, pozos y micro-ranuras se etiquetan y se proporcionan para la referencia futura. Figura 1 es una fotografía del chip demostrando el aislamiento fluídico de los compartimientos.
1. preparación y recubrimiento de Chips Multicompartment
- En un gabinete de bio-seguridad, coloque el chip en una placa de Petri u otro recipiente estéril adecuado.
- Añada 100 μl de la pre-capa solución para la superior izquierda bien del chip y permite que fluya a través del canal principal en el contiguo bien.
Nota: La solución de la capa se utiliza para la capa de los canales de microfluidos para eliminar la posibilidad de atrapar burbujas de aire dentro de la viruta. - Llenar la parte inferior izquierda con 100 μl de la solución de la capa. Espere 5 minutos para permitir que la solución fluya a través de las micro-ranuras.
- Añada 100 μl de la pre-capa solución a la parte superior derecha bien y permite que fluya a través del canal principal en el contiguo bien. Llenar el pozo inferior derecha con 100 μl de la solución de la capa.
- Aspirar la solución de cada pozo. Aspire de los canales principales para evitar la eliminación de líquido de los canales principales (figura 2A). Inmediatamente añadir 150 μL de tampón fosfato salino (PBS) a la parte superior izquierda bien. Esperar 1,5 min.
PRECAUCIÓN: No aspirar todo el líquido de los canales principales cerrados. - Añadir 150 μL PBS a la parte inferior izquierda bien. Espere 5 minutos para permitir que los líquidos a fluir a través de las micro-ranuras. Añadir 150 μL PBS a la parte superior derecha también. Añadir 150 μL PBS para bajar bien bien. Esperar 10 minutos.
- Repita los pasos 1.5-1.6 para un segundo lavado con PBS.
- Comprobar el chip bajo un microscopio de cultivo de tejidos para las burbujas en los canales principales. Si hay burbujas, realizar los procedimientos siguientes. Si no hay burbujas presentes, vaya al paso 1.9.
- Aspire el PBS de los pozos de pesca la punta de la pipeta del canal de apertura (figura 2A).
- Añada 100 μl de la capa previa solución en el pozo superior, ángulo de la punta de la pipeta cerca de la canal de apertura (figura 2B). Las burbujas deben moverse a través del canal en el pozo inferior. Esperar 1,5 min.
- Repita los pasos 1.3-1.8.
- Aspire el PBS de los pozos de pesca la punta de la pipeta del canal de apertura (figura 2A).
- Añada 100 μl de 0.5 mg/mL poli d-lisina (PDL) a la superior izquierda bien de la viruta. Esperar 1,5 minutos llenar la parte inferior izquierda con 100 μl de PDL.
- Añada 100 μl del PDL en el pozo superior derecha del chip. Esperar mínimo 1,5 agregar 100 μl al pozo inferior derecha.
- Cierre la placa Petri y colocar el chip en una incubadora a 37 ° C durante 1 hora.
- Repita los pasos de lavado PBS 1.5-1.6 dos veces para eliminar el exceso PDL.
- Aspire el PBS desde el dispositivo.
- Añadir 100 μl de medio de cultivo celular para la superior izquierda bien de la viruta. Espere bien 1,5 min agregar medios a la parte inferior izquierda. Añadir los medios de comunicación a la parte superior derecha también. Esperar mínimo 1,5 agregar 100 μl de medio al pozo inferior derecha del chip.
- Colocar el chip en la incubadora de 37° C hasta que esté listo a las células de la placa.
2. siembra las neuronas en las fichas Multicompartment
- Preparar la suspensión de la célula de neuronas hipocampales de rata disociada según protocolos establecidos21,22 para rendir una densidad de ~ 12 x 106 células/mL.
Nota: El uso de densidades de células suspensión entre 3 y 12 x 106 células/mL es posible. Si se utiliza una densidad más baja, se puede aumentar el volumen de la suspensión celular que se añade a la viruta (véase abajo). El procedimiento descrito a continuación es aplicable para murinas neuronas disociadas de hipocampales o corticales. Densidad celular óptima para otros tipos de neurona puede variar. - Eliminar la mayoría de los medios de comunicación en cada pocillo de la viruta, dejando aproximadamente 5 μL en cada pocillo. Aspire de los canales principales para evitar la eliminación de líquido de los canales principales (figura 2A).
