Summary
Protokollen skissert her beskriver immunofluorescence analyse, biocytin utvinning og høy kvalitet rekonstruksjoner av hippocampus CA2 interneurons etter intracellulær elektrofysiologiske opptak i vitro, slik neuronal karakterisering og til slutt fine neuronal anatomi studier.
Abstract
Hvordan kortikale nettverksaktivitet behandler er informasjon viktig for et stort antall grunnleggende og klinisk faglige spørsmål. Protokollen beskrevet her identifiserer de grunnleggende byggesteinene av denne kretsene. De grundige studiene av kortikale områder vil til slutt gi andre forskere krets komponenter nødvendig for en forståelse av hvordan hjernen kjøper, behandles og lagres informasjon og hva som går galt i sykdom, mens den elektrofysiologiske og morfologiske data brukes av beregningsorientert neuroscientists i byggingen av modellen nettverk som utforske informasjonsbehandling. Protokollen skissert her beskriver hvordan biocytin-fylte celler i området CA2 hippocampus gjenopprettes og deretter rekonstruert i 3D. I tillegg beskriver protokollen demonstrasjon av kalsium bindende protein eller peptid innhold i registrert interneurons.
Introduction
Cortex og hippocampus er strukturer av slike kompleksitet at klassifiseringen av neuronal subtyper1,2,3,4, kart over forbindelsen mellom dem5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 og hvordan denne krets støtter kognitive funksjoner12,13,14,15 er fortsatt under intens studier og fortsetter stridsspørsmål. For eksempel forstå detaljene og kompleksiteten av kretsene og koordinere data fra mange forskjellige studier, det er svært nyttig å definere og beskrive komponentene, men det er fortsatt en sak for debatt hvor mange forskjellige klasser av neurons finnes, eller selv om det er mulig å definere alle neurons som tilhører en bestemt klasse. Beregningsorientert verktøy som kan bygge og teste kretser med varierende grad av kompleksitet blir utviklet16,17,18, men sentralt i disse forsøkene er behov for detaljerte studier av cellen og egenskapene for forbindelsen mellom dem. En stor mengde informasjon om den lokale krets av neocortex av voksen rotter har allerede samlet ved hjelp av protokollen beskrevet her10,19,20,21, 22. selv om "koblingsskjemaet" er langt fra fullstendig, noen fjerner mønstre eller regler har kommet. Videre, selv om noen detaljer variere, disse reglene er felles til to pattedyrarter (rat og katten) og over flere neocortical regioner, slik at utviklingen av grunnleggende byggesteinene som trolig vil bli like gjeldende for menneskelig neocortex. Teknikken beskrevet her brukes til å utvide vår forståelse av funksjonelle kart over kortikale krets ved å identifisere presynaptic og postsynaptic neurons involvert i tilkoblinger i regionene som ikke har vært undersøkt i detalj før, bruker en protokoll som gir utmerket vev bevaring og bemerkelsesverdig flekker frisk i voksen hjernevev. Data på den lokale krets i ca 2 og neuronal egenskaper i dette underfeltet er samlet med denne metoden ved å kombinere intracellulær elektrofysiologiske opptak (sammenkoblede opptak med skarpe microelectrodes) med biocytin fyller, immunofluorescence, histologiske prosedyrer og svært detaljerte neuronal rekonstruksjoner, tillater direkte sammenligning med de nærliggende CA regioner23,24,25.
Teknikken er beskrevet i denne artikkelen har blitt utviklet gjennom årene for å få detaljert neuronal anatomi slik at riktig klassifisering av celler og høy kvalitet og nøyaktig rekonstruksjoner av både deres dendrittiske og axonal arbors, kan data som kan være korrelert med elektrofysiologiske data samlet inn fra sammenkoblede innspillinger med skarpe elektroder. Histologiske protokollen er optimalisert for å bevare ultrastructure av neurons og få utmerket utvinning av både dendrittiske (inkludert spines) og axonal arbors. For eksempel gir prinsippet om dobbel fiksering teknikken av først leve i en etappe, den stabiliserende løsning og andre post fikse i osmium tetroxide god kontrast * lys26. En liten mengde glutaraldehyde og pikrinsyre løsning legges til etappe, den stabiliserende løsningen å forbedre antistoff gjennomtrenging og bevare cellenes ultrastructure som foreslått i en tidligere studie27. Permeabilization hjernen sektorene med metoden fryse-Tin kombinert med cryo-beskyttelse med sukrose, snarere enn en tradisjonell vaskemiddel, gir optimal bevaring av vev for detaljert morfologisk analyse av innspilte cellene. I tillegg er visualisering spesielt av veldig fine strukturer forbedret ved å redusere bakgrunnen flekker, med incubations med hydrogenperoksid (H2O2) og natrium borohydride (NaBH4). Legge nikkel-klorid (NiCl2) til pepperrotperoksidase (HRP) øker reaksjon å få et svart pigment reaksjon produkt også kontrasten.
