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Neuroscience

Biocytin वसूली और भरा हिप्पोकैम्पस CA2 न्यूरॉन्स के 3 डी पुनर्निर्माण

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58592
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Pharmacology, University College London
* These authors contributed equally

Summary

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण, biocytin वसूली और उच्च गुणवत्ता वाले पुनर्निर्माण हिप्पोकैम्पस CA2 न्यूरॉन्स में intracellular electrophysiological रिकॉर्डिंग के बाद का वर्णन करता है इन विट्रो, की अनुमति न्यूरॉन लक्षण वर्णन और अंततः ठीक ंयूरॉन शरीर रचना विज्ञान के लिए अध्ययन किया जाएगा ।

Abstract

कैसे cortical नेटवर्क गतिविधि प्रक्रियाओं जानकारी बुनियादी और नैदानिक वैज्ञानिक सवालों की एक बड़ी संख्या के महत्व का है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल इस सर्किट के बुनियादी इमारत ब्लॉकों की पहचान करता है । cortical क्षेत्रों की गहराई से अध्ययन अंततः सर्किट घटकों की समझ के लिए आवश्यक के साथ अंय वैज्ञानिकों को प्रदान करेगा कैसे मस्तिष्क, प्रक्रियाओं और दुकानों जानकारी और क्या रोग में गलत हो जाता है, जबकि electrophysiological और रूपात्मक डेटा व्यापक रूप से मॉडल नेटवर्क है कि जानकारी के प्रसंस्करण का पता लगाने के निर्माण में गणना neuroscientists द्वारा प्रयोग किया जाता है । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि हिप्पोकैम्पस के CA2 क्षेत्र में रिकॉर्ड किए गए biocytin-भरे कक्षों को कैसे पुनर्प्राप्त किया जाता है और फिर 3d में खंगाला जाता है । इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन या पेप्टाइड सामग्री के प्रदर्शन में दर्ज की गई न्यूरॉन्स का वर्णन करता है ।

Introduction

प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस ऐसी जटिलता की संरचना है कि ंयूरॉन उपप्रकार के वर्गीकरण1,2,3,4, उन दोनों के बीच कनेक्शन के नक्शे5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 और कैसे इस सर्किट संज्ञानात्मक कार्यों का समर्थन करता है12,13,14,15 अभी भी गहन अध्ययन के तहत कर रहे है और जारी बहस का विषय है । उदाहरण के लिए, विवरण और सर्किट की जटिलताओं को समझने के लिए और कई विभिंन अध्ययनों से प्राप्त डेटा समंवय करने के लिए, यह बहुत उपयोगी है परिभाषित करने के लिए और घटकों का वर्णन कर सकता है, लेकिन यह बहस के लिए एक बात बनी हुई है कि कितने अलग न्यूरॉन्स की कक्षाएं मौजूद हैं, या यहां तक कि क्या यह एक विशिष्ट वर्ग से संबंधित के रूप में सभी न्यूरॉन्स को परिभाषित करने के लिए संभव है. गणना उपकरण का निर्माण कर सकते है और जटिलता की डिग्री बदलती के साथ परीक्षण सर्किट16,17,18विकसित किया जा रहा है, लेकिन इन प्रयासों के लिए केंद्रीय सेल प्रकार के विस्तृत अध्ययन के लिए की जरूरत है और उन दोनों के बीच कनेक्शन के गुणों की । वयस्क चूहों के neocortex के स्थानीय सर्किट के बारे में जानकारी की एक बड़ी राशि पहले से ही यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकत्र किया गया है10,19,20,21, 22. हालांकि "तारों आरेख" पूरी तरह से दूर है, कुछ स्पष्ट पैटर्न या नियम उभरा है । इसके अलावा, हालांकि कुछ विवरण बदलती हैं, इन नियमों को दो स्तनधारी प्रजातियों (चूहे और बिल्ली) और कई neocortical क्षेत्रों में आम है, बुनियादी इमारत ब्लॉकों के विकास की अनुमति है कि समान रूप से मानव neocortex के लिए लागू होने की संभावना है । तकनीक यहां वर्णित presynaptic और postsynaptic क्षेत्रों है कि विस्तार में अध्ययन नहीं किया गया है में कनेक्शन में शामिल ंयूरॉंस की पहचान के द्वारा cortical सर्किट के कार्यात्मक नक्शे की हमारी समझ का विस्तार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, एक प्रोटोकॉल का उपयोग कि उत्कृष्ट ऊतक संरक्षण और उल्लेखनीय वयस्क मस्तिष्क ऊतक में धुंधला वसूली की अनुमति देता है । CA2 में स्थानीय सर्किट और इस उपक्षेत्र में न्यूरॉन की संपत्ति पर डेटा intracellular electrophysiological रिकॉर्डिंग के संयोजन के द्वारा इस विधि के साथ एकत्र किया गया है (तेज microelectrodes के साथ रिकॉर्डिंग युग्मित) biocytin भरने के साथ, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रियाओं और अत्यधिक विस्तृत ंयूरॉन पुनर्निर्माण, पड़ोसी CA क्षेत्रों के साथ प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति23,24,25।

इस लेख में वर्णित तकनीक विस्तृत न्यूरॉन्स कोशिकाओं के सही वर्गीकरण और उच्च गुणवत्ता और दोनों अपने वृक्ष और axonal arbors, डेटा है कि हो सकता है की सटीक पुनर्निर्माण की अनुमति प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है तेज इलेक्ट्रोड का उपयोग कर युग्मित रिकॉर्डिंग से एकत्र electrophysiological डेटा के साथ संबंधित. ऊतकवैज्ञानिक प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स की ultrastructure को संरक्षित करने और दोनों वृक्ष (spins सहित) और axonal arbors की उत्कृष्ट वसूली प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है. उदाहरण के लिए, एक निर्धारण समाधान में सबसे पहले विसर्जित करके दोहरे निर्धारण तकनीक के सिद्धांत और दूसरा आज़मियम tetroxide में फिक्सिंग के बाद प्रकाश सूक्ष्म26के लिए एक अच्छा विपरीत देता है । glutaraldehyde और picric एसिड समाधान की एक छोटी राशि के लिए एंटीबॉडी प्रवेश बढ़ाने और कोशिकाओं ultrastructure के रूप में एक पिछले अध्ययन में सुझाया27संरक्षित करने के लिए निर्धारण समाधान में जोड़ रहे हैं । permeabilization क्रायो-सुक्रोज के साथ सुरक्षा के साथ संयुक्त, बजाय एक पारंपरिक डिटर्जेंट, भी दर्ज की कोशिकाओं के विस्तृत रूपात्मक विश्लेषण के लिए ऊतकों के इष्टतम संरक्षण प्रदान करता है, फ्रीज-गल विधि का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क स्लाइसें । इसके अलावा, विशेष रूप से बहुत ठीक संरचनाओं के दृश्य पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने से सुधार हुआ है, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) और सोडियम borohydride (नभ4) के साथ गर्मी के साथ । निकेल क्लोराइड (NiCl2) सहिजन peroxidase (एचआरपी) प्रतिक्रिया को जोड़ने के लिए एक काला वर्णक प्रतिक्रिया उत्पाद प्राप्त करने के लिए भी इसके विपरीत बढ़ जाती है ।

निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए उत्कृष्ट ऊतक संरक्षण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं का वर्णन और अत्यधिक विस्तृत ंयूरॉंस 3 डी पुनर्निर्माण इन विट्रो मेंintracellular रिकॉर्डिंग के बाद । स्लाइस तैयारी का विवरण, intracellular युग्मित रिकॉर्डिंग तेज इलेक्ट्रोड और अनुवर्ती ऊतकवैज्ञानिक हमारी प्रयोगशाला में उपयोग की गई प्रक्रियाओं का उपयोग कर पहले28बताया गया है । हालांकि प्रोटोकॉल में biocytin के साथ intracellularly भरे कक्षों पर लागू होता है 450 – 500 माइक्रोन मोटे स्लाइस, पूरे सेल रिकॉर्डिंग के बाद एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है । हालांकि, पतले स्लाइस का उपयोग कोशिकाओं के कम पूर्ण पुनर्निर्माण में परिणाम होगा ।

Protocol

सभी इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं को ब्रिटिश गृह कार्यालय के नियमों के अनुसार पशु वैज्ञानिक प्रक्रियाओं १९८६ अधिनियम के संबंध में किए गए ।

1. कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन या प्रोटीन की सामग्री का निर्धारण न्यूरॉन्स और Biocytin विज़ुअलाइज़ेशन निम्न Electrophysiological रिकॉर्डिंग और Biocytin भरने

नोट: electrophysiological रिकॉर्डिंग के अंत में, biocytin-भरे कक्षों वाले स्लाइस रातोंरात ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रियाओं से पहले तय किए जाते हैं. निर्धारण समाधान ०.१ एम फास्फेट की एक एकल परिवर्तन के साथ बदल दिया जाएगा अगली सुबह बफर, प्रक्रिया के बाकी एक और दिन पर किया जाता है, ताकि ऊतक नुकसान को रोकने के लिए । निर्धारण समाधान (4% paraformaldehyde, ०.२% संतृप्त picric एसिड समाधान, ०.०२५% glutaraldehyde समाधान में ०.१ एम फॉस्फेट बफर (पंजाब)) सबसे अच्छा परिणाम के लिए रिकॉर्डिंग के दिन पर ताजा किया जाना चाहिए.