PRECAUCIÓN: No aspirar cuidadosamente el líquido de los canales principales cerrados. Burbujas de aire pueden entraparse en el chip si se aspira líquido de los canales principales. - Carga 5 μl de la suspensión celular en la parte superior derecha bien y otra 5 μl de la suspensión celular en el pozo derecha inferior (total ~ 120.000 células). Las células de carga de distribución cerca del canal principal (figura 2B). Ver bajo el microscopio para que las neuronas están en el canal principal. Espere 5 minutos permitir que las células a conectar.
Nota: Las neuronas se pueden cargar en cualquiera de los compartimientos. Para propósitos de explicación, el compartimiento somático es el canal principal en el lado derecho, pero puede utilizarse cualquiera de los compartimientos como el compartimiento somático. Uso de menores densidades de célula hasta 60.000 células por chip es posible. Hasta 10 μl de células suspensión puede agregarse a cada uno del compartimiento somático en combinación con una suspensión con menos células que se describe anteriormente. - Agregar aproximadamente 150 μL neuronal de medios de cultivo para cada una de las superior e inferior derecha wells y luego agregar 150 μL de medios de comunicación a cada uno de la parte superior e inferior izquierda pozos. Coloque el chip en bandeja humidificada en una incubadora de 37 ° C de 5% CO2 .
- Después de 24 h, realizar un cambio de los medios de comunicación mediante la eliminación de los medios de comunicación de los pozos. Asegúrese de que el canal principal permanece lleno. Añadir 150 μL de medios de comunicación a cada pozo superior y luego llenar los pozos de la parte inferior.
- Vuelva a colocar el chip en la incubadora para el número deseado de días.
Nota: Vigile los medios de cada par de días para asegurarse de que permanece la luz color de rosa. Los medios de comunicación son amarillenta, reemplazar 50% con medio fresco. Si el nivel de líquido es bajo, asegúrese de que haya suficiente humedad y adecuada Contención secundaria de los chips para evitar la evaporación. Cambios de los medios de minimizar o incluso eliminar, es posible utilizar Contención secundaria o cubriendo el plato que contiene el chip con politetrafluoroetileno (PTFE)-película de FEP.
3. retrógrada etiquetado de neuronas dentro de la viruta
Nota: Etiquetado retrógrada puede realizarse mediante múltiples técnicas, incluyendo el uso de virus de la rabia y la toxina cólera modificado. A continuación las instrucciones para el etiquetado de las neuronas utilizan virus rabia mCherry o eGFP - G-suprimido. Manejar los materiales potencialmente infecciosos según las directrices de la organización local. Entrenamiento adicional puede ser necesario.
- Medios de cultivo neuronal fresco caliente a 37 ° C. Estimar ~ 400 μL de medio por chip.
- Diluir 100.000 unidades virales de virus de la rabia modificado en un total de 50 μL usando medios de cualquiera bien del compartimiento axonal.
Nota: Dispone de puntas y tubos en contacto con el virus según el protocolo aprobado por la organización. - Suavemente pipeta tubo de los restantes medios de comunicación de los pozos del compartimiento axonal y almacén en una centrifugadora a 37 ° C.
- Añadir 150 μL de medios de comunicación tibia fresca y 50 μl de virus diluido del compartimiento axonal. Incubar por 2 h a 37 ° C la incubadora.
- Quitar los medios de comunicación que contienen virus y deséchelo adecuadamente.
Nota: Las burbujas de aire pueden entraparse en el chip si se aspira líquido de los canales principales. - Suavemente añadir 75 μl de medio fresco a un axón bien y deje que fluya bien el otro axón.
- Quitar flujo de axón del segundo bien y deseche adecuadamente.
- Repita los pasos 3.6 y 3.7 una vez.
- Añadir nuevo medios almacenados en el compartimiento axonal. Agregar aproximadamente 50 μl fresco los medios de comunicación, si es necesario, para mantener un volumen adecuado y volver a las células a la incubadora.
Nota: La expresión de la proteína fluorescente es visible por 48 h y persiste hasta por 8 días. Las neuronas pueden ser reflejadas por hasta 30 min a temperatura ambiente en medios de cultivo neuronal. Medios de cultivo pueden también reemplazarse con calentado CO2-independiente de hibernación E con B27 y reflejada para ya. Las neuronas también pueden ser reflejadas dentro de una cámara ambiental bien humidificada a 37 ° C y 5% CO2. En este caso, es crítico para reducir al mínimo las pérdidas por evaporación dentro de las fichas, la humidificación que es exacerbado por el calentamiento y puede comprometer la salud de la neurona.