Følgende protokollen beskriver prosedyrene vil avgjøre utmerket vev bevaring og svært detaljerte neuronal 3D rekonstruksjoner intracellulær opptak i vitro. Beskrivelsen av skive preparatet, intracellulær sammenkoblede innspillinger med skarpe elektroder og påfølgende histologiske prosedyrer brukes i vårt laboratorium har vært tidligere rapporterte28. Selv om protokollen gjelder for cellene fylt intracellulært med biocytin i 450-500 μm tykke skiver, kan den samme protokollen brukes etter hele celler innspillinger. Men vil bruk av tynnere skiver resultere i mindre komplett rekonstruksjoner av cellene.
Protocol
Alle prosedyrer brukes i hele denne studien ble utført i henhold til britiske innenriksdepartementet regelverket med hensyn til dyr vitenskapelige prosedyrer Act 1986.
1. fastsettelse av kalsium bindende Protein eller proteininnholdet i Interneurons og Biocytin visualisering følgende elektrofysiologiske opptak og Biocytin fylling
Merk: På slutten av elektrofysiologiske opptakene, skiver som inneholder biocytin-fylte celler er faste over natten før histologiske prosedyrer. Etappe, den stabiliserende løsningen vil bli erstattet med en enkel endring av 0.1 M fosfatbuffer neste morgen, hvis resten av prosedyren utføres på en annen dag, for å hindre skade på vev. Fiksering løsningen (4% paraformaldehyde, 0,2% mettet pikrinsyre løsning, 0.025% glutaraldehyde løsning inne 0.1 M fosfatbuffer (PB)) må gjøres frisk ved opptak for best resultat.
- På slutten av elektrofysiologiske innspillingen, nøye plukke opp stykket som inneholder de innspilte cellene med en pensel og plasserer den i en pott som inneholder kunstig hjerne spinalvæske (ACSF).
Merk: Detaljer av protokollen som brukes for skive forberedelse og intracellulær innspillinger med skarpe elektroder har vært beskrevet tidligere28. - I avtrekksvifte, forsiktig plukke opp hjernen skive med en pensel og rull den på en liten bit av fin kvalitet filter papir. Plasser et stykke fuktet filter papir på stykket og plassere to biter av våt filter papir i en liten plastikk gryte med 5-10 mL etappe, den stabiliserende løsning og lager i kjøleskapet over natten på 4 ° C.
- Forberede en løsning av gelatin i destillert vann. 20 mL destillert vann i et beaker på en kokeplate og varme den til 60 ° C. Legge til gradvis 2.4 g gelatin i vannet, vente til oppløst og la den avkjøles til 35-40 ° C før bruk for å forhindre skade på vev.
- Erstatte etappe, den stabiliserende løsningen med 2 mL 0.1 M PB. Plasser sektoren i en Petriskål og kuttet bort noen overflødig vev med skalpell blad. Plasser trimmet vevet i en Petriskål (diameter 9 cm, høyde på 1.4 cm), slik at det ligger flat uten kaster eller bretter og fjerne overflødig bufferen med en tørr pensel.
- Dekke vevet med varm gelatin løsningen og plassere Petriskål på en frossen blokk avkjøles raskt løsningen.
- Bruke en vinkel-likevekt lampe gir kontrast, se gjennom siden av parabolen og hold stykket flatt med lett press fra en fin pensel til gelatin begynner å sette.
Merk: Gelatin kan være nytt smeltet Hvis vevet ikke ligger flatt. Eventuelle feil på overflaten av gelatin forårsaket av fjerning av pensel som det stivner kan fjernes av smelting overflatelaget forsiktig ved å flytte pære av lampe nær overflaten i noen sekunder. - Flytt parabolen av innstillingen til kjøleskapet og la på 4 ° C i 30-60 minutter.
- I avtrekksvifte, kutte ut en liten blokk (~ 1 x 1 cm) inneholder gelatin-embedded vev av parabolen med en skalpell blad, løft blokken med en liten spatel og forsiktig plassere den i samme men frisk etappe, den stabiliserende løsningen brukes til å fastsette sektorene for minst 30 min på 4 ° C .
- Vask gelatin blokken i 5 mL av 0.1 M PB tre ganger, tørke den med et stykke papir vev og stokk blokken siden opp (dvs.med vevet øverst) på en vibratome chuck bruker superglue.
- Fjern overflødig lim. med filter papir og bruke en skalpell blad for å kutte hjørner av blokken av, forlate en rombefiguren.
- Delen sektoren på 50 µm tykkelse ved hjelp av en vibratome og plassere hver del nøye i et hetteglass med 10% sukrose.