  1. electrophysiological रिकॉर्डिंग के अंत में, ध्यान से एक तूलिका के साथ दर्ज की सेल (ओं) युक्त टुकड़ा लेने के लिए और यह एक कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ (ACSF) युक्त बर्तन में जगह है ।
    नोट: स्लाइस तैयार करने और शार्प इलेक्ट्रोड का उपयोग करके intracellular रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए गए प्रोटोकॉल का विवरण पहले28बताया गया है ।
  2. एक धुएं डाकू में, ध्यान से एक तूलिका के साथ मस्तिष्क टुकड़ा लेने और यह ठीक गुणवत्ता फिल्टर कागज का एक छोटा सा टुकड़ा पर रोल । टुकड़ा पर गीला फिल्टर कागज का एक टुकड़ा प्लेस और गीला फिल्टर कागज के दो टुकड़े एक छोटे प्लास्टिक के लिए निर्धारण समाधान और फ्रिज में रात 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर के 5-10 मिलीलीटर युक्त बर्तन में जगह है ।
  3. आसुत जल में जिलेटिन का समाधान तैयार करें । एक गर्म प्लेट पर एक चोंच में आसुत पानी की 20 मिलीलीटर प्लेस और यह ६० डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी । पानी के लिए जिलेटिन की उत्तरोत्तर २.४ ग्राम जोड़ें, जब तक भंग और यह 35 करने के लिए शांत करने के लिए अनुमति देने के लिए-40 ° c उपयोग करने से पहले ऊतक क्षति को रोकने के लिए ।
  4. ०.१ मीटर पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ निर्धारण समाधान बदलें । एक पेट्री डिश में स्लाइस प्लेस और दूर एक स्केलपेल ब्लेड के साथ किसी भी अतिरिक्त ऊतक काट । एक पेट्री डिश में छंटनी ऊतक प्लेस (9 सेमी, १.४ cm की ऊंचाई का व्यास), यह सुनिश्चित करना है कि यह कोई परतों या क्रीज के साथ फ्लैट है, और अतिरिक्त बफर एक सूखी तूलिका का उपयोग कर हटा दें ।
  5. कवर गर्म जिलेटिन समाधान के साथ ऊतक और एक जमे हुए ब्लॉक पर पेट्री पकवान जगह जल्दी से समाधान शांत ।
  6. एक कोण-शिष्टता लैंप का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत प्रदान करते हैं, पकवान के पक्ष के माध्यम से देखो और टुकड़ा एक ठीक तूलिका से हल्के दबाव का उपयोग कर फ्लैट जब तक जिलेटिन सेट शुरू होता है ।
    नोट: यदि ऊतक फ्लैट झूठ नहीं है जिलेटिन फिर से पिघला जा सकता है । तूलिका को हटाने के कारण जिलेटिन की सतह पर कोई भी खामियों के रूप में यह जम जाता है कि कुछ सेकंड के लिए सतह के करीब दीपक के बल्ब को धीरे से सतह की परत पिघलने से हटाया जा सकता है.
  7. फ्रिज में जिलेटिन की स्थापना की डिश ले जाएं और 30-60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें ।
  8. एक धुएं डाकू में, एक छोटे से ब्लॉक में कटौती (~ 1 एक्स 1 सेमी) जिलेटिन-एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर पकवान के ऊतक एंबेडेड, एक छोटे से रंग का उपयोग कर ब्लॉक लिफ्ट और ध्यान से यह एक ही लेकिन ताजा निर्धारण के लिए स्लाइसें ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान में जगह 4 डिग्री सेल्सियस से कम 30 मिनट .
  9. ०.१ मीटर पंजाब के 5 मिलीलीटर तीन बार में जिलेटिन ब्लॉक धो, यह कागज के ऊतकों का एक टुकड़ा का उपयोग कर सूखी और ब्लॉक पक्ष छड़ी (यानी, शीर्ष पर ऊतक के साथ) superglue का उपयोग कर एक vibratome चक पर ।
  10. फिल्टर कागज के एक टुकड़े के साथ अतिरिक्त गोंद निकालें और एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए ब्लॉक के कोनों में कटौती बंद, एक हीरे के आकार जा रहा है ।
  11. धारा ५० µm मोटाई में एक vibratome का उपयोग करके टुकड़ा और एक गिलास 10% सुक्रोज युक्त शीशी में ध्यान से प्रत्येक अनुभाग जगह ।
  12. ध्यान से शीशी से एक अनुभाग उठाओ, यह एक पेट्री डिश ढक्कन में फ्लैट जगह है । एक विदारक माइक्रोस्कोप और एक ताजा स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, अनुभाग के चारों ओर से जिलेटिन हटाने और ताजा 10% सुक्रोज के 2 मिलीलीटर युक्त एक शीशी को अनुभाग वापस
    नोट: यह इस स्तर पर संभव के रूप में ज्यादा जिलेटिन के रूप में हटाने के लिए महत्वपूर्ण है निर्जलीकरण कदम (चरण १.३७) के दौरान ऊतक सिकुड़ना कम ।
  13. क्रायो-10% सुक्रोज समाधान में 10 मिनट के लिए उन्हें मशीन द्वारा कमरे के तापमान पर ०.१ मीटर पंजाब स्थित सुक्रोज-ग्लिसरॉल समाधान में वर्गों की रक्षा, 20% सुक्रोज में 20 मिनट-6% ग्लिसरॉल समाधान दो बार और अंत में 30% सुक्रोज-12% ग्लिसरॉल समाधान में दो बार के तहत लगातार आंदोलन करते रहे ।
  14. एक तूलिका का उपयोग टिन पंनी के एक छोटे आयत पर फ्लैट वर्गों प्लेस । वर्गों से किसी भी अतिरिक्त तरल निकालें और ध्यान से एक पार्सल में टिन पंनी गुना ।
  15. पार्सल करीब 30 एस के लिए सतह को छूने के बिना तरल नाइट्रोजन की सतह के पास पकड़ो और फिर लगभग 30 एस के लिए पूरी तरह से गल के लिए वर्गों की अनुमति फ्रीज-गल एक और दो बार दोहराएं ।
  16. एक तूलिका के साथ सभी वर्गों को निकालें और उंहें एक गिलास निरंतर आंदोलन के तहत ०.१ मीटर पंजाब के 2 मिलीलीटर युक्त शीशी में जगह से अधिक सुक्रोज धो ।
  17. एक पाश्चर पिपेट के साथ पंजाब निकालें और 1% जलीय एच2ओ 2 के लिए 30 min. ०.१ एम पीबी 3x 5 मिनट के 2 मिलीलीटर में वर्गों धो के 2 मिलीलीटर में वर्गों गर्मी ।
  18. एक पाश्चर पिपेट के साथ ०.१ एम पंजाब निकालें और ०.१ एम पंजाब में 1% सोडियम borohydride (नभ4) जोड़ें ।
    नोट: शीशी टोपी मत करो, के रूप में नभ4 समाधान बंद हाइड्रोजन गैस देता है ।
  19. एक पाश्चर पिपेट के साथ सोडियम borohydride निकालें और ०.१ एम पीबी 5x 5 मिनट की 2 मिलीलीटर में अच्छी तरह से धो वर्गों ।
  20. 30 मिनट के लिए ०.१ एम पंजाब में 10% सामांय बकरी सीरम (NGS) के साथ ०.१ एम पंजाब बदलें ।
  21. बकरी सीरम निकालें और 4 ° c पर रातोंरात वर्गों के माउस मोनोक्लोनल और खरगोश polyclonal एंटीबॉडी का एक मिश्रण में एबीसी समाधान में बना दिया ।
    नोट: पिछले अध्ययनों में प्रयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी की एक सूची Botcher एट अल में 1 तालिका में प्रदर्शित किया जाता है । (२०१४) 29.
  22. अंधेरे में 2 ज के लिए वर्गों की मशीन के एक मिश्रण में फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) ।
  23. बढ़ते माध्यम में स्लाइड पर वर्गों माउंट और एक coverslip के साथ कवर ।
  24. 40X आवर्धन (आंकड़ा 1bb) पर प्रतिदीप्ति ्र की छवियां लें ।
  25. प्रतिदीप्ति इमेजिंग के बाद, स्लाइड को एक गिलास पेट्री डिश में लगाएं और पंजाबियों को सावधानी से coverslip निकालें । फिर एक पाश्चर पिपेट से पंजाबियों की कोमल दालों का उपयोग कर स्लाइड बंद वर्गों धो लो । इस तबके को एक साफ कांच की शीशी में रखें ।
  26. एचआरपी प्रतिक्रिया उत्पाद बढ़ाना करने के लिए सबसे पहले एबीसी में कम 2 ज के लिए वर्गों की मशीन द्वारा avidin-एचआरपी प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं ।
  27. आसुत जल के 5 मिलीलीटर के लिए एक गोली जोड़कर 3, 5 diaminobenzidine (ढाब) समाधान तैयार करें ।
  28. 10 मिनट के लिए तीन बार पंजाबियों के साथ वर्गों धो और फिर Tris बफर के साथ दो बार 10 मिनट के लिए. Tris बफर अंतिम धोने के बाद निकालें ।
  29. जल्दी से 8% NiCl2 का एक बूंद ढाब समाधान के लिए समाधान जोड़ने के लिए, पिपेट में और बाहर मिश्रण और जल्दी से इस समाधान के वर्गों पर 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए । 15 मिनट के लिए ढाब/NiCl2 समाधान में वर्गों मशीन ।
  30. 1% H2O2 के 10 µ l को ढाब समाधान में जोड़ें । के बारे में 1 से 2 मिनट के लिए लगातार आंदोलन के तहत अंधेरे में आगे बढ़ना और एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ भरा कोशिकाओं के लेबल की निगरानी करने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
  31. ढाब/NiCl2/H2ओ2 समाधान निकालकर प्रतिक्रिया बंद करो और 5 मिनट के लिए दो बार Tris बफर के साथ वर्गों धो लो ।
  32. एक धुएं डाकू में, एक पेट्री पकवान में फिल्टर कागज के एक छोटे से सर्कल जगह है और यह ०.१ मीटर पंजाब के साथ गीला हो जाना । एक बार में एक एक तूलिका का उपयोग कर कांच की शीशी से वर्गों लिफ्ट, और उंहें ध्यान से कागज पर फ्लैट जगह है ।
  33. फिल्टर कागज के एक और गीला सर्कल के साथ वर्गों को कवर और धीरे सतह के लिए ऊतक कागज को छूने से अतिरिक्त बफर हटा दें ।
  34. लागू 8-०.१ मीटर पंजाब में 1% आज़मियम tetroxide के 9 बूंदें शीर्ष कागज के लिए, पकवान कवर और धुएं हूड में बनाए रखने के लिए ंयूनतम 30 मिनट, लेकिन अधिक से अधिक 1 एच ।
  35. पेट्री डिश खोलें और ऊपर फिल्टर पेपर लिफ्ट । वर्गों को ध्यान से एक बार में एक तूलिका के साथ, उंहें एक गिलास शीशी में जगह और आसुत जल में उंहें दो बार कुल्ला ।
  36. आज़मियम tetroxide कचरे का निपटारा उचित रूप से करे । सभी डिस्पोजेबल उपकरण कुल्ला और उंहें उचित डिब्बे में जगह है ।
  37. एक गिलास स्लाइड पर फ्लैट प्रत्येक अनुभाग प्लेस और वर्गों coverslip । एक पेट्री डिश में स्लाइड स्थानांतरण, coverslip पर एक खाली गिलास शीशी जगह में इसे बनाए रखने और ५०% शराब के साथ कवर । 15 मिनट के बाद, समाधान से स्लाइड निकालें और स्लाइड से अनुभागों को निकालें । अनुभाग को स्लाइड पर वापस रखें और तब स्लाइड को ७०% अल्कोहल में 15 मिनट के लिए रखें । ९५% और अंत में १००% शराब समाधान के साथ एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  38. निर्जलीकरण कदम के बाद, एक गिलास एक धुएं डाकू में एक शेखर पर १००% शराब युक्त शीशी को वर्गों हस्तांतरण । propylene ऑक्साइड (सी3एच6ओ) के साथ शराब समाधान बदलें और 5 मिनट के लिए तीन बार धो लो । पिछले धोने के बाद, शीशी में propylene ऑक्साइड के ~ 2 मिलीलीटर रखना और राल (1:1 अनुपात) जोड़ें । सुनिश्चित करें कि राल भंग और 30 मिनट के लिए लगातार आंदोलन के तहत वर्गों रखना है ।
  39. एक एल्यूमीनियम planchette epoxy राल युक्त एक लकड़ी के छड़ी और रात भर गर्मी का उपयोग में प्रत्येक अनुभाग प्लेस ।
    नोट: वर्गों को नुकसान पहुंचाने के जोखिम से बचने के लिए 24 घंटे से अधिक राल में वर्गों छोड़ मत करो ।
  40. एक गर्म थाली पर planchette प्लेस लगभग 10 मिनट के लिए एक लकड़ी के छड़ी के साथ प्रत्येक अनुभाग उठाओ और उंहें एक साफ स्लाइड पर जगह है । एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए सुसंगत प्रत्येक अनुभाग का उन्मुखीकरण रखें । अनुभागों पर एक coverslip रखें । इलाज के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर ४८ ज के लिए ओवन में स्लाइड प्लेस ।