4. neumático aislamiento del compartimiento del Axonal en el Chip
- Quitar 20 μl de la parte inferior izquierda del compartimiento axonal y el lugar en el pozo superior derecha del compartimiento somático. Esperar 2 min para el flujo dentro de cada canal se equilibren.
- Saque 50 μl de los medios de comunicación del compartimiento axonal. Añadir 0,3 μl de hidrazida de 1 mM Alexa Fluor 488 a este medio, mezclar mediante pipeta y vuelve de nuevo al compartimiento axonal. El chip está listo para la proyección de imagen.
Nota: Pueden añadirse otros compuestos de interés. Adición de un colorante fluorescente con un peso molecular similar como el compuesto de interés se recomienda para controlar fluídico aislamiento con el tiempo.
5. realizar la axotomía en el Chip
- Saque media del compartimiento axonal manteniendo la punta de la pipeta de la entrada del canal principal (figura 2A) y guardarlo en un tubo de centrífuga.
- Aspire el compartimiento axonal completamente, colocar la pipeta de aspiración junto a cualquier entrada del canal principal del compartimiento axonal (figura 2B). Seguir la aspiración para 1-2 min Asegúrese de que la solución se retira completamente del compartimiento.
Nota: La presión del vacío para la aspiración debe ser por lo menos 18 pulgadas-Hg para el procedimiento de la axotomía funcione correctamente. - Coloque nuevamente el compartimiento axonal con los medios almacenados y confirmar que los axones son roto mirando el chip bajo un microscopio.
Nota: Si se forman burbujas en el compartimiento axonal al reemplazar los medios de comunicación, repita los pasos 5.1-5.2. - Regresar el chip a la incubadora.
6. fluorescencia Immunostaining dentro de la viruta
- Preparar solución de fijación formaldehído 4% en PBS (formaldehído al 4%, 1 μm MgCl2, 0,1 μm de CaCl2, sacarosa de 120 mM)
- Eliminar la mayor parte de los medios de comunicación en los pozos de la viruta (no seque los compartimientos interiores).
- Inmediatamente añadir 100 μl de solución de fijación a los pozos principales de los compartimientos del axonales y somáticos.
- Después de 1 minuto, añada 100 μl de solución de fijación a los pozos de la parte inferior. Fijar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Eliminar la mayor parte de la solución de los pozos de la viruta (no seque los compartimientos interiores). Inmediatamente agregar 150 μL de PBS a cada uno de los mejores pozos de los compartimientos del axonales y somáticos. Esperar 2 minutos para el PBS en los pozos de la parte inferior.
- Repita el paso 6.5 dos veces.
- Eliminar la mayor parte de la PBS de los pozos de la viruta. Inmediatamente agregar 150 μL de PBS con 0.25% TritonX-100 a cada uno de los mejores pozos de los compartimientos del axonales y somáticos. Espere 15 minutos.
- Eliminar la mayor parte del líquido de los pozos de la viruta y añadir 150 μL de solución de bloqueo (10% de suero normal de cabra en PBS) a cada uno de los mejores pozos de los compartimientos del axonales y somáticos. Espere 15 minutos.
Nota: Soluciones efectivas de bloqueo debe ser específico al anticuerpo secundario, por ejemplo, para un burro contra ovejas de anticuerpo secundario, utilizar suero de burro en la solución de bloqueo. - Eliminar la mayor parte del líquido de los pozos de la viruta y añadir 100 μl de anticuerpo primario (o anticuerpos) en el suero normal de cabra de 1% en PBS a cada uno de los mejores pozos de los compartimientos del axonales y somáticos. Cubierta para minimizar la evaporación y esperar durante 1 hora a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche.
- Eliminar la mayor parte de la solución de los pozos de la viruta (no seque los compartimientos interiores). Inmediatamente agregar 150 μL de PBS a cada uno de los mejores pozos de los compartimientos del axonales y somáticos. Esperar 5 min para el PBS en los pozos de la parte inferior.
- Repita el paso 6.10 dos veces.
- Eliminar la mayor parte del líquido de los pozos de la viruta y añadir 100 μl del anticuerpo secundario (o anticuerpos) en PBS a cada uno de los mejores pozos de los compartimientos del axonales y somáticos. Cubierta para minimizar la evaporación y espere por 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Consulte las instrucciones del fabricante para la dilución recomendada de anticuerpos secundarios. - Repita los pasos 6.10-6.11.