- Forsiktig plukke opp fra ampullen, Legg den flatt i Petriskål lokk. Bruke dissecting mikroskop og en frisk skalpell blad, fjerne gelatin fra rundt delen og returnere delen til ampuller med 2 mL av fersk 10% sukrose
Merk: Det er viktig å fjerne så mye gelatin som mulig å redusere vev krymping under dehydrering trinn (Step 1.37). - Cryo-beskytter delene i 0.1 M PB-baserte sukrose-glyserol løsning ved romtemperatur av rugende dem i 10 min i 10% sukrose løsning, 20 min med 20% sukrose - 6% glyserol løsning, to ganger og til slutt 30 min med 30% sukrose - 12% glyserol løsning to ganger under konstant uro.
- Plass delene flatt på et lite rektangel i tinn folie ved hjelp av en pensel. Fjern overflødig væske fra delene og fold forsiktig i aluminiumsfolie i en pakke.
- Hold pakken nær overflaten av flytende nitrogen uten å berøre overflaten for 30 s og deretter tillate delene å tine helt for ca 30 s. Gjenta fryse-Tin en annen to ganger.
- Fjerne alle deler med en pensel og plassere dem i et hetteglass med 2 mL 0.1 M PB under konstant agitasjon vaske av overflødig sukrose.
- Fjerne PB med en Pasteur pipette og Inkuber avsnittene i 2 mL 1% vandig H2O2 for 30 min. vaske avsnittene i 2 mL av 0.1 M PB 3 x 5 min.
- Fjerne 0.1 M PB med en Pasteur pipette og sammenlegge 1% natrium borohydride (NaBH4) inne 0.1 M PB.
Merk: Ikke cap ampullen, som NaBH4 løsning avgir hydrogengass. - Fjerne natrium borohydride med en Pasteur pipette og vask delene grundig i 2 mL 0.1 M PB 5 x 5 min.
- Erstatt 0.1 M PB med 10% normal geit serum (NGS) i 0.1 M PB i 30 min.
- Fjern geit serum og ruge delene overnatting på 4 ° C i en blanding av monoklonalt og kanin polyklonale antistoffer består i ABC løsning.
Merk: En liste over primære antistoffer i tidligere studier vises i tabell 1 i Botcher et al. (2014) 29. - Inkuber avsnittene for 2t i mørket i en blanding av fluorescently-merkede sekundære antistoffer (Tabell for materiale).
- Montere delene på lysbildene i montering medium og dekk med en dekkglassvæske.
- Ta bilder av fluorescens merking på 40 X forstørrelse (figur 1Bb).
- Etter fluorescens imaging, plassere lysbildet inn i et glass Petriskål inneholder PBS og fjern forsiktig i dekkglassvæske. Deretter vaskes delene av lysbildet bruker forsiktige lyspulser på PBS fra en Pasteur pipette. Plass delene i en ren hetteglass med PBS.
- Utføre avidin-HRP reaksjonen først rugende avsnittene i ABC minst 2 h å forsterke HRP reaksjon produktet.
- Forberede 3,5 diaminobenzidine (DAB) løsningen ved å legge til en tablett 5 mL destillert vann.
- Vask delene med PBS tre ganger på 10 min og deretter med Tris buffer to ganger for 10 min. fjerne Tris bufferen etter siste vask.
- Raskt legge en dråpe 8% NiCl2 løsning til DAB løsningen, Pipetter løsningen ut for å mikse og raskt legge til 1 mL av denne løsningen over delene. Inkuber delene i DAB/NiCl2 løsningen i 15 min.
- Legge til 10 µL av 1% H2O2 DAB løsningen. At reaksjonen vil fortsette i mørket under konstant uro i ca 1 til 2 min og overvåke merking av fylt cellene med dissecting mikroskop.
- Stoppe reaksjonen av fjerner DAB/NiCl2h2O2 løsningen og vask delene med Tris buffer to ganger i 5 minutter.
- I avtrekksvifte, plassere en liten krets av filter papir i en Petriskål og dempe det med 0.1 M PB. Løft delene én om gangen fra glass medisinglass med en pensel, og plassere dem nøye flat på papiret.
- Dekker deler med en annen fuktet sirkel av filter papir og fjerne overflødig bufferen ved å forsiktig trykke silkepapir til overflaten.
- Bruke 8-9 dråper 1% osmium tetroxide i 0.1 M PB til toppen papiret, dekke fatet og beholde i avtrekksvifte for minst 30 min, men ikke mer enn 1 time.
- Åpne Petriskål og løft toppen filter papiret. Løft delene nøye samtidig med en pensel, plassere dem i et hetteglass og skyll i destillert vann to ganger.
- Kast osmium tetroxide avfall riktig. Skyll alle disponibel utstyr og plassere dem i hyller.
- Plassere hver del flatt på et glass lysbilde og dekkglassvæske delene. Overføre lysbildet i en Petriskål, plasserer en tom hetteglass over dekkglassvæske å beholde den på plass og dekk med 50% alkohol. Etter 15 minutter, Fjern lysbildet fra løsning og fjerne delene fra lysbildet. Delene tilbake på lysbildet og deretter plassere lysbildet i 70% alkohol for 15 min. gjenta den samme prosessen med 95% og 100% alkohol-løsning.
