Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

Özet

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS) farklı cep ve doku bölmeleri içinde doğru ve belirli algılama redoks düzenlenir sinyal biyolojik ayarlarında çalışması esastır. Elektron paramagnetic rezonans sprektroskopisidir (EPR) serbest radikallerin belirsizliğe yer bırakmadan değerlendirmek için yalnızca doğrudan yöntemidir. Onun avantajı yüksek özgüllük ile belirli türlerin fizyolojik düzeyleri algılar, ama özel teknolojisi, dikkatli numune hazırlama ve uygun denetimleri doğru verilerin yorumlanması sağlamak için gerektirir. Çevrimsel hydroxylamine spin probları seçerek süperoksit veya EPR spektroskopisi tarafından sayısal bir nitroxide sinyal oluşturmak için diğer radikalleri ile tepki. Hücre geçirgen spin probları ve spin probları hızla mitokondri içinde birikir için tasarlanmış farklı hücresel kompartmanlarda süperoksit konsantrasyon belirlenmesi için izin verir.

Kültürlü hücreleri, hücre geçirgen 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) ile birlikte ve hücre geçirimsiz süperoksit dismutaz (SOD) Önarıtma olmadan kullanımı veya hücre geçirgen PEG-SOD kullanımı, sağlar ekstrasellüler sitozolik süperoksit üzerinden farklılaşma. Mitokondriyal 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium ve (mito-TEMPO-H) için ölçüm sağlar Mitokondrial ROS (ağırlıklı olarak süperoksit).

Spin sonda ve EPR spektroskopisi vivo içinde modelleri için de uygulayabilirsiniz. Süperoksit ekstraselüler sıvı kan ve alveoler sıvı gibi yanı sıra doku akciğer dokusu gibi algılanabilir. Birkaç yöntem işlemek ve doku EPR ölçümler için depolamak ve intravenöz 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonda içinde vivoteslim için sunulmaktadır. Ölçümler-ebilmek var olmak kılınmak oda sıcaklığında iken, vitro ve in vivo modellerden alınan örnekleri de-80 ° C'de saklanabilir ve 77 K. EPR tarafından analiz Örnekleri özel boru istikrarlı-80 ° C'de depolanan ve bir pratik, verimli, etkinleştirmek için 77 K ve depolama ve aktarma örnekleri kolaylaştırır tekrarlanabilir yöntemini çalıştırın.

Giriş

Oksidatif stres ve reaktif oksijen türlerine tüm organ sistemleri arasında çeşitli hastalıkları çalışma için önemli olmakla birlikte, reaktif oksijen türleri (ROS) tespiti kısa yarılanma ömrü ve yüksek reaktivite nedeniyle zordur. Serbest radikallerin algılamak için en belirgin yöntemi bir elektron paramagnetic rezonans (EPR) tekniğidir. Spin probları daha yaygın olarak kullanılan floresan problar üstünlükleri vardır. Floresan problar nispeten ucuz ve kullanımı kolay ve hızlı, hassas ROS tespiti sağlamak olsa da, onlar manipülasyonun sinyalleri, ROS konsantrasyonları ve özgüllük^{1 Genel eksikliği hesaplamak için bir yetersizlik nedeniyle ciddi sınırla....}

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları University of Colorado Denver kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hazırlanması reaktifler

1. Diethylenetriaminepentaacetic asit (DTPA) hisse senedi (150 mM)
   1. DTPA 2.95 g ekleyin (393.35 g/mol) 10 mL deiyonize su için.
   2. DTPA çözülmeye, 1 M NaOH dropwise ekleyin ve 7.0 bir pH getirmek.
   3. 50 mL su için 150 mM son DTPA konsantrasyon ile ses getirmek ve 4 ° C'de depolayın
2. Fosfat tampon serum (PBS) (50 mM, pH 7,4)
   1. 5 M sodyum klorür (NaCl) (58.44 g/mol; 29.22 g/100 mL) hazırlayın.
   ....