- Si la proyección de imagen dentro de 1 día de inmunotinción, mantener el chip con PBS. Si el chip se almacenarán más de 1 día antes de la proyección de imagen, envolver el plato que contiene el chip en la película de parafina para evitar la evaporación y almacenar a 4 ° C hasta que esté listo a la imagen.
- Para el almacenamiento largo plazo de muestras, pueden utilizar medios de montaje (p. ej., Fluoromount-G).
- Eliminar la mayor parte del líquido de los pozos de la viruta. Utilice una pipeta de plástico desechable de 1 mL para añadir 2 gotas de montaje de los medios de comunicación a cada uno de los mejores pozos de los compartimientos del axonales y somáticos.
- Incline el chip para estimular el flujo de los medios de montaje a través de los canales. Después de 5 minutos agregar 2 gotas a los pozos de la parte inferior. Espere 1 hora antes de la proyección de imagen.
Nota: Después de utilizar medios de montaje no será posible volver a la punta de prueba para otros objetivos.
Representative Results
Después de aproximadamente 5-7 días de crecimiento de la neurona en el chip, es evidente crecimiento axonal. Los chips son compatibles con la proyección de imagen de contraste de fase como se demuestra en la figura 3, que muestra el crecimiento neuronal en 24 días. Las fichas también son compatibles con fluorescencia de imagen (figura 4, figura 5, figura 6y figura 7). Tres días después de la infección de virus de la rabia vía el compartimiento axonal, mCherry positivo las neuronas con axones que se extiende en el compartimiento axonal se reflejada en el chip (figura 4). Para demostrar la capacidad de aislar fluídicamente los compartimientos, un colorante fluorescente de bajo peso molecular (Alexa Fluor 488 hidrazida) fue agregado al compartimiento axonal. Estos resultados son comparables a cámara basada en PDMS17 y demostración la idoneidad de la viruta de plástico para la proyección de imagen de fluorescencia y contraste de fase.
Para ilustrar el crecimiento neuronal con las virutas de plástico y aparatos PDMS, cultivan las neuronas de ambas plataformas y supervisar crecimiento neuronal en el tiempo. La figura 5 muestra el crecimiento neuronal de 3 a 22 días en la cultura; Estos resultados son representativos de 3 experimentos independientes. Crecimiento neuronal es comparable en las dos plataformas de hasta 15 días en la cultura, pero cultura más edad (> 21 días) axones aislados dentro de la viruta plástica aparecen más saludables con menos abalorios (figura 5A). Para visualizar más axones dentro de los compartimientos del axonales immunostained para la β-tubulina III que demuestra crecimiento axonal sano dentro de la plástica fichas a los 22 días en cultivo (figura 5B).
Estudios de lesión y regeneración del axón son comunes utilizando dispositivos microfluídicos compartimentados. Para demostrar la idoneidad de estos estudios usando las virutas, retrógrada etiquetadas neuronas fueron imágenes de antes y 24 h después de la axotomía (figura 6). Una bombilla de retracción y regenerar el axón son ambos axotomía siguiente evidente. Estos resultados son equivalentes a datos utilizando dispositivos basados en PDMS14,17.
Inmunocitoquímica es una técnica común en varios compartimentos dispositivos para visualizar la localización de la proteína. Tras 24 días de cultura, las neuronas dentro de las fichas fueron fijos y manchadas para marcadores sinápticos inhibitorios y excitatorios, vGlut1 y vGat, respectivamente (figura 7). Las neuronas mCherry etiquetado retrógrada eran también reflejada (figura 7). La proyección de imagen se realizó mediante disco de giro confocal con un objetivo 60 × de inmersión de aceite de silicona, demostrando la capacidad para realizar proyección de imagen de alta resolución. Lo importante, espinas dendríticas eran evidentes dentro de una región ampliada, demostrando que las neuronas cultivadas dentro de las fichas estaban formando sinapsis maduritas.