- Etter dehydrering trinn, overføre delene til et hetteglass som inneholder 100% alkohol på en shaker i avtrekksvifte. Erstatte alkohol-løsning med propylen oksid (C3H6O) og vask tre ganger i 5 minutter. Etter siste vask, holde ~ 2 mL propylen oksid i ampullen og legge harpiks (1:1 ratio). Sikre at harpiksen er oppløst og holde inndelingene under konstant uro i 30 min.
- Plassere hver del i en aluminium planchette som inneholder epoxy harpiks med en trestav og ruge over natten.
Merk: Ikke la avsnittene i harpiks lenger enn 24 h for å unngå skade delene. - Stedet planchette over en varm plate i ca 10 min. plukke opp hver seksjon med en tre-pinne og plassere dem på en ren lysbilde. Holde retningen på hver del konsistent med dissecting mikroskop. Plass en dekkglassvæske over delene. Plass lysbildet i ovnen i 48 timer på 56 ° C for herding.
2. 3D Neuronal rekonstruksjoner
Merk: Neurolucida programvaren brukes. Instruksjonene nedenfor gjelder bare for et bestemt Neuron rekonstruksjon system (Tabell for materiale). Delene fra kutte sammenlignes før rekonstruksjoner bruker et mikroskop.
- Plassere et lysbilde på scenen og sikre scenen klipp og åpne Nevron rekonstruksjon programvare. Klikk Hent -kategorien og velg levende bilde.
- Måle tykkelsen av hver del med 100 X olje linsen. Noter verdien på z-meter øverst og nederst i hver del og beregne snittykkelsen som forskjellen på de to verdiene.
- Bruk en lav forstørrelse målsetting for å fokusere på hjem inndelingen som inneholder celle kroppen. Deretter bruker en 100 x målsetting, fokusere på celle kroppen og klikk midt merke referansepunktet.
- Velg Seriell delen Managerfra kategorien spor . Velg Opprett ny inndeling (+ ikon) i Føljetong delen Manager -vinduet. Angi antall snitt. Navngi hver inndeling i riktig rekkefølge for Z og angi kuttet tykkelsen målt i trinn 2.2.
- For å spore soma i 3D med 100 X mål, velg kontur fra kategorien spor og velg cellen kroppsfiguren. Bruk joysticken for å flytte fokus til toppen av celle kroppen. Sett poeng ved å klikke rundt omkretsen av delen som er i fokus. Høyreklikk og velg Lukk kontur å fullføre første disposisjonen. Gjenta denne prosessen for ulike z posisjoner til bunnen av celle kroppen er nådd (figur 2).
Merk: Velg 3D visualisere i spor -kategorien for å visualisere celle kroppen i 3D. - For å spore celle kroppen i 2D bruker 100 X målet, velger du celle kroppen menyen Nevron i kategorien spor fokus på midten av celle kroppen. Sett poeng ved å klikke rundt omkretsen av celle kroppen. For å fullføre celle kroppen, høyreklikke og velge Fullfør celle kroppen.
- For å spore den dendrittiske arbor, velger du Dendrite eller Apikale Dendrite Neuron menyen. Først spore et kort, første segment for hver dendrite bruke rullehjulet på musen til å justere diameteren på markøren til diameteren på dendrite. Spor langs hver dendrites bruk joysticken til å flytte over delen og musehjulet justere diameteren på sporing.
- Kontroller justeringen av sporing med live mikroskop bildet og Juster eventuelt spesielt etter flytting bruk joysticken. I kategorien spor , velg Juster sporing, klikk på sporing og klikker på riktig sted.
- Når en node i treet er nådd, høyreklikk og velg Bifurcating Node eller Trifurcating-noden fra det miste-ned menyen.
- Når slutten av en gren er nådd, Velg en avslutning fra rullegardinmenyen i Nevron menyen. Velg riktig slutter, dvs., høy slutt, normalt slutt eller low slutter å lette matchende på tvers av deler.
- Redusere forstørrelsen på mikroskopet når alle dendrites i gjeldende inndeling har blitt sporet, Velg kategorien Joy gratis og flytte til en del som passer rett over eller under delen fullført.
- Finn samsvarende points mellom dendrites i et avsnitt som samsvarer med den fullførte delen, klikker du kategorien flytte og velg matchpoeng. Velg antall poeng for å samsvare (tre eller flere poeng foretrekkes) og trykk OK. Klikk på slutten av en fullført gren og klikker på grenen. Gjenta dette for hver matchball. Gjenta denne prosessen på 100 X forstørrelse å sikre nøyaktig tilsvarende.
- Legge til samsvarende grener i forrige avsnitt direkte ved å høyreklikke på slutten. Velg Legg til slutt når grenen linjer opp med fullført spores gren og spor som beskrevet tidligere.