Sonuçlar

CMH süperoksit algılama doğrulanmış X kullanarak / XO süperoksit üreten katalaz (Şekil 1A) etkisi varken nitroxide (CM^.) sinyal SOD tarafından inhibe tam olarak göstermek için sistem. Toplam, hücre dışı süperoksit, hücre geçirgen CMH spin sonda SOD Önarıtma +/-ile sonra çiğ 264.7 hücreleri kuluçka hücreleri tarafından değerlendirilmiştir. Nitroxide konsantrasyonu hücre süspansiyon ve iki örnek türü değerleri benzer geçirgen doğa ve spin inceleyebil.......

Tartışma

Düzenlenmiş anlayış redoks sağlık ve hastalık sinyal biyolojik ayarları üretimde serbest radikal değerlendirilmesi önemlidir ama bu tür son derece serbest radikal türlerin kısa yarılanma nedeniyle zorlu ve teknik ölçüsüdür Genel olarak kullanılan sınırlamalarla. EPR redoks biyoloji, değerli ve güçlü bir araç olduğu serbest radikallerin algılamak için sadece belirli bir yöntemdir. Bu projede, biz tasarlama deneyler ve spin kullanarak ROS probları farklı hücresel kompartmanlarda vitro ve farklı doku bölmeleri algı.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	LifeTech	10566-016	hücre kültürü ortamı
Dietilentriamiminpentaasetik asit (DTPA)	Sigma Aldrich	D6518-5G
sodyum klorür (NaCl)	Fisher Bilimsel	BP358-212	50 mM fosfat salin tamponu hazırlamak için kullanılır  Sigma aldrish 'ye göre;
potasyum fosfat dibazik (HK2PO4 )	Fisher Scientific	BP363-500	50 mM fosfat salin tamponu hazırlamak için kullanılır  Sigma aldrish 'ye göre;
potasyum fosfat monobazik (KH2< / sub>PO4< / sub> )	Sigma Aldrich	P-5379	, 50 mM fosfat salin tamponu hazırlamak için kullanılır  Sigma aldrish 'ye göre
Krebs-Henseleit tamponu (KHB)	(Alfa Aesar, Hill)	J67820
Sığır eritrosit süperoksit dismutaz (SOD)	Sigma Aldrich	S7571-30KU
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)	Sigma Aldrich	P1585-1MG	DMSO Antimisin
A (AA)	Sigma Aldrich	A8674-25MG	Etanolde Çözün ve cam şişelerde saklayın (kullanılan MW, dört lot için ortalama moleküler ağırlıklardır)
1-Hidroksi-3-metoksikarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirolidin. HCI (CMH)	Enzo Yaşam Bilimleri	ALX-430-117-M050
1-Hidroksi-3-karboksi-2,2,5,5-tetrametilpirolidin. HCl (CPH)	Enzo Yaşam Bilimleri	ALX-430-078-M250
1-Hidroksi-4- [2-trifenilfosfonio) -asetamido] -2,2,6,6-tetrametilpiperidin, 1-Hidroksi-2,2,6,6-tetrametil-4 - [2- (trifenilfosfonio) asetamido] piperidinium diklorür (mito-TEMPO-H)	Enzo Yaşam Bilimleri	ALX-430-171-M005
1-Hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il-trimetilamonyum klorür. HCl (CAT1H)	Enzo Yaşam Bilimleri	ALX-430-131-M250
Heparin	Sagent İlaç	NDC 25021-400-10
Difeniliodonyum klorür	Sigma Aldrich	43088
Deferoksamin mesilat tuzu	Sigma Aldrich	D9533-1G
Critoseal	Leica	39215003
MARKA tek kullanımlık BLAUBRAND  mikropipetler, intraMark	Sigma Aldrich	708733	Kılcal Damarlar
PTFE FRAKSIYONEL FLOROPOLIMER BORULAMA 3/16" Dış çap x 1/8 inç ID	NORELL	1598774A	Teflon boru
NMR NUMUNE TÜPLERİ İÇİN SİLİKON KAUÇUK TIPALAR  4 MM-5 MM (3,2 MM - 4,2 mm ID) OD'YE SAHİP İNCE DUVARLI TÜPLER İÇİN TS-4-5-SR	NORELL	94987
EMXnano Tezgah Üstü EPR spektrometresi	Bruker BioSpin GmbH	E7004002
EMX NANO DOKU HÜCRESI	Bruker BioSpin GmbH	E7004542

, , İçinde Çözünür