Figura 1 : Un chip de microfluidos dos compartimentos premontado, plástico para compartimentar las neuronas. (A) representación esquemática de la viruta multicompartment mostrando las localizaciones de los pozos superiores e inferiores. (B) un esquema ampliado de la viruta que muestra los canales principales (o compartimientos) y micro-ranuras que conectan los compartimientos. Los canales principales son aproximadamente de 1,5 mm × 7 × 0.060 mm (W × L × H). La anchura y la altura de las micro-ranuras son aproximadamente 0,01 mm × 0,005 mm, respectivamente. La longitud de las micro-ranuras varía dependiendo de la configuración, 0.15 mm a 0,9 mm. (C) A fotografía un chip multicompartment representativo que contienen tinte colorante en cada canal principal o compartimiento demostrando la capacidad fluídicamente aislar cada canal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Pipeteo técnicas necesarias al usar chips de multicompartment plástico. (A) al agregar y aspirando los medios lavados, la punta de la pipeta debe orientarse de la entrada del canal principal como se muestra. (B) cuando carga las neuronas o realizar la axotomía, la punta de la pipeta debe estar inclinado hacia la entrada del canal principal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Una micrografía de contraste de fase que muestra crecimiento neuronal típica dentro de la viruta a los 24 días en cultura. Las neuronas hippocampal embrionarias fueron sembradas en el compartimiento derecho somático. Crecimiento del Axon es visible en el principio de compartimiento axonal en 5-7 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Neuronas etiquetadas retrógradas expresar la proteína fluorescente mCherry y axones se extienden a un compartimiento axonal fluídicamente aislado. (A) una micrografía de fluorescencia combinada mostrando las neuronas etiquetadas retrógradas vivo infectadas por un virus de la rabia mCherry modificado aplicado brevemente en el compartimiento axonal. Las neuronas eran imagen 3 días post-infección en 21 días en la cultura. Crear un microambiente aislado dentro del compartimiento axonal se demuestra mediante la aplicación de un colorante de bajo peso molecular, hidrazida Alexa Fluor 488. (B) una imagen fusionada de (A), incluyendo una interferencia diferencial (DIC) imagen para visualizar la región micro-ranuras del chip. Imágenes fueron adquiridas con láser de barrido confocal microscopio usando un aceite de silicona de 30 × / 1.05 N.A. (ne = 1.406) objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Comparación de lado a lado del crecimiento neuronal en multicompartment dispositivos PDMS y virutas de plástico. (A) fase micrográfos de contraste de ambas plataformas en 3, 7, 15 y 22 días en la cultura. En la parte inferior, una región más alta de aumento tomada de las imágenes a los 22 días se incluye para ilustrar el crecimiento axonal en esta edad en ambas plataformas. Axones dentro del chip son más continuos y aparecerán más sanos que en el dispositivo PDMS en esta edad. (B) una micrografía de la inmunofluorescencia de invertir de β-tubulina III había manchado axones dentro del compartimiento del dispositivo PDMS y viruta plástica del axonal a los 22 días en la cultura. Imágenes fueron adquiridas con un giro confocal imagen sistema de disco usando un 20 x / 0.45 N.A. objetivo. Todas las barras de escala son 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Axotomía y regeneración de las neuronas hippocampal en la viruta plástica multicompartment. (Arriba) Las neuronas eran retrógradas etiquetados usando un virus de la rabia mCherry modificado y entonces reflejada antes axotomía en 24 días en la cultura. Las imágenes eran pseudocolored con la tabla de búsqueda de color de 'Fuego'. (Parte inferior) La neurona misma reflejada en el panel superior fue imagen 24 h post-axotomía. Líneas blancas discontinuas muestran los bordes de la barrera de microsurco. Axotomía ocurrió en el lugar de la izquierda línea discontinua. La flecha blanca muestra un bulbo de retracción. La flecha blanca indica un axón regenerante. Imágenes fueron adquiridas con un giro confocal imagen sistema de disco usando una lente de objetivo 20 x/0.45 N.A.. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Sinapsis entre neuronas hippocampal cultivadas dentro de plástico chips multicompartment. Inmunotinción se realizó a los 24 días en cultura y reflejada dentro del compartimiento somático utilizando una lente de inmersión de aceite de silicona de 60 ×. Las neuronas expresan (A) el marcador de sinapsis excitatorias, vGlut1 (verde) y (B) el marcador de sinapsis inhibitorias, vGAT (azul). (C) retrógrada etiquetado mCherry neuronas (rojo) fueron infectadas vía rabia modificado aplicado en el compartimiento axonal. (D) una micrografía de fluorescencia combinada de vGlut1, vGat y mCherry. (E) la región magnificada en (D) se indica con una caja blanca muestra espinas dendríticas, los sitios que reciben entrada sináptico de otras neuronas. Imágenes fueron adquiridas con un giro confocal imagen sistema de disco utilizando un aceite de silicona de 60 x/1.3 N.A. (ne = 1.406) objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fichas multicompartment plástico | Dispositivos multicompartment de PDMS |
| aislar los axones | aislar los axones |
| establecer microambientes | establecer microambientes |
| neuronas axotomize | neuronas axotomize |
| ópticamente transparente | ópticamente transparente |
| compatible con la proyección de imagen de alta resolución | compatible con la proyección de imagen de alta resolución |
| compatible con microscopía de fluorescencia | compatible con microscopía de fluorescencia |
| totalmente montado | Asamblea de sustrato requerido |
| axones sanos > 21 días | axones sanos > 14 días |
| superficie cultivo hidrofílica | hidrofóbico |
| gas impermeable | gas permeable |
| micro-ranuras redondeado y canales | micro-ranuras recta |
| menos pasos de preparación | Top es removible para tinción de micro-ranuras |
| no es compatible con la ablación del laser | absorción de pequeñas moléculas y solventes orgánicos |
| no es compatible con aceites de inmersión basada en aceites minerales (aceites de silicona están bien) |
Tabla 1: Comparación de plástico y plataformas multicompartment de PDMS para el cultivo de las neuronas.