- Når alle dendrites av hver del har blitt sporet, spore axon ved hjelp av den samme prosessen ved å velge Axon menyen Nevron .
- Gå til delen hjem re-align gjenoppbygging med live mikroskop bildet og velg konturer fra kategorien spor velger en forhåndsdefinert contour/lag grenseregionen/kantlinje og klikk å spore langs en kontur. Velg slutten Åpne kontur. Spor alle ønsket lag og regionen disposisjoner.
- Bruk 3D visualisere i spor -kategorien til å visualisere rekonstruksjoner i 3D.
- Å spille inn videoer av 3D rekonstruksjoner (Video 1), åpne 3D rekonstruksjon og åpne Opprett filmer. Angi et mål og ønsket hastighet. Det anbefales å angi rotasjonen til 270°. Velg Start opptak, rekord for et par sekunder, deretter automatisk rotere. Velg stoppe innspillingen når det kreves. Redigere video med en videoredigeringsprogramvare (Tabell for materiale).
- For å eksportere filer til Tiff- eller JPEG-filer, velger fil | Eksportere | Eksport sporing som. Velg µm/bildepunkt forholdet og velg Tilpass. Velg en bakgrunnsfarge og velg filen. Navnet på filen, Velg Tiff eller JPEG og trykk Lagre. For å eksportere filene til vektor-filer, velger fil | Eksportere | Eksport sporing som vektor filer.
- Bruke en Nevron rekonstruksjon analyseprogramvare for å utføre morphometric analyser.
- Analysere dendrittiske trær og få en dendrogram, åpne filen i Neurolucida Explorer. Velg analysere | Struktur og velg Dendrogram fra rullegardinmenyen (Figur 3).
- For å utføre en omfattende morphometric analyse av de 3D rekonstruksjoner (grenen kompleksitet, grener og somas, areal av), kan du åpne filen i programmet. I kategorien klikker du Merk alle. Velg kategorien analyser . Velg struktur og Gren Strukturanalyse.
3. feilsøking
- Endre kamerainnstillingene. De beste resultatene satt eksponeringstid til mindre enn 100 ms og få og forskyvning så nær 0 som mulig.
- Hvis Nevron rekonstruksjon programvaren ikke viser spores konturene automatisk som en 3D celle kroppen i 3D visualisere i spor -kategorien, velger merke objekter i spor -kategorien, holder du nede Ctrl -tasten på tastaturet og Klikk på alle trukket konturene, høyreklikk og velg deretter Angi celle kroppen på drop-down menyen.
- Å justere z-parameterne for en individuell gren, velge treet (merke objekter i spor -kategorien) og sette rullgardin z-justering av alle poeng via Høyreklikk. Velg endre z posisjon, og deretter velger SKIFT z-verdien og angir ønsket verdi.
- Justere rekonstruksjoner bruker "Gå til" i kategorien ' flytte' når det er nødvendig å flytte en stor avstand over sporing.
- Legge til flere noder når som helst under gjenoppbyggingsprosessen. Velg grenen hvor noden er settes i (Velg objektet i spor -kategorien og klikker på grenen), høyreklikk, og velg Sett inn Node i valgt tre. Klikk på riktig sted på grenen.
- Når rekonstruere en kompleks Neuron, spore samsvarende grener individuelt og senere spleise dem for enklere identifikasjon av greiner. Spore grenene i delen nye individuelt og deretter knytte disse grenene til samsvarende grenene på forrige avsnitt ved svever over avslutningen av avslaget til være skjøtes, høyreklikk og velg skjøte, svever over avslutningen som Det er å være skjøtes til, og klikk.
- Hvis en gren spores under hvilken feil tre, velge treet, høyreklikk og velg endre treetog velge riktig treet.
- Hvis et punkt er plassert, utføre Ctrl + Zeller klikke Angre i spor -menyen for å fjerne det siste punktet. Denne fremgangsmåten fungerer imidlertid ikke hvis styrespaken brukes til å flytte over delen før du forsøker å fjerne et punkt. Poenget kan i dette tilfellet fjernes når grenen er avsluttet. Velg grenen (trykk Objekt og klikker på grenen), holder du pekeren over punktet fjernes, høyreklikker og velger Fjern punkt.
- Hvis du er usikker om to grener er matchet, enten 1) bruke 3D effekter i spor -kategorien til å kontrollere seksjoner om grenene samsvarer z-flyet eller 2) bruke Vis flankert funksjonen i føljetong delen Manager for å vise umiddelbart over og under den gjeldende inndelingen i grått.
- Hvis en del er snudd, gå til verktøy i kategorien spor Velg Juster XY skalering og endre x-aksen til -1. Deretter velger du riktig Z-krymping og endre z til -1. Deretter spor grener som vanlig. Husk å snu disse endringene når du flytter til en inndeling som hadde den opprinnelige orienteringen. Endre den x - og z - aksen vil ikke endre grenen slutter etiketter, så vær forsiktig ved skjøting at riktig avslutninger blir brukt.