2.3d न्यूरॉन पुनर्निर्माण

नोट: Neurolucida सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जाता है । नीचे दिए गए निर्देश केवल एक विशिष्ट ंयूरॉंस पुनर्निर्माण प्रणाली (सामग्री की तालिका) के लिए लागू होते हैं । काटने से प्राप्त वर्गों एक खुर्दबीन का उपयोग कर पुनर्निर्माण से पहले मिलान कर रहे हैं ।

  1. मंच पर एक स्लाइड प्लेस और चरण क्लिप के साथ सुरक्षित और ंयूरॉन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर खोलो । अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें और लाइव छविचुनें ।
  2. 100X तेल उद्देश्य लेंस का उपयोग कर प्रत्येक अनुभाग की मोटाई को मापने । प्रत्येक अनुभाग के ऊपर और नीचे में z-मीटर पर मान का नोट बनाएं और अनुभाग मोटाई को दो मानों के अंतर के रूप में परिकलित करें ।
  3. सेल बॉडी वाले होम सेक्शन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कम-आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करें. फिर एक 100x उद्देश्य का उपयोग करें, सेल शरीर पर ध्यान केंद्रित करने और संदर्भ बिंदु को चिह्नित करने के लिए केंद्र में क्लिक करें ।
  4. ट्रेस टैब से, सीरियल अनुभाग प्रबंधकका चयन करें । फिर सीरियल अनुभाग प्रबंधक विंडो में नया अनुभाग (+ चिह्न) बनाएँ का चयन करें. अनुभागों की संख्या दर्ज करें । प्रत्येक अनुभाग को सही Z क्रम में नाम दें और चरण २.२ में मापी गई कटौती मोटाई दर्ज करें ।
  5. 100X उद्देश्य का उपयोग कर 3 डी में सोमा का पता लगाने, ट्रेस टैब से समोच्च का चयन करें और कोशिका शरीर समोच्च का चयन करें. कक्ष के मुख्य भाग के शीर्ष पर फ़ोकस ले जाने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग करें । हिस्सा है कि ध्यान में वर्तमान में है की परिधि के आसपास क्लिक करके अंक रखें । राइट-क्लिक करें और यह पहली बाह्यरेखा समाप्त करने के लिए बंद समोच्च का चयन करें । जब तक कि सेल बॉडी के नीचे (चित्रा 2) पहुंच जाए तब तक इस प्रक्रिया को अलग z पोजिशन पर दोहराएं ।
    नोट: 3 डी में सेल शरीर कल्पना करने के लिए ट्रेस टैब में 3 डी कल्पना का चयन करें ।
  6. 100X उद्देश्य का उपयोग कर 2d में कोशिका शरीर का पता लगाने के लिए, कक्ष शरीर का चयन करें ंयूरॉन मेनू से ट्रेस टैब में सेल शरीर के बीच पर ध्यान केंद्रित । सेल शरीर की परिधि के आसपास क्लिक करके अंक रखें । कक्ष के मुख्य भाग को पूरा करने के लिए, राइट-क्लिक करें और कक्ष बॉडी समाप्तकरेंका चयन करें ।
  7. वृक्ष आर्बर का पता लगाने के लिए, ंयूरॉन मेनू में Dendrite या शिखर Dendrite का चयन करें । पहले प्रत्येक dendrite के लिए एक छोटी, प्रारंभिक खंड ट्रेस माउस स्क्रॉल व्हील का उपयोग करने के लिए कर्सर के व्यास को समायोजित करने के लिए dendrite के व्यास मैच । प्रत्येक dendrites के साथ ट्रेस जॉयस्टिक का उपयोग करने के लिए खंड और माउस स्क्रॉल पहिया भर में स्थानांतरित करने के लिए अनुरेखण के व्यास को समायोजित ।
  8. लाइव माइक्रोस्कोप छवि के साथ अनुरेखण के संरेखण की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो, विशेष रूप से जॉयस्टिक का उपयोग कर ले जाने के बाद समायोजित. ट्रेस टैब में, ट्रेसिंग संरेखितकरें का चयन करें, पता लगाएँ पर और उसके बाद सही स्थान पर क्लिक करें ।
  9. ट्री में एक नोड तक पहुँच गया है, जब राइट-क्लिक करें और चंदपूर नोड या Trifurcating नोड ड्रॉप-डाउन मेनू से का चयन करें ।
  10. जब एक शाखा के अंत तक पहुंच गया है, एक को समाप्त करने का चयन करें ड्रॉप डाउन मेनू में ंयूरॉन मेनू । सही समाप्त प्रकार का चयन करें, यानी, उच्च समाप्त, सामांय समाप्त या एलसमाप्त करने के लिए वर्गों में मिलान की सुविधा खत्म हो ।
  11. माइक्रोस्कोप पर आवर्धन को कम एक बार वर्तमान खंड में सभी dendrites ट्रेस किया गया है, जोय मुक्त टैब का चयन करें और एक खंड के लिए कदम है कि तुरंत ऊपर या पूर्ण अनुभाग के नीचे से मेल खाता है ।
  12. पूर्ण अनुभाग से मेल खाने वाले अनुभाग में dendrites के बीच मिलान बिंदुओं की पहचान करने के लिए, ले जाएं टैब पर क्लिक करें और अंक मिलानचुनें । (तीन या अधिक अंक पसंद है) मिलान किया जा करने के लिए आवश्यक बिंदुओं की संख्या का चयन करें और फिर ठीकदबाएँ । एक पूर्ण शाखा के अंत पर क्लिक करें और फिर शाखा पर क्लिक करें । प्रत्येक मैच बिंदु के लिए यह दोहराएं । सटीक मिलान सुनिश्चित करने के लिए 100X आवर्धन पर इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  13. समाप्त होने पर राइट-क्लिक करके सीधे पिछले अनुभाग में मेल खाती शाखाएं जोड़ें । शाखा पंक्तियाँ पूर्ण traced शाखा के साथ ऊपर और ट्रेस पहले बताए गए के रूप में समाप्त करने के लिए जोड़ें का चयन करें ।
  14. प्रत्येक अनुभाग के सभी dendrites ट्रेस किया गया है एक बार, axon ंयूरॉन मेनू से axon का चयन करके एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर ट्रेस ।
  15. होम सेक्शन पर जाएं, लाइव माइक्रोस्कोप इमेज के साथ पुनर्निर्माण को फिर से संरेखित करें और ट्रेस टैब से आकृति का चयन करे. एक पूर्व-परिभाषित समोच्च/परत सीमा/क्षेत्र सीमा चुनें और एक समोच्च के साथ ट्रेस करने के लिए क्लिक करें । अंत खुला समोच्चका चयन करें । सभी वांछित परतों और क्षेत्र रूपरेखा का पता लगाएँ.
  16. 3 डी में पुनर्निर्माण कल्पना करने के लिए 3d टयूब ट्रेस टैब का उपयोग करें ।
  17. 3 डी पुनर्निर्माण (वीडियो 1) के वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए, 3 डी पुनर्निर्माण खुला और फिल्में बनानेके लिए खुला । एक फ़ाइल गंतव्य और वांछित रोटेशन गति सेट करें । यह २७० डिग्री करने के लिए रोटेशन सेट करने के लिए सिफारिश की है । रिकॉर्डिंग प्रारंभकरें चुनें, कुछ सेकंड के लिए रिकॉर्ड करें, फिर ऑटो घुमाएँ आवश्यक होने पर रिकॉर्डिंग रोकें का चयन करें. एक वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) के साथ वीडियो संपादित करें ।
  18. फ़ाइलें Tiff या JPEG फ़ाइलों में निर्यात करने के लिए, फ़ाइल का चयन करें । निर्यात । छवि के रूप में ट्रेसिंग निर्यातकरें । एक µm/पिक्सेल अनुपात चुनें और फिटका चयन करें । किसी पृष्ठभूमि रंग का चयन करें और फ़ाइलका चयन करें । फ़ाइल नाम, Tiff या JPEG का चयन करें और सहेजेंदबाएं । फ़ाइलों को वेक्टर फ़ाइलों में निर्यात करने के लिए, फ़ाइल का चयन करें । निर्यात । वेक्टर फ़ाइलों के रूप में ट्रेसिंग निर्यातकरें ।
  19. morphometric विश्लेषण करने के लिए एक ंयूरॉन पुनर्निर्माण विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ।
    1. वृक्ष पेड़ों का विश्लेषण और एक dendrogram प्राप्त करने के लिए, Neurolucida एक्सप्लोरर में फ़ाइल खोलें । का चयन करें विश्लेषण । संरचना और ड्रॉप-डाउन मेनू (चित्रा 3) से Dendrogram का चयन करें ।
    2. 3 डी पुनर्निर्माण (शाखा जटिलता, शाखाओं और सोमाओं की मात्रा, सतह क्षेत्र) का एक व्यापक morphometric विश्लेषण करने के लिए, सॉफ्टवेयर में फ़ाइल खोलें । दृश्य टैब में, सभी का चयनकरेंक्लिक करें । विश्लेषण टैब का चयन करें । फिर संरचना और शाखा संरचना विश्लेषणका चयन करें ।