Discussion
Plástico multicompartment chips ofrecen una opción fácil de usar para compartimentar las neuronas, proporcionando las culturas neuronales a largo plazo (> 3 semanas). Este protocolo detalla cómo las neuronas murinas corticales y del hipocampales en estos chips de la cultura. Se discutieron también la creación de microambientes soluble y cómo retrógrada neuronas etiqueta, realizar axotomía y realizar inmunocitoquímica. Lo importante, estos chips son compatibles con alta resolución, fluorescencia y la proyección de imagen vivo.
Chips multicompartment plástico proporcionan muchas de las mismas funciones que el PDMS compartimentados dispositivos, pero tienen algunas características distintivas, ventajas y desventajas. Tabla 1 ofrece una comparación de la característica de viruta plástica y dispositivos basados en PDMS. Primero y principal, los chips son premontados e hidrofílicas permanentemente, lo que facilita la adherencia de soldadura, haciéndolos más fácil de usar. El plástico no es gas permeable, a diferencia de los PDMS, así que si se forman burbujas dentro de los canales, no escapar fácilmente y debe eliminarse. Una solución de la capa que contiene principalmente etanol y algunos otros agentes propiedad elimina la formación de burbujas.
Vive la proyección de imagen de las proyecciones siguiente transducción de proteínas fluorescentes se realizó dentro de los chips (figura 4) y no había detectable autofluorescencia del plástico. Una advertencia es que aceites de inmersión utilizados con el chip para objetivos de gran apertura numérica deben ser con base de aceite de silicona y no aceite mineral base. Aceite mineral puede causar una reacción adversa con el copolímero de olefina cíclica. Para la proyección de imagen de brightfield, es importante tener en cuenta que las micro-ranuras en el chip son redondeadas en los extremos y hay una reducción gradual de la dirección de z de los canales principales hacia la barrera de microsurco causando algunos refracción de la luz en los extremos de la micro-ranuras en brightfield proyección de imagen (figura 3). Porque el chip es premontado, penetración de anticuerpos en las micro-ranuras tamaño micrométrico puede ser irregular (como con dispositivos permanentemente consolidados de PDMS); así, deben realizarse análisis cuantitativo immunostaining en los compartimientos de canales. Inmunotinción de proyecciones neuronales en las micro-ranuras puede mejorarse mediante la creación de una diferencia de volumen entre los compartimentos para facilitar la circulación de anticuerpos y fluoróforos en las micro-ranuras.
Disclosures
AMT es un inventor del cámara/chip de microfluidos (nos 7419822 B2) y es miembro de la Xona Microfluidics, LLC. V.P. es un empleado de la Xona Microfluidics, LLC. J.H. es miembro de la Xona Microfluidics, LLC. T.N. no declara a competencia intereses financieros. Publicación de acceso abierto de este artículo es patrocinado por Xona Microfluidics.
Acknowledgments
Los autores reconocen la asistencia técnico o editorial de Taylor Wilt (Balada), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Balada) y Brad Taylor (Balada). Los autores reconocen el apoyo de Xona Microfluidics, LLC y el Instituto Nacional de Salud Mental (R42 MH097377). La proyección de imagen parcialmente fue apoyada por el Confocal y multifotón Imaging Core instalación de NINDS centro Grant P30 NS045892 y NICHD centro Grant (U54 HD079124). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
| Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
| Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
| E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
| neuronal culture media: | |||
| - Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| -B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| -GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| -Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
| normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
References
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