- Riktig Z-svinn kan korrigeres, hvis det er en betydelig forskjell mellom delen kuttet tykkelse og montert tykkelsen målt. Velg verktøy, deretter korrigere Z-krympingi kategorien spor , og angi krymping faktoren for z-aksen som et Desimalrepresentasjon av kuttet tykkelsen delt montert tykkelsen.
Representative Results
Nerveceller i hippocampus CA2 var fylt med biocytin etter elektrofysiologiske opptak (tall 1Ac, Ad og 1Bc, Bd). Sektorene ble fast over natten etter opptak og neurochemistry og morfologiske karakterisering av neurons ble avslørt følger protokollen beskrevet her.
Kalsium bindende protein eller proteininnholdet i fylt interneurons ble bestemt av rugende skiver først med primære antistoffer og deretter med fluorescently merket sekundære antistoffer. Avfyring kjennetegner interneurons under opptakene vil diktere valget av primære antistoffer brukes. Avidin-AMCA ble brukt til å visualisere biocytin-fylt interneuron og anti-musen fluorescein isothiocyanate (FITC) og geit anti-kanin Texas rød (TR) ble brukt til å beskrive interneuronal neurochemistry (figur 1Bb).
Etter fluorescens visualisering, var et HRP-protokollen brukes til å oppdage biocytin (figur 1Ab). Fin detaljert anatomi av CA2 interneurons ble deretter trukket i 3D med en Nevron rekonstruksjon programvare (figur 2 og figur 3a). En video av en 3D rekonstruksjon av en kurv celle registrert og fylt i ca 2 vises i Video. Neuronal rekonstruksjoner ble ansett som fullført hvis begge dendrittiske og axonal arbors var begrenset i dybden på 450-500 μm sektoren. Dårlig axonal arbor flekker ble vurdert av tilstedeværelsen av avkortet med åpne avslutninger øverst eller nederst på sektoren eller en flekker som var begrenset til axon første segmentet og svært proksimale grener. Figur 4 representerer eksempler på en god og en dårlig HRP flekker følgende biocytin effekt.
Morphometric analyse av 3D rekonstruksjoner (Figur 3) kan utføres for å demonstrere gren kompleksitet, soma areal og areal og volum av dendrittiske og axonal arbors.
Figur 1 : Neuronal rekonstruksjoner av to typer kurv celler registrert og fylt i hippocampus CA2 regionen og korrelert elektrofysiologiske data innhentet etter intracellulær opptak i vitro. Dette tallet er endret fra tidligere studier23,24. SÅ Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: rekonstruksjon av CA2 kurv cellen med begrenset dendrittiske og axonal arbor bruker en tegning tube (1000 X). Dendrites er i svart, og axon er i rødt. AB: Bilde av biocytin-fylt kurven cellen etter avidin-HRP-protokoll beskrevet her. AC: Representant spor av spenning Svar å hyperpolarizing og depolarizing gjeldende injeksjon av CA2 kurv cellen med begrenset dendrittiske og axonal arbor. Annonse: Eksempel på en ca 2 pyramide begrense arbor kurv celle tilkoblinger spilt inn med skarpe elektroder. Sammensatt eksitatoriske etter synaptic potensial (EPSP)-gjennomsnitt Vis kort tog depresjon tilsynelatende under Svar å tog av tre toppene. (B) Ba: 2D rekonstruksjon av CA2 kurv cellen med bred dendrittiske og axonal arbors bruker en tegning tube (1000 X). Dendrittiske treet kurv cellen (i svart) utvidet radielt gjennom alle lag av CA2 regionen og vannrett i så og SP i ca 2 og CA3. En vannrett dendrite nådde også CA1 regionen. Axon (i rødt) til regionene CA3 og CA1. Bb: Den biocytin-fylt (AMCA flekker) kurv cellen var PV-immunopositive (FITC farging) og CB-immunonegative (Texas-røde flekker). BC: Representant spor av spenning Svar å hyperpolarizing og depolarizing gjeldende injeksjon av CA2 kurv cellen med bred dendrittiske og axonal arbor. BD: Sammensatte EPSP gjennomsnitt Vis kort tog tilrettelegging tydelig under Svar å tog av tre toppene. Eksempler på andre typer interneurons i ca 2 finnes i tidligere studier25,30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : 3D celle kroppen rekonstruksjon. (A) 3D sporing av celle kroppen. Visning av ulike konturene spores på ulike z posisjoner mens fokuserer gjennom celle kroppen. (B) 3D-visning av ulike konturene. (C) 3D-visning av celle kroppen på en annen vinkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Morphometry analyser av 3D neuronal rekonstruksjoner. (A) 3D rekonstruksjon av en ca 2 smale arbor kurv celle. Hver dendrittiske avdeling er representert av en