3. मुसीबत शूटिंग

  1. कैमरा सेटिंग्स परिवर्तित करें । सर्वोत्तम परिणामों के लिए, जोखिम समय सेट से कम १०० एमएस और लाभ और ऑफसेट के रूप में करीब 0 के लिए संभव के रूप में ।
  2. यदि न्यूरॉन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से ट्रेस्ड आकृति में 3d विज़ुअलाइज़ ट्रेस टैब में एक 3d कक्ष बॉडी के रूप में प्रदर्शित नहीं करता है, का चयन करें ऑब्जेक्ट्स ट्रेस टैब में, कुंजीपटल पर Ctrl कुंजी दबाए रखें और सभी तैयार आकृति पर क्लिक करें, ठीक क्लिक करें और फिर ड्रॉप डाउन मेनू पर सेट सेल शरीर का चयन करें ।
  3. z-पैरामीटर किसी व्यक्ति की शाखा को समायोजित करने के लिए, ट्री (का चयन करें ऑब्जेक्ट्स ट्रेस टैब में) का चयन करें और राइट-क्लिक मेनू ड्रॉप डाउन के माध्यम से सभी बिंदुओं का z-समायोजन सेट । z स्थिति संशोधितकरेंका चयन करें, और उसके बाद Shift z मान का चयन करें और आवश्यक मान दर्ज करें ।
  4. जब यह पता लगाएँ पर एक बड़ी दूरी स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है ' हटो' टैब में ' जानेके लिए' का उपयोग कर पुनर्निर्माण realign करें ।
  5. पुनर्निर्माण प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर अतिरिक्त नोड्स जोड़ें । शाखा का चयन करें जहां नोड में रखा जाना है (का चयन करें ऑब्जेक्ट में ट्रेस टैब और शाखा पर क्लिक), राइट-क्लिक करें, और चयनित ट्री में नोड संमिलितकरेंका चयन करें । फिर शाखा पर सही स्थान पर क्लिक करें ।
  6. जब एक जटिल न्यूरॉन्स का पुनर्निर्माण, व्यक्तिगत रूप से शाखाओं का मिलान और बाद में शाखाओं की आसान पहचान के लिए उन्हें ब्याह का पता लगाने. नई अनुभाग में शाखाओं को अलग से ट्रेस करें और फिर इन शाखाओं को पिछले अनुभाग पर मेल खाती शाखाओं पर होवर करके, ब्याह किए जाने के लिए, राइट क्लिक करके और ब्याहचुनें, फिर समाप्त होने पर मँडरा रहा है कि शाखा को ब्याह करना है और क्लिक करना है.
  7. एक शाखा गलत ट्री प्रकार के अंतर्गत ट्रेस किया गया है, तो ट्री का चयन करें, राइट-क्लिक करें और बदलें ट्री प्रकारका चयन, और सही ट्री प्रकार का चयन करें ।
  8. यदि कोई बिंदु गलत तरीके से रखा गया है, तो Ctrl + Z, या अंतिम बिंदु को निकालने के लिए ट्रेस मेनू में पूर्ववत् करें बटन क्लिक करते हैं । हालांकि, जॉयस्टिक किसी बिंदु को निकालने के लिए प्रयास करने से पहले अनुभाग में ले जाने के लिए उपयोग किया जाता है, तो यह कार्यविधि काम नहीं करेगा । इस मामले में शाखा समाप्त होने पर बात को हटाया जा सकता है । शाखा का चयन करें ( ऑब्जेक्ट का चयन करें दबाएं और शाखा पर क्लिक करें), निकाले जाने वाले पॉइंट पर होवर करें, राइट-क्लिक करें और पॉइंट निकालें का चयन करे ।
  9. यदि अनिश्चित है कि दो शाखाओं मिलान कर रहे हैं, या तो 1) 3d visualize में ट्रेस टैब का उपयोग करने के लिए जांच करें कि क्या शाखाओं z-विमान में मेल, या 2) धारावाहिक अनुभाग प्रबंधक में पार्श्व दिखाने की सुविधा का उपयोग करें वर्गों तुरंत प्रदर्शित करने के लिए ग्रे में वर्तमान अनुभाग के ऊपर और नीचे.
  10. यदि कोई अनुभाग फ़्लिप है, तो ट्रेस टैब में उपकरण पर जाएँ. XY स्केलिंग समायोजित करें और X-अक्ष को-1 में बदलें का चयन करे । फिर सही z -संकोचन का चयन करें और z-अक्ष को-1 में बदलें । फिर हमेशा की तरह शाखाओं का पता लगाएं । इन परिवर्तनों को रिवर्स जब एक वर्ग है जो मूल अभिविंयास था करने के लिए ले जाने के लिए याद रखें । x बदलने और z-अक्ष लेबल को समाप्त करने शाखा बदल नहीं है, तो देखभाल जब ब्याह कि सही अंत इस्तेमाल किया जा रहा है ले जाएगा ।
  11. सही Z-संकोचन सही किया जा सकता है, अगर वहां अनुभाग में कटौती मोटाई और घुड़सवार मोटाई मापा के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है । ट्रेस टैब में, उपकरणका चयन करें, तो सही z-संकोचन, और बढ़ मोटाई द्वारा विभाजित काट मोटाई का एक दशमलव प्रतिनिधित्व के रूप में z-अक्ष के लिए संकोचन कारक दर्ज करें ।