farge (grønn, blå, røde og rosa) og axon er lyseblå. (B) Dendrogram av kurv cellen representerer antall dendrittiske grener og lengden på hvert segment i sfærer konsentrisk med soma og med 100 μm mellomrom i soma. Fargene på dendrogram tilsvarer de av dendrites i A. (C) eksempel på morphometric analyse utført på ca 2 pyramideformet celler (tilpasset fra en tidligere studie23). Antall dendrittiske grener var plottet mot avstanden fra soma CA2 pyramideformet celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Eksempler på gode (A) og dårlige (B) HRP farging. (A) Biocytin utvinning viste en godt fylt interneuron i ca 2. Celle kroppen (CB) er mørkt farget og har klare konturer. Dendrites er beaded og vises noen spines (representert ved røde stjerner). Den axonal arbor (A) er tett og presenterer lite boutons. (B) eksempel på en dårlig dendrittiske og axonal farging av 2 pyramideformet celler i ca 2. Farging av CB er svakt med ingen Fjern disposisjon. Dårlig flekker er ofte forbundet med kortere elektrofysiologiske innspillinger resulterer i nærvær av svært få fylt med biocytin grener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: 3D neuronal rekonstruksjon av CA2 kurv cellen med begrenset dendrittiske arbor (også referert til som CA2 smale arbor kurv celle) med sin soma i stratum pyramidale, dendrites spenner over alle lag og axon CA2 stratum pyramidale og tilstøtende stratum oriens og radiatum. Svært få greiner nådde den proksimale CA3 stratum oriens og CA3 stratum pyramidale. Denne cellen var fylt med biocytin etter elektrofysiologiske opptak og deler ble behandlet med avidin-HRP følger protokollen beskrevet her. På grunn av slicing, ble bare axon i dybden av stykket gjenopprettet, om dendrites er intakt. Dendrites er mørk rosa og axon i hvitt. Lag og regionen grenser er lagt i begynnelsen av videoen. 3D rekonstruksjon av Georgia Economides-3D video av Svenja Falk. Videoen ble spilt inn med en Nevron rekonstruksjon programvare som nevnt i trinn 2,17 og redigert med en programvare for videoredigering. Link til videoen:30. Klikk her for å laste ned denne videoen.
| Løsninger brukes | Sammensetning/instruksjoner |
| Fiksering løsning | 4% paraformaldehyde, 0,2% mettet pikrinsyre løsning, 0.025% glutaraldehyde løsning inne 0.1 M fosfatbuffer (PB) |
| 0.1 M fosfatbuffer pH 7.6 | Legge til 100 mL lager 1 M fosfat Buffer 900 mL destillert vann |
| Fosfat bufret saltvann (PBS) pH 7.4/7.5 | Legge til 10 mL 0.1M fosfatbuffer, 0.2 g av KCl og 8.76 g av NaCl til 990 mL destillert vann |
| TRIS buffer pH 7.5 | Oppløse 5,72 g av Tris Hydrochloride og 1.66 g Tris base i 50 mL destillert vann. Deretter lage opptil 1 L med destillert vann. |
| Bufrede glutaraldehyde og paraformaldehyde etappe, den stabiliserende løsning | 4% paraformaldehyde, 0,2% mettet pikrinsyre løsning, 0.025% glutaraldehyde løsning inne 0.1 M fosfatbuffer. |
| ABC løsning | Løsningen gjøres minst 30 min før bruk i ABC Kit. Legge til 1 dråpe løsning A og 1 dråpe løsning B 2,5 mL PBS. |
| Durcupan epoxy harpiks: | Å gjøre 20 Potter: 20 g komponent A, 20 g komponent B, 0,6 g komponent C og 0,4 g komponent D - |
| Beskytte balansen fra søl av dekker platen med en sirkel av filter papir. Nøye veie reagenser i en tripour kanne i proporsjoner nevnt ovenfor. Bland godt av kraftig røring bruker to tre pinner for minst 5 min. Blandingen skal bli en ensartet tetthet mørk brunfarge. Plass begeret i ovnen på ~ 50 ° C i opptil 10 min å fjerne så mange luftbobler som mulig. Merk: Resinen vil begynne å kurere hvis du lar begeret i ovnen lengre enn 10 min. Decant harpiksen i plast Potter eller 5 mL sprøyter, date dem og lagre i 20 ° C fryseren klar til bruk. |
Tabell 1: Tabell over løsninger.
Discussion
Elektrofysiologiske recordings i vitro (figur 1 Ac,d og F.Kr., d) kombinert med histochemical og immunohistochemical prosedyrer aktiverer detaljert morfologi, kalsium bindende proteininnhold og identiteten til voksen kortikale interneurons registrert å bli avslørt. I regionen CA2, denne teknikken tillatt studiet av den lokale krets for første gang og avslørte underklasser av interneurons som ikke hadde vært tidligere beskrevet i CA1 eller CA3: bred dendrittiske og axonal arbor kurv celler (figur 1B), lagdelte celler og SP-SR interneurons.
Protokollen beskrevet her er optimalisert for å bevare ultrastructure av neurons og få utmerket utvinning av både dendrittiske (inkludert spines) og axonal arbors. Avgjørende skritt inkluderer bruk av dobbel fiksering teknikken å forbedre kontrasten for * lys26 og tillegg av glutaraldehyde og pikrinsyre løsning etappe, den stabiliserende løsningen å forbedre antistoff gjennomtrenging og behold i nevrale Ultrastructure27. Mild fryse-Tin permeabilization gir bedre bevaring av fine struktur, mens osmication og harpiks innebygging redusere z-plane krymping28. I tillegg forbedres visualisering av veldig fine strukturer (fine axons med liten boutons for eksempel) med rugende avsnittene med H2O2 og NaBH4 å redusere bakgrunnen flekker. Kontrasten kan også økes med tillegg av NiCl2 HRP reaksjonen.
Histologiske prosedyren finnesher tilbyr gode resultater reproduserbarhet og pålitelighet. Men bestemmer hele elektrofysiologiske opptakene kvaliteten på biocytin/fluorescens flekker, med kortere innspillinger vanligvis forbundet med dårlig axonal flekker. Valg av opptak protokoller (intracellulær opptak med skarpe elektroder vs hele celle oppdateringen clamping) kan også påvirke biocytin oppbevaring og bevaring av fine anatomi.
Mens vanskelighetene oppstått i bevare fine struktur under histologiske behandling beskrevet her og tiden det tar å rekonstruere på 100 X forstørrelse (1-4weeks avhengig av kompleksiteten av axon) er verdsatt, denne metoden gir et nøyaktig gjengivelse av dendrittiske og axonal diameter. Bruk av mindre krevende protokoller å avdekke biocytin-merking er forståelig, men dette utelukke ofte tydelig visualisering av fine axonal grener. Vaskemidler, å fremme oppføring av Avidin-HRP å avsløre biocytin og antistoffer, er ofte nødvendig i tykke snitt, men kan forstyrre fine struktur. Nevrologer søk stadig for halvautomatisk metoder for gjenoppbygging, men for forblir nå og for axons spesielt biocytin-HRP med manuell rekonstruksjon gullstandarden31.
Svært detaljert neuronal rekonstruksjoner, spesielt nøyaktige tegninger av axonal boutons og noder, tilstedeværelse eller fravær av myelin og mer generelt tegning av komplett axonal arbor, med representasjon av nøyaktig axon diameter endrer langs sin lengde, gir ytterligere informasjon for nøyaktig identifikasjon av en distinkt type interneurone. Selv om mange interneurons ikke kanskje passer nøyaktig til en bestemt klasse, inneholder teknikken beskrevet ovenfor samsvarende data neuronal elektrofysiologiske egenskaper, kortsiktige plastisitet forbundet med en bestemt type tilkobling og detaljert neuronal rekonstruksjoner, tillater koblingsskjemaet, i ca 2-regionen, for eksempel å bli studert i detalj.
Fine, detaljert struktur er ofte forenklet i beregningsorientert modeller. Mens forståelig, resulterer dette i tap av informasjon som kan være viktige i fremtiden. Analyse av detaljert 3D rekonstruksjoner med parallell synaptic data vil tillate tillegg av flere kriterier for interneuronal klassifisering. Data kan deponeres i offentlige repositories og brukes av modellerere for å utforske utfallet av sporadiske endringer i axon diameter og myelination på handlingen potensial forplantning beregningsmessig.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen har mottatt finansiering fra Medisinsk Forskningsråd til Prof Alex Thomson, bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), fysiologiske samfunnet, EUs og Novartis Pharma (Basel) Horizon 2020 rammeprogram for forskning og innovasjon under feltet bestemt Grant avtalen. 720270 (menneskelige hjerne prosjektet SGA1) og under feltet bestemt Grant avtalen. 785907 (menneskelige hjerne prosjektet SGA2). Vi er svært takknemlig til Prof Alex Thomson konfigurere protokollen i andre kortikale områder, sikre finansiering og hennes kontinuerlig støtte for dette prosjektet. Bidrag fra lab-medlemmer som bidro til å optimalisere utvinningen protokollen og rekonstruert CA2 neurones er takknemlig anerkjent: J. Deuchars H. Pawelzik D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
| Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
| 3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
| Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
| Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
| Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
| Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
| Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
| Gelatin | Sigma | 48723 | |
| Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
| Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
| Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
| Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
| Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
| Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
| Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
| Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
| Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
| Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
| Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
| Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
| Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
| Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
| Equipment used | |||
| Vibratome | Agar Scientific | ||
| C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
| Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
| X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
| Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
| 0.18 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
| 0.25 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
| Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
| Glass vials 14 mL | Fisher scientific |
References
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
- Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
- Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
- Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
- Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
- Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
- Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
- Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
- Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621 (2017).
- Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
- Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17 (2016).
- Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
- Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
- Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
- West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
- Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
- Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
- Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
- Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
- Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
- Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
- Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104 (2014).
- Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83 (2017).
- Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65 (2014).