Representative Results

न्यूरॉन्स हिप्पोकैम्पस CA2 में biocytin निम्नलिखित electrophysiological रिकॉर्डिंग (आंकड़े 1Ac, विज्ञापन और 1Bc, Bd) के साथ भरा गया था. स्लाइसें रात तय की रिकॉर्डिंग के बाद और ंयूरोकेमेस्ट्री और न्यूरॉन्स के रूपात्मक लक्षण वर्णन किया गया प्रोटोकॉल के बाद यहां वर्णित पता चला रहे थे ।

कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन या भर के प्रोटीन सामग्री प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पहले स्लाइसें और फिर फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ गर्मी से निर्धारित किया गया था । रिकॉर्डिंग के दौरान न्यूरॉन्स की फायरिंग विशेषताओं प्राथमिक एंटीबॉडी का चयन का इस्तेमाल हुक्म चलाना होगा. Avidin-AMCA को biocytin-भरे न्यूरॉन और एंटी-माउस fluorescein isothiocyanate (FITC) और बकरी विरोधी खरगोश टेक्सास रेड (TR) की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था जो न्यूरॉन ंयूरोकेमेस्ट्री (फिगर 1Bb) की विशेषता थे.

प्रतिदीप्ति दृश्यावलोकन के बाद, एक एचआरपी प्रोटोकॉल biocytin (चित्र 1Ab) प्रकट करने के लिए उपयोग किया गया था । CA2 न्यूरॉन्स के ठीक विस्तृत एनाटॉमी तो एक ंयूरॉन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 डी में तैयार किया गया था (चित्रा 2 और चित्रा 3ए) । CA2 में दर्ज और भरे गए बास्केट सेल के 3d पुनर्निर्माण का वीडियो वीडियोमें प्रदर्शित किया गया है । यदि दोनों वृक्ष और axonal arbors 450-500 माइक्रोन टुकड़ा की गहराई के भीतर सीमित थे न्यूरॉन पुनर्निर्माण पूर्ण रूप में माना जाता था. गरीब axonal आर्बर धुंधला शीर्ष या स्लाइस के नीचे या एक दाग है कि axon प्रारंभिक खंड और बहुत समीपस्थ शाखाओं तक ही सीमित था द्वारा खुले अंत के साथ कटा हुआ शाखाओं की उपस्थिति द्वारा मूल्यांकन किया गया था । चित्रा 4 एक अच्छा और एक गरीब biocytin दृश्य के बाद धुंधला एचआरपी के उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

3 डी पुनर्निर्माण (चित्रा 3) के Morphometric विश्लेषण के लिए शाखा जटिलता, सोमा सतह क्षेत्र और सतह क्षेत्र और वृक्ष और axonal arbors की मात्रा का प्रदर्शन किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : दो प्रकार के टोकरी कोशिकाओं के न्यूरॉन पुनर्निर्माण दर्ज की गई और हिप्पोकैम्पस CA2 क्षेत्र में भरा और intracellular रिकॉर्डिंग निम्नलिखित प्राप्त electrophysiological डेटा संबंधित इन विट्रो में। यह आंकड़ा पिछले अध्ययनों से संशोधित किया गया है23,24। तो परत Oriens, सपा परत Pyramidale, एसआर परत Radiatum, SLM परत Lacunosum आण्विक. (क) ए. ए.: एक ड्राइंग ट्यूब (1000X) का उपयोग कर प्रतिबंधित वृक्ष और axonal आर्बर के साथ एक CA2 टोकरी सेल का पुनर्निर्माण. dendrites काले रंग में हैं, और axon लाल रंग में है । Ab: यहां वर्णित avidin-एचआरपी प्रोटोकॉल के बाद biocytin-भरे टोकरी सेल की छवि । एसी: hyperpolarizing और ध्रुवीकरण प्रतिबंधित वृक्ष और axonal आर्बर के साथ एक CA2 टोकरी सेल की वर्तमान इंजेक्शन के लिए वोल्टेज प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधि ट्रेस. विज्ञापन: तीव्र इलेक्ट्रोड का उपयोग कर दर्ज की आर्बर टोकरी सेल कनेक्शन संकीर्ण करने के लिए एक CA2 पिरामिड का उदाहरण. कंपोजिट उत्तेजक पोस्ट-synaptic संभाव्यता (EPSP) औसत तीन spikes की गाड़ियों के लिए प्रतिक्रियाओं के दौरान संक्षिप्त ट्रेन अवसाद स्पष्ट दिखाते हैं । (ख) बीए: वाइड वृक्ष और axonal arbors एक ड्राइंग ट्यूब (1000X) का उपयोग कर के साथ एक CA2 टोकरी सेल के 2d पुनर्निर्माण । इस टोकरी कोशिका के वृक्ष पेड़ (काले रंग में) CA2 क्षेत्र के सभी परतों के माध्यम से और क्षैतिज इतना और CA2 और CA3 क्षेत्रों के एसपी में विस्तारित बढ़ाया । CA1 क्षेत्र में एक-एक क्षैतिज dendrite भी पहुंच गई । axon (लाल रंग में) CA3 और CA1 क्षेत्रों के लिए बढ़ाया । बीबी: biocytin-भरे (AMCA धुंधलान) बास्केट सेल में पीवी-immunopositive (FITC धुंधलान) और सीबी-immunonegative (टेक्सास-लाल दाग) था । Bc: hyperpolarizing और एक CA2 टोकरी सेल के वर्तमान इंजेक्शन के साथ चौड़े वृक्ष और axonal आर्बर के ध्रुवीकरण के लिए वोल्टेज प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधि ट्रेस । Bd: कंपोजिट EPSP औसत तीन spikes की गाड़ियों के लिए प्रतिक्रियाओं के दौरान संक्षिप्त ट्रेन सुविधा स्पष्ट दिखा । CA2 में दर्ज अंय प्रकार के ंयूरॉंस के उदाहरण पिछले अध्ययन में पाया जा सकता है25,30। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : 3 डी सेल शरीर पुनर्निर्माण । (एक) सेल शरीर के 3 डी अनुरेखण । अलग अलग की आकृति का पता लगाने के विभिंन जेड पदों पर ध्यान केंद्रित whilst सेल शरीर के माध्यम से फोकस । (ख) अलग आकृति के 3d दृश्य । (ग) एक अलग कोण पर सेल शरीर के 3 डी दृश्य । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : 3d न्यूरॉन रिकंस्ट्रक्शन के Morphometry िरा. (क) एक CA2 संकीर्ण आर्बर टोकरी कोशिका के 3 डी पुनर्निर्माण । प्रत्येक वृक्ष शाखा एक रंग (हरे, नीले, लाल और गुलाबी) का प्रतिनिधित्व करती है और axon हल्के नीले में है । (ख) वृक्ष शाखाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करने वाले बास्केट सेल का Dendrogram और सोमा के साथ और १०० माइक्रोन के अंतराल पर, प्रत्येक खंड के भीतर निहित क्षेत्रों की लंबाई । dendrogram पर रंग एक में dendrites के उन लोगों के अनुरूप (ग) CA2 पिरामिडीय कोशिकाओं पर प्रदर्शन morphometric विश्लेषण का उदाहरण (एक पिछले अध्ययन23से अनुकूलित) । CA2 हवामहल कोशिकाओं की सोमा से दूरी के खिलाफ वृक्ष शाखाओं की संख्या की साजिश रची गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 : अच्छा (क) और गरीब (ख) एचआरपी धुंधला के उदाहरण । (क) Biocytin वसूली CA2 में एक बहुत अच्छी तरह से भरा हुआ न्यूरॉन का पता चला. कोशिका शरीर (सीबी) अंधेरे से सना हुआ है और स्पष्ट रूपरेखा है । dendrites मनके और कुछ spins (लाल सितारों द्वारा प्रतिनिधित्व) प्रदर्शित कर रहे हैं । axonal आर्बर (क) घना होता है और छोटे बूटोंस को प्रस्तुत करता है । (ख) एक गरीब वृक्ष और CA2 में 2 पिरामिडीय कोशिकाओं के दाग axonal का उदाहरण । सीबी के धुंधला कोई स्पष्ट रूपरेखा के साथ बेहोश है । गरीब धुंधला अक्सर छोटे electrophysiological बहुत कुछ biocytin भर शाखाओं की उपस्थिति में जिसके परिणामस्वरूप रिकॉर्डिंग के साथ जुड़ा हुआ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

वीडियो 1: प्रतिबंधित वृक्ष आर्बर के साथ एक CA2 टोकरी सेल के 3 डी ंयूरॉन पुनर्निर्माण (भी CA2 संकीर्ण आर्बर टोकरी सेल के रूप में संदर्भित) अपनी परत pyramidale में सोमा के साथ, dendrites axon परत CA2 और आसंन परत pyramidale में फैले सभी परतों और oriens और radiatum । बहुत कुछ शाखाओं के समीपस्थ CA3 परत oriens और CA3 परत pyramidale तक पहुँचे. इस सेल biocytin निंनलिखित electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ भरा गया था और वर्गों avidin-एचआरपी के साथ यहां वर्णित प्रोटोकॉल निंनलिखित के साथ कार्रवाई की गई । टुकड़ा करने की क्रिया के कारण, केवल टुकड़ा की गहराई के भीतर axon बरामद किया गया था, हालांकि dendrites बरकरार हैं । Dendrites सफेद में गहरे गुलाबी और axon में हैं । परत और क्षेत्र सीमाएं वीडियो की शुरुआत में जोड़ दिया गया है । 3 डी जॉर्जिया Economides द्वारा पुनर्निर्माण-3d वीडियो Svenja Falk द्वारा । वीडियो एक ंयूरॉन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के साथ दर्ज की गई के रूप में २.१७ कदम में कहा गया है और एक वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर के साथ संपादित । वीडियो के लिए लिंक:30। इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

उपयोग किए गए समाधान संरचना निर्देश/
निर्धारण समाधान 4% paraformaldehyde, ०.२% संतृप्त picric एसिड समाधान, ०.०२५% glutaraldehyde समाधान में ०.१ एम फॉस्फेट बफर (पंजाब)
0.1 m फॉस्फेट बफर पीएच ७.६ १०० मिलीलीटर स्टॉक 1 एम फॉस्फेट बफर के लिए ९०० मिलीलीटर से आसुत जल जोड़ें
फास्फेट खारा (पंजाब) पीएच 7.4/ 0.1 m फॉस्फेट बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें, KCl के ०.२ ग्राम और NaCl के ८.७६ ग्राम आसुत जल के ९९० मिलीलीटर
TRIS बफर नं० ७.५ आसुत जल के ५० मिलीलीटर में Tris बेस के Tris हाइडरोक्लॉराइड और १.६६ ग्राम के ५.७२ जी भंग । फिर आसुत जल के साथ 1 एल करने के लिए बनाते हैं ।
बफ़र्ड glutaraldehyde और paraformaldehyde निर्धारण समाधान 4% paraformaldehyde, ०.२% संतृप्त picric एसिड समाधान, ०.१ मीटर फॉस्फेट बफर में ०.०२५% glutaraldehyde समाधान.
एबीसी समाधान समाधान एबीसी किट से उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट बनाया जा करने के लिए । समाधान की 1 ड्रॉप जोड़ें A और समाधान B की 1 ड्रॉप को पंजाब के २.५ मिलीलीटर ।
Durcupan epoxy राल: 20 बर्तन बनाने के लिए: घटक A के 20 ग्राम, घटक B के 20 g, घटक C के ०.६ g और घटक D के ०.४ g-
फिल्टर कागज के एक सर्कल के साथ प्लेट को कवर करके फैल से संतुलन को सुरक्षित रखें । ध्यान से एक tripour चोंच में एजेंट के ऊपर कहा अनुपात में वजन । अच्छी तरह से जोरदार सरगर्मी से दो लकड़ी की छड़ें का उपयोग कर मिश्रण से कम 5 मिनट के लिए । मिश्रण एक समान घनत्व गहरे भूरे रंग का हो जाना चाहिए । के रूप में संभव के रूप में कई हवा बुलबुले को दूर करने के लिए 10 मिनट की एक अधिकतम के लिए ~ ५० ° c पर ओवन में चोंच प्लेस । नोट: राल के लिए इलाज शुरू अगर तुम ओवन में चोंच छोड़ 10 मिनट से अधिक है । प्लास्टिक के बर्तनों या 5 मिलीलीटर सीरिंज में राल बाहर नहीं कर सकते, उन्हें तारीख और दुकान में-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर उपयोग के लिए तैयार है ।

तालिका 1: समाधानों की तालिका । 

Discussion

इन विट्रो में Electrophysiological रिकॉर्डिंग (चित्रा 1 एसी,डी और ई. पू., डी) histochemical और immunohistochemical प्रक्रियाओं के साथ संयुक्त विस्तृत आकृति विज्ञान, कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन सामग्री सक्षम और पता चला कि दर्ज वयस्क cortical न्यूरॉन्स की पहचान. CA2 क्षेत्र में, इस तकनीक को पहली बार के लिए स्थानीय सर्किट के अध्ययन की अनुमति दी और न्यूरॉन्स कि पहले CA1 या CA3 में वर्णित नहीं किया गया था उपवर्गों का पता चला: वाइड वृक्ष और axonal आर्बर टोकरी कोशिकाओं (आंकड़ा 1b), bistratified कोशिकाओं और एसपी-एसआर न्यूरॉन्स ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को न्यूरॉन्स के ultrastructure की रक्षा और दोनों वृक्ष (spins सहित) और axonal arbors की उत्कृष्ट वसूली प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है । महत्वपूर्ण कदम के लिए दोहरे निर्धारण तकनीक का उपयोग शामिल प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए कंट्रास्ट बढ़ाने के लिए26 और glutaraldehyde और picric एसिड समाधान के अलावा निर्धारण समाधान के लिए एंटीबॉडी पैठ बढ़ाने के लिए और ंयूरॉंस की रक्षा ultrastructure27. कोमल फ्रीज-गल permeabilization ठीक संरचना के बेहतर संरक्षण देता है, जबकि osmication और राल एंबेडिंग कम z-विमान सिकुड़ते28। इसके अलावा, बहुत ठीक संरचनाओं के दृश्य (उदाहरण के लिए छोटे बूटोंस के साथ ठीक axons) एच2हे2 और नभ4 के साथ वर्गों की पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के द्वारा सुधार हुआ है । इसके विपरीत भी एचआरपी प्रतिक्रिया करने के लिए NiCl2 के अलावा के साथ बढ़ाया जा सकता है ।

ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रिया यहां विस्तृत reproducibility और विश्वसनीयता के मामले में उत्कृष्ट परिणाम प्रदान करता है । हालांकि, electrophysiological रिकॉर्डिंग की अवधि आमतौर पर गरीब axonal धुंधला के साथ जुड़े छोटे रिकॉर्डिंग के साथ, biocytin/प्रतिदीप्ति धुंधला की गुणवत्ता का निर्धारण करेगा । रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल का चुनाव (intracellular रिकॉर्डिंग तेज इलेक्ट्रोड बनाम पूरे सेल पैच clamping का उपयोग कर) भी biocytin प्रतिधारण और ठीक शरीर रचना के संरक्षण को प्रभावित कर सकते हैं ।

जबकि ऊतकवैज्ञानिक प्रसंस्करण के दौरान ठीक संरचना के संरक्षण में कठिनाइयों का सामना करना पड़ा यहां वर्णित है और समय 100X आवर्धन पर पुनर्निर्माण के लिए लिया (1-axon की जटिलता के आधार पर 4weeks) की सराहना कर रहे हैं, इस विधि देता है एक वृक्ष और axonal व्यास का सटीक प्रतिनिधित्व । कम मांग प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए प्रकट biocytin-लेबलिंग समझ में आता है, तथापि, इन अक्सर ठीक axonal शाखाओं के बाधा स्पष्ट दृश्य । डिटर्जेंट, Avidin के प्रवेश को बढ़ावा देने के लिए-एचआरपी biocytin और एंटीबॉडी प्रकट करने के लिए, अक्सर मोटी वर्गों में आवश्यक हैं, लेकिन ठीक संरचना को बाधित कर सकते हैं । पुनर्निर्माण के semiautomatic तरीकों के लिए लगातार Neuroscientists खोज, लेकिन, अभी के लिए और axons के लिए विशेष रूप से, biocytin-एचआरपी मैनुअल पुनर्निर्माण के साथ सोने के मानक31रहता है ।

अत्यधिक विस्तृत ंयूरॉन पुनर्निर्माण, विशेष रूप से सटीक axonal बूटोंस और नोड्स के चित्र, उपस्थिति या myelin की अनुपस्थिति और अधिक आम तौर पर पूरा axonal आर्बर के ड्राइंग, इसके साथ सटीक axon व्यास परिवर्तन के प्रतिनिधित्व के साथ लंबाई, एक अलग प्रकार के ंयूरॉंस की सटीक पहचान के लिए और अधिक जानकारी प्रदान करते हैं । हालांकि कई न्यूरॉन्स बिल्कुल एक विशिष्ट वर्ग में फिट नहीं हो सकता है, ऊपर वर्णित तकनीक ंयूरॉन electrophysiological गुणों पर संबंधित डेटा प्रदान करता है, अल्पकालिक प्लास्टिक कनेक्शन के एक विशिष्ट प्रकार के साथ जुड़े और विस्तृत न्यूरॉन पुनर्निर्माण, तारों आरेख की अनुमति, CA2 क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, विस्तार में अध्ययन किया जाना.

ठीक है, विस्तृत संरचना अक्सर गणना मॉडल में सरलीकृत है । जबकि समझ में, यह जानकारी है कि भविष्य में महत्वपूर्ण साबित हो सकता है की हानि में यह परिणाम है । समानांतर synaptic डेटा के साथ विस्तृत 3 डी पुनर्निर्माण के विश्लेषण के लिए आगे के मानदंडों के अलावा की अनुमति देगा न्यूरॉन्स वर्गीकरण. डेटा सार्वजनिक खजाने में जमा किया जा सकता है और axon व्यास और कार्रवाई संभावित प्रोपेगेशन गणना पर myelination में छिटपुट बदलाव के परिणाम का पता लगाने के लिए मॉडलिंग द्वारा इस्तेमाल किया ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान नोवार्टिस फार्मा (बेसल) और चिकित्सा अनुसंधान परिषद के प्रोफेसर एलेक्स थॉमसन, जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC-BB/G008639/1), शारीरिक सोसायटी, यूरोपीय संघ के लिए संमानित किया से धन प्राप्त हुआ है क्षितिज २०२० विशिष्ट अनुदान समझौते no. ७२०२७० (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA1) के तहत अनुसंधान और नवाचार के लिए फ्रेमवर्क कार्यक्रम और विशिष्ट अनुदान समझौते no. ७८५९०७ (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA2) के अंतर्गत । हम बहुत अंय cortical क्षेत्रों में प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए प्रो एलेक्स थॉमसन के लिए आभारी हैं, धन की सुरक्षा और इस परियोजना के लिए उसे निरंतर समर्थन के लिए । प्रयोगशाला द्वारा किए गए योगदान-सदस्यों को जो वसूली प्रोटोकॉल और पुनर्निर्माण CA2 ंयूरॉंस में मदद की है आभार स्वीकार कर रहे हैं: जे Deuchars, एच Pawelzik, डी. आई. ह्यूजेस, ए. पी. Bannister, के. Eastlake, एच. Trigg, एन. ए. Botcher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL  Vector laboratories A2008
Biocytin  ≥98% (TLC) Sigma B4261
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL Sigma D4293
Durcupan epoxy resin A Sigma 44611
Durcupan epoxy resin B Sigma 44612
Durcupan epoxy resin C Sigma 44613
Durcupan epoxy resin D Sigma 44614
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% Sigma 32221
Gelatin Sigma 48723
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O Sigma G5882
Glycerol, ≥99%  Sigma G5516
Goat serum Sigma G9023
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL Sigma F2653
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL Invitrogen T2767
Hydrogen peroxide, 30% solution Sigma H-1009
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) Sigma I0890
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) Sigma  N5756
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O  Sigma 75632
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline  Sigma P6148
Picric acid, moistened with water, ≥98% Sigma 197378
Phosphate buffer 1 M Sigma P3619
Propylene oxide (C3H6O), 99% Alfa Aesar  30765
Sodium tetrahydroborate VWR 27885.134
Sucrose Fisher scientific S/8600/53
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% Sigma T5941
Trizma base, ≥99.9% Sigma T6066
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45  Vector laboratories H-1000
Vectastain Elite ABC HRP kit Vector laboratories PK6100
Equipment used 
Vibratome Agar Scientific
C4A Cupped aluminium planchettes  GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Leica DMR microscope  Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  fluorescence light source  Excelitas Technologies 
Leica DFC450 digital microscope camera  Leica Microsystems 
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm  London graphics centre
0.18 mm rapidograph nib London graphics centre
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm  London graphics centre
0.25 mm rapidograph nib London graphics centre
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control Microbrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida software version 2017 Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW graphics Suite X5 Corel
Video editing software  Adobe Premiere Pro
Glass vials 14 mL Fisher scientific 

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References

  1. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
  4. Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
  5. Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
  6. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  7. Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
  8. Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
  9. Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
  10. Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
  11. Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
  12. Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
  13. Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
  14. Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
  15. Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621 (2017).
  16. Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
  17. Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17 (2016).
  18. Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
  19. Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
  20. Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
  21. West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
  22. Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
  23. Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
  24. Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
  25. Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
  26. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
  27. Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
  28. Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
  29. Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104 (2014).
  30. Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83 (2017).
  31. Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65 (2014).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४१ Immunohistochemistry इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल एचआरपी प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स पुनर्निर्माण Neurolucida कैमरा ल्युसिडा न्यूरॉन्स एनाटॉमी dendrites axon
Biocytin वसूली और भरा हिप्पोकैम्पस CA2 न्यूरॉन्स के 3 डी पुनर्निर्माण
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Economides, G., Falk, S., Mercer, A. … More

Economides, G., Falk, S., Mercer, A. Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons. J. Vis. Exp. (141), e58592, doi:10.3791/58592 (2018